Summary
여기에서 우리는 창자 호밍 조절 T 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA) 드 노보의 고농도를 국부적으로 생산하도록 설계되었습니다.
Abstract
염증성 장 질환 (IBD) 위장관에서 염증성 만성 질환 (GUT). 미국에서는, 대략 1.4 백만 IBD 환자가 있습니다. 창자 박테리아에 dysregulated 면역 반응이 질병을 시작하고 점막 상피 장벽을 중단한다는 것은 일반적으로 받아들여집니다. 우리는 최근에 창자 homing 규제 T (Treg) 세포가 IBD를 위한 유망한 치료이다는 것을 보여줍니다. 따라서, 이 문서는 내장-호밍 트레그 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 두 분자 데 노보, 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA)의 국소 고농도를 생산하도록 설계되었습니다. 우리는 1,25(OH)2D가 조절 분자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 이전 연구 결과에 기초하여 1,25(OH)2D 및 RA를 선택하였다(예를 들어, 포크헤드 박스 P3 및 인터류키틴-10)와 RA가 T 세포에서 장-호밍 수용체의 발현을 자극할 수 있다. 이러한 엔지니어링 수지상 세포를 생성하기 위해, 우리는 두 개의 유전자를 과발현하기 위해 수지상 세포를 트랜스듀싱하는 렌티 바이러스 벡터를 사용합니다. 한 유전자는 1,25(OH)2D의 합성을 생리적으로 촉매하는 25-하이드록시비타민 D 1α-하이드록실라아제를 암호화하는 시토크롬 P450 패밀리 27서브패밀리 B부재 1종이다. 다른 유전자는 생리학적으로 RA의 합성을 촉매하는 망막알데히드 탈수소효소 2를 암호화하는 알데히드 탈수소효소 1가족 구성원 A2이다. 이 프로토콜은 생체 내에서 장-호밍 트레그 세포의 향후 조사에 사용될 수 있다.
Introduction
염증성 장 질환 (IBD) 위장관에서 염증성 만성 질환 (GUT). 미국에서는, 대략 1.4 백만 IBD 환자가 있습니다. 장내 세균에 대한 이질관계가 있는 면역 반응이 질병을 개시하고 점막 상피 장벽을 방해하는 것이 일반적으로 받아들여진다1,2. 이러한 이유로, 현재 사용할 수 있는 미국 식품 의약국 (FDA) 승인 약물 염증 중재자의 기능을 억제 하거나 창 자에 면역 세포의 homing차단. 그러나, 표적으로 하는 선동적인 매개체 및 면역 세포는 또한 면역 방어를 위해 필요합니다. 그 결과, 염증성 중개제 억제제는 전신 면역 방어를 손상시키고 면역 세포 호밍 차단제는 장 내 면역 방어를 약화시키고, 둘 다 심각한 결과를 초래할 수 있다3,4. 또한, 면역 세포 호밍 차단제는 또한 장내로 규제 T (Treg) 세포의 호밍을 차단할 수 있으며, 따라서 IBD 환자에서 이미 손상된 장 면역 내성을 악화시킬 수 있습니다. 더욱이, 창자에 있는 Treg 세포의 차단은 또한 혈액에 있는 Treg 세포의 축적 때문에 전신 면역 억제로 이끌어 낼 수 있습니다5. 마지막으로, 억제제와 차단제는 일시적으로 기능하므로 빈번한 투여가 필요합니다. 이러한 억제제 및 차단제의 빈번한 투여는 불리한 부작용을 더욱 악화시킬 수 있다.
최근, 우리는 잠재적으로 완화 하거나 IBD 치료에 대 한 현재 약물과 관련 된 부작용을 제거 할 수 있는 새로운 전략을 제안6. 이 전략은 말초 림프 조직에 있는 창자 homing Treg 세포의 유도를증강합니다 6. 이 전략의 근거는 창 자-homing Treg 세포 특히 창 자에 가정 하 고 따라서 전신 면역 방어를 손상 하지 않습니다. 또한, Treg 세포는 잠재적으로메모리를형성할 수 있기 때문에7,8,창자-호밍 트레그 세포는 잠재적으로 IBD 환자에서 만성 장 염증의 안정적인 제어를 제공할 수 있으며, 따라서, 치료는 자주 투여될 필요가 없다. 더욱이, 이 전략은 생체 내에서 장-호밍 트레그 세포의 유도를 증가시키기 때문에, 시험관내 생성 된 Treg 세포의 채택 전이와 관련된 고도로 전염하는 환경에서 생체 내 불안정성에 대한 우려가 없다9,10. 이와 관련하여, 시험관내 생성 트레그 세포는 자가면역 질환의 치료를 위한 제안된 전략 중하나(11,12, 13및 이식거부14,15)이다. 마지막으로, 이 전략에서 수지상 세포(DC)는 활성 비타민 D(1,25-디하이드록시비타민 D 또는 1,25[OH]2D)및 활성 비타민 A(레티노산 또는 RA)의 두 분자의 국소 고농도를 생산하도록 설계되었습니다. 1,25(OH) 2D는 조절 분자의 발현을 유도할 수 있기 때문에 1,25(OH)2D(예를 들어, 포크헤드 박스 P3[foxp3]] 및 인터류핀-10[IL-10]))(16, 17 및 RA가 T 세포 18에서 장-호밍 수용체의 발현을 자극할 수 있기때문이다.18). 1,25(OH)2D와 RA 모두 DC28,29를견딜 수 있기 때문에, 우리는 엔지니어링된 DC가 생체 내에서 내성 상태로 안정적으로 유지될 것이고, 따라서 생체외 에서 생성된 톨레생성 DC(TolDCs)19,20, 21을우회할 수 있는 이유이다. 이러한 점에서, TolDC는 또한 Treg 세포 기능19,20,21의생체 내 증강을 위한 제안된 전략 중 하나이다. 우리의 추론을 지원하기 위해, 우리는 생체 내 납품시 엔지니어링 된 DC가 말초 림프 조직에서 창자 호밍 Treg 세포의 유도를 증가 시킬 수 있음을 보여주었습니다6.
우리의 제안된 전략의 추가 이점은 1,25 (OH)2D는 또한 IBD 환자를 잠재적으로 유익할 수 있는 그밖 기능이 있다는 것입니다. 이러한 다른 기능은 항균제(22)의 분비를 자극하고 발암을 억제하는 1,25(OH)2D의능력을 포함한다. 감염 및 암은 IBD24,25와자주 연관됩니다.
1,25(OH)2D 및 RA de novo 의 국소 고농도를 생성할 수 있는 DC를 생성하기 위해, 우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 DC를 설계하여 두 개의 유전자를 과발현한다. 한 유전자는 25-하이드록시비타민 D 1α-하이드록실라제(1α-hydroxylase)를 암호화하는 시토크롬 P450 패밀리 27서브패밀리 B부재 1(CYP27B1)으로, 생리적으로 1,25(OH)2D의합성을 촉매한다. 다른 유전자는 생리적으로 RA6의합성을 촉매하는 망사형 탈수소 효소 2 (RALDH2)를 인코딩하는 알데히드 탈수소 효소 1 가족 구성원 A2 (ALDH1a2)이다.
내장-호밍 Treg 세포 유도의 생체 내 확대는 IBD의 처리에 잠재적으로 중요하기 때문에, 다음 프로토콜에서 우리는 1α-하이드록실라제-RALDH2-과발현 DC(DC-CYP-ALDH 세포)의 생성을 위한 절차를 상세히 설명할 것이다. 생체 내에서 창자 호밍 Treg 세포의 향후 조사에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 생체 내 동물 연구 프로토콜은 로마 린다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)뿐만 아니라 미국 육군 의학 연구 및 마테리엘 사령부 (USAMRMC)의 동물 관리 및 사용 검토 사무소 (ACURO)에 의해 검토 및 승인되었습니다. 국방부.
1. 1α-하이드록실라제와 RALDH2(렌티-CYP-ALDH 바이러스)를 모두 발현하는 렌티바이러스의 제조
- 일 0: 이른 아침에, CM-10-D 세포 배양 배지에서 293T 세포의 5 x 105 세포/mL을 준비한다.
- 씨앗 20 mL/접시에 150 mm x 25 mm 배양 접시. 24h에 대한 37°C 및 5%CO2에서 세포를 배양. 컨플루전성은 24시간 후에 ~80-90%에 도달할 것이다.
- 일 1: 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 및 1.5 mM Na2HPO4,pH 7.1)를 확인합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 2 M CaCl2를 만들고 실온에서 보관하십시오.
- 각 150 mm x 25 mm 배양 접시에 대해 멸균 50 mL 배양 튜브에 DNA 침전 혼합물을 준비합니다. 첫째, 2x HBS의 1,620 μL, PMD2G (VSVG), 17.5 μg의 pCMVR8.74 (캡시드), 렌티-CYP-ALDH 플라스미드 27 μg (CYP27B1 및 ALDH1a2를 모두 운반하는 렌티바이러스 벡터)를 추가하십시오. 둘째,H2O를 최종 부피 3,037.5 μL에 추가합니다.
- 마지막으로, 1x HBS 및 125 mM CaCl2의최종 농도에 용액을 혼합하면서 2 M CaCl2 방울의 202.5 μL을 추가합니다. CaCl2는 마지막으로 추가해야 합니다. 가끔 혼합과 함께 20 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 둡니다. 150mm x 25mm 배양 요리의 경우 그에 따라 확장하십시오.
- 3,240 μL의 DNA 침전 혼합물을 293T 세포를 함유하는 150 mm x 25 mm 배양 접시에 떨어뜨린다. DNA 침전 혼합물을 추가하면서 배양 접시를 나란히 부드럽게 돌십시오. 접시를 37°C및 5%CO2에서 24시간 동안 배양합니다.
- 2일차: 칼슘 인산형혈액을 제거하고, 1x PBS로 부드럽게 세척하고, CM-4-D 세포 배양 배지로 세포 배양을 다시 공급합니다. 세포를 37°C및 5%CO2에서 24시간 동안 배양한다.
- 3일: 멸균 저장 병에 장수제를 수확하고 4-8°C에 보관하십시오. 신선한 CM-4-D 세포 배양 배지로 세포 배양을 보충합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 다른 24시간 동안 배양하였다.
- 4일: 멸균 저장 병으로 장신량을 수확합니다. 0.45 μm 필터를 통해 3일째와 4일째부터 초자연자를 걸루다. VSVG 의사 형 바이러스를 집중하려면, 원심 분리튜브로 초나토이를 전송하고 4 °C에서 24 시간 동안 4,780 x g에서 회전.
- 일 5: 펠릿떨어져 supernatants를 부어 (펠릿은 종종 볼 수 있습니다) 몇 분 동안 멸균 생물 안전 캐비닛에 종이 타월에 배출 튜브를 허용.
- 5% 글리세롤을 함유한 멸균 PBS로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 재서스펜션용 부피는 150mm x 25mm 배양 접시당 33.3μl입니다.
- Aliquot 200 μL/튜브및 -80°C에서 보관하십시오. 적정을 위해 50 μL/바이알의 별도 알리쿼트를 만드십시오. 적분은 108-109 변환 장치(TUs)/mL 범위 내에 있어야 합니다.
- 문화 요리에 표백제를 넣고 버립니다.
참고: 이러한 형질감염된 세포는 모든 렌티바이러스 원소가 세포에서 발현되기 때문에 프로토콜에서 가장 큰 안전 성 관심사입니다.
2. 골수 유래 DC의 생성 (BDC)
- 배양 배지6을함유하는 50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브로 4-5 Balb/c 마우스로부터 경혈및 대퇴골을 수확한다.
- 경골 및 대퇴골을 배양 배지를 함유하는 100 mm x 20 mm 배양 접시로 옮김. 해부 가위와 집게를 사용하여 경골과 대퇴골에서 근육과 같은 조직을 제거하십시오.
- 골수 구멍을 노출하는 경골과 대퇴골의 양쪽 끝을 잘라.
- 30 G 바늘에 부착된 10 mL 주사기에 10 mL 배양 배지를 그립니다.
- 조심스럽게 골수 구멍에 바늘을 삽입하고 깨끗한 50mL 멸균 폴리 프로필렌 튜브로 골수를 플러시. 필요한 경우 이 절차를 반복하여 골수가 완전히 제거되었는지 확인하십시오.
- 골수 세포를 원심분리(400 x g)로 펠렛(400 x g)에서2-8°C에서 5분 동안 흡인한다.
- 1x 적혈구 매해 완충액의 5 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 실온에서 세포를 4-5 분 동안 배양하고 가끔 흔들어 보세요.
- 배양 배지의 30 mL를 첨가하여 반응을 멈춥시다.
- 펠렛 세포를 2-8°C에서 2-8°C에서 5분 동안 펠트. CM-10-R 세포 배양 배지의 10 mL에서 세포를 다시 중단시켰다. 필요한 경우, 세포는 이물질을 제거하기 위해 40 μm 세포 여과기를 통과 할 수있다.
- CM-10-R 세포 배양 배지를 사용하여 세포 수를 수행하고 세포를 1 x 10 6 세포/mL로 조정합니다.
- 재조합 뮤린 과립구 /대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF, 최종 농도 = 100 U / mL) 및 뮤린 인터류핀-4 (IL-4, 최종 농도 = 10 U / mL)를 추가합니다.
참고: GM-CSF 및 IL-4의 재고 솔루션은 각각 -80°C에서 100,000 U/mL(1,000x) 및 10,000 U/mL(1,000x)에 저장됩니다. - 세포를 4 mL/well에서 6개의 웰 배양 플레이트에 분배하고 세포를 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 배양한다.
- 부드러운 파이펫팅으로 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
- GM-CSF(100 U/mL) 및 IL-4(10 U/mL)를 포함하는 신선한 CM-10-R 세포 배양 배지를 추가합니다. 다른 48 시간 동안 세포를 배양.
- 렌티-CYP-ALDH 바이러스에 의한 형질전환에 대한 비부착 세포(BMDC)를 수확한다.
3. DC-CYP-ALDH 세포를 생성하는 렌티-CYP-ALDH 바이러스를 가진 DC의 감전
- 6웰 배양 플레이트에서 50 μL의 바이러스와 8 μg/mL 프로타민을 함유하는 CM-10-R 세포 배양 배지의 총 부피에서 1 x 106 DCs/웰을 준비한다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
- 배지를 신선한 CM-10-R 세포 배양 배지로 대체하고 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양하여 다른 24시간 동안 배양하였다. 이 시점에서, 1α-하이드록실라제 및 RALDH2의 효소 활동을 평가할 수 있다(단계 4 참조). 필요한 경우 두 번째 변환에 대해 3.1-3.3 단계를 반복합니다.
- 리포폴리사카라이드(100 ng/mL)를 첨가하고 세포를 24시간 동안 배양합니다.
- 실험을 위해 세포(DC-CYP-ALDH 세포)를 수확합니다.
4. DC-CYP-ALDH 세포에서 과발현 된 1α-하이드록실라제 및 RALDH2의 평가
- DC-CYP-ALDH 세포에서 과발현된 1α-하이드록실라제의 평가
- 종자 1.0 x 106 DC-CYP-ALDH 세포/잘 CM-10-R 세포 배양 배지의 2 mL에서 12개의 웰 배양 플레이트로.
- 25(OH)D를 최종 농도 2.5 μM에 추가합니다. DC-CYP-ALDH 세포를 24시간 동안 배양합니다.
- 상급자를 수확하고 -20 °C에서 저장합니다.
- 시판되는 방사성 면역분석법(RIA)을 이용하여 상피제에서 1,25(OH)2D농도에 대한 분석(물질 표참조).
- 항-CYP27B1 항체를 이용한 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의한 DC-CYP-ALDH 세포에서 1α-하이드록실라종의 발현을 결정한다.
- DC-CYP-ALDH 세포에서 과발현 RALDH2의 평가
참고: 과발현된 RALDH2의 발현 및 활성은 상업적알데히드 탈수소효소(ALDH) 검출 키트를 사용하여 결정된다(재료 표참조).- DC-CYP-ALDH 또는 대조군 세포(분석 버퍼에서 1 x 105 세포/mL)의 시드 1 mL(각각5 mL 튜브(하나는 "대조군"으로 표지되고 다른 하나는 "테스트"로 표시).
- 디에틸아미노벤잘데히드(DEAB) 용액(95% 에탄올1.5mM)을 각각의 제어 튜브에 10 μL을 넣고 즉시 혼합합니다. DEAB는 RALDH2 억제제이다.
- 활성화된 RALDH 형광 기판(300 μM)의 5 μL을 제어 및 테스트 튜브에 넣고 즉시 혼합합니다.
- 튜브를 45 분 동안 배양하십시오.
- 펠렛 세포를 400 x g에서 2-8°C에서 5분 동안 원심분리하여 흡인한다.
- 분석 버퍼의 200 μL에서 세포를 재구성합니다.
- 얼음에 세포를 유지하고 FACS에 의해 분석을 진행합니다.
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Representative Results
DC-CYP-ALDH 세포발은 1α-하이드록실라종의 양을 현저하게 증가하였다. BMDC로부터 생성된 DC-CYP-ALDH 세포가 1α-하이드록실라종의 양을 현저히 증가시키는지 여부를 확인하기 위해, BMDCs는 골수 유래 DC-CYP-ALDH 세포(BMDC-CYP-ALDH 세포)를 생산하기 위해 렌티-CYP-ALDH 바이러스로 트랜스듀싱하였다. 이어서, BMDC-CYP-ALDH 세포를 FACS에 의해 1α-하이드록실라제의 발현을 조사하였다. 우리의 데이터는 BMDC-CYP-ALDH 세포가 부모 BMDCs와 비교했을 때, 1α-하이드록실라제의 향상된 발현을 나타냈다는 것을보여주었다(도 1A). 우리는 또한 BMDC-CYP-ALDH 세포에서 1α-하이드록실라제의 효소 활성을 결정하였다. 이를 위해, CM-10-R 배양 배지의 2 mL에서 1.0 x 106 BMDC-CYP-ALDH 세포를 12개의 웰 배양 플레이트에 첨가하였다. 25(OH)D를 2.5 μM의 최종 농도에서 세포 배양에 첨가하였다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 배양하고, 초월체는 방사성 면역분석(RIA)을 사용하여 1,25(OH)2D의 측정을 위해 수확하였다. 우리의 데이터는 BMDC-CYP 세포 (렌티-CYP-GFP 바이러스로 변환된 BMDCs)와 BMDC-CYP-ALDH 세포의 배양 과 2D농도가 각각 부모 BMDC 및 BMDC-ALDH 세포(BMDC-ALDH)의 농도보다 약 20배 더 높았다는 것을보여주었다(BMDC-ALDH 1).
DC-CYP-ALDH 세포발은 RALDH2의 양을 현저하게 증가하였다. BMDC-CYP-ALDH 세포가 RALDH2의 현저한 증가된 양을 발현하는지 여부를 확인하기 위해, RALDH2 기질은 RALDH2 억제제 디에틸아미노벤잘데히드(DEAB)(DEAB)(15M)의 존재 또는 부재 상태에서 세포 배양내로 첨가되었다. 세포 내부에 유지된 형광생성물은 FACS에 의해 분석되었다. 우리의 데이터는 BMDC-CYP-ALDH 세포의 평균 형광 강도 (MFIs)가 부모 BMDCs의 그것보다 약 6 배 높았다는 것을 보여주었습니다, BMDC-CYP-ALDH 세포가 부모 BMDc와 비교했을 때, 크게 향상된 RALDH2 효소 활성을 발현하였다(그림 2A,B).
DC-CYP-ALDH 세포는 시험관 내에서 foxp3+CCR9+ 창자-호밍 트레그 세포의 유도를 증강시켰다. DC-CYP-ALDH 세포가 시험관 내 장-호밍 트레그 세포의 유도를 증가시킬 수 있었는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 DC2.4 세포(골수 유래 DC 라인26,27,28,29)를렌티-CYP-ALDH 바이러스로 변환하고 DC2.4-CYP-ALDH 세포를 생성하였다. 그 후, 우리는 DC2.4-CYP-ALDH 세포가 시험관 내에서 창자 호밍 트레그 세포의 유도를 증강할 수 있었는지 여부를 결정하였다. 따라서, 순진한CD4+ T 세포를 C57BL/6 마우스로부터 정제하였다. 정제 된 순진한 CD4+ T 세포 5 x 105 세포 / 잘 다음 부모 DC2.4 세포 (1 x 105 세포 / 웰) 또는 DC2.4-CYP-ALDH 세포 (1 x 10)와 공동 배양하였다.5 세포/웰) 24개의 유정 배양 플레이트에서 항 CD3 단일클론 항체(5 μg/mL) 및 재조합 인간 IL-2(50 U/mL)의 존재 시 무혈청 배지에 배양한다. 또한, 다양한 농도에서 25(OH)D 및 레티놀을 배양액에 첨가하였다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서배양하였다. 5일 후, 세포는 foxp3 및 c-c 케모카인 수용체 유형 9(CCR9)의 발현에 대한 FACS에 의해 분석되었다. 우리의 데이터는 기판의 존재에서, DC2.4 세포가 CD4+ T 세포 집단에서 foxp3+CCR9+ 세포의 풍부도를 크게 변화시키지 않았다는 것을 보여주었다(도 3A, B). 대조적으로, DC2.4-CYP-ALDH 세포는CD4+ T 세포 중에서 foxp3+CCR9+ 세포의 풍부성을 크게 향상시켰습니다. 또한, 더 25(OH)D가 첨가될수록,CD4+ T 세포 들 사이에서 foxp3+ CCR9+ 세포의 풍부성을 증가시키는 DC2.4-CYP-ALDH 세포의 능력이 더 크다. 따라서, 우리의 데이터는 DC-CYP-ALDH 세포가 시험관 내에서 창자 호밍 Treg 세포의 유도를 증가시킬 수 있다는 것을 지원합니다.
DC-CYP-ALDH 세포는 foxp3+CCR9+ 생체 내에서 장-호밍 트레그 세포의 유도를 증강시켰다. DC-CYP-ALDH 세포가 생체 내에서 창자 호밍 트레그 세포의 유도를 보강할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 다음 세포 중 하나를 Balb/c 마우스로 투여했습니다: 부모 DC2.4 세포, DC2.4-CYP 세포(렌즈티-CYP-GFP 바이러스로 트랜스듀싱된 DC2.4 세포) 및 DC-2.2.CYP.. 세포 투여 4일 후, 장간막 림프절을 FACS(그림4A)에의해 조사하였다. 우리의 데이터는 대조군과 비교했을 때 DC2.4-CYP-ALDH 세포가 CD3+T 세포 들 사이에서 foxp3+CCR9+ 세포의 풍부도를 현저히 증가시켰다는 것을 보여주었다(도 4B,C). 이러한 결과에 기초하여, 우리는 DC-CYP-ALDH 세포 투여가 말초 림프 조직에서 foxp3+CCR9+ T 세포의 유도를 현저하게 증가시다는 결론을 내린다.
도 1: DC-CYP-ALDH 세포발은 1α-하이드록실라종의 양을 현저하게 증가하였다. (a)BMDC-CYP-ALDH 세포를 FACS에 의해 생성 및 분석하였다. 대표적인 FACS 플롯은 부모BMDC 및 BMDC-CYP-ALDH 세포(살아있는 세포상에서 게이트화)에서 1α-하이드록실라종의 발현을 나타낸다. (B)1α-하이드록실라제 기판(즉, 25(OH)D)을 DC 배양액에 첨가하였다. 24시간 후, 초자연자를 수집하고 1,25(OH)2D 농도를 측정하였다. 데이터는 부모 BMDC, BMDC-CYP 세포, BMDC-ALDH 세포 및 BMDC-CYP-ALDH 세포의 배양에서 1,25(OH)2D의 농도를 보여준다. ** p & 0.01. ANOVA 테스트. n = 4. 이 그림은 Xu등에서적응 6 . 저작권 2019. 미국 면역학자 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: DC-CYP-ALDH 세포발은 RALDH2의 양을 현저하게 증가하였다. (a)BMDC-CYP-ALDH 세포를 프로토콜에 기재한 바와 같이 생성 및 분석하였다. 대표적인 오버레이 FACS 플롯은 RALHD2 억제제 디에틸아미노벤잘데히드(DEAB)의 존재(+DEAB) 또는 부재(-DEAB)에서 BMDCs 및 BMDC-CYP-ALDH 세포에서의 BODIPY 아미노아메타테이트 형광을 보여준다. (B)DEAB가 없는 상태에서 BMDCs 및 BMDC-CYP-ALDH 세포에서 BODIPY 아미노아아세테이트의 평균 형광 강도(MFI)를 의미한다. * p < 0.05; t-테스트; n = 4. 이 그림은 Xu등에서적응 6 . 저작권 2019. 미국 면역학자 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: DC-CYP-ALDH 세포는 시험관 내에서 foxp3+CCR9+ 창자-호밍 트레그 세포의 유도를 증강시켰다. (A)CD4+ 순진한 T 세포를 C57BL/6 마우스 비장으로부터 분리하였다. CD4+ T 세포는 부모DC2.4 세포 또는 DC2.4-CYP-ALDH 세포의 존재 에서 항 CD3 mAb (5 μg/mL)에 의해 배양에서 활성화되었다. 추가적으로, 배양액은 25(OH)D 및 레티놀의 지시된 농도로 첨가되었다. 5일 후, 세포는CD3+CD4+ T 세포 집단에서 foxp3 및 CCR9의 발현에 대해 FACS에 의해 수집 및 분석되었다. 대표적인 FACS 플롯은CD3+ CD4+T 세포 집단에서 foxp3 및 CCR9의 발현을 보여준다. (B)(A)의누적 데이터. * p < 0.05; ANOVA 시험; n = 4. 이 그림은 Xu등에서적응 6 . 저작권 2019. 미국 면역학자 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: DC-CYP-ALDH 세포는 foxp3+CCR9+ 내장-호밍 트레그 세포의 유도를 생체 내에서 증강시켰다. (A)발브/c 마우스인복막(i.p.) 다음 DC 전송(Transfer) 중 하나를 수신하였다: DC 전송 없음(전송 없음), 부모DC2.4 세포, DC2.4-CYP 세포 및 DC2.4-CYP-ALDH 세포. 4일 후, 장간막 림프절(MLN)을 FACS에 의해 분석하였다. (B)대표적인 FACS 플롯은CD3+ T 세포 집단에서 foxp3 및 CCR9의 발현을 보여준다. (C)(B)에서누적 된 데이터는CD3 + T 세포 집단에서 foxp3+CCR9+ 셀의 백분율을 표시합니다. 세포는 모든 분석을 위해CD3+ T 세포에 게이트화되었다. 해당되는 경우, 제시된 데이터는 ±SEM. *p&0.05; ANOVA 시험; n = 4-6. 이 그림은 Xu등에서적응 6 . 저작권 2019. 미국 면역학자 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서 우리는 DC-CYP-ALDH 세포의 사용을 설명, 말초 림프 조직에 창 자-homing Treg 세포의 유도를 증가 대 한. 우리의 데이터는 DC-CYP-ALDH 세포가 상응하는 기질(즉, 25[OH]D 및 레티놀,각각)의 존재 하에서 시험관내 에서 모두 1,25(OH)2D 및 RA의 국소 고농도 드노보를 합성할 수 있음을 보여주었다. 25(OH)D및 레티놀의 충분한 혈중 농도는 결핍이 있는 환자에서 각각 비타민 D와 A 보충제를 통해 쉽게 달성될 수 있기 때문에30,31,우리는 DC-CYP-ALDH 세포가 25(OH)D및 레틴의 정상적인 혈중 농도가 존재할 때 말초 림프조직에서 장-호밍 Treg 세포의 유도를 증대시킬 수 있다고 추론한다. 이러한 추론을 지원하기 위해, 우리의 데이터는 비타민 D와 비타민 A 결핍이없는 정상적인 건강한 동물에서, DC-CYP-ALDH 세포는 규제 분자 (즉, foxp3 및 IL-10)와 창자 호밍 수용체 (즉, CCR9)를 모두 표현하는 Treg 세포의 유도를 증가시키는 것을 보여줍니다. 따라서, 이 기술은 IBD의 처리를 위한 창자-호밍 트레그 세포의 추가 조사에 사용될 수 있다.
이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 높은 적수를 가진 lenti-CYP-ALDH 바이러스의 생산입니다. 바람직한 바이러스 적시자는 108–109 TUs/mL이어야 합니다. 렌티-CYP-ALDH 바이러스의 높은 역가는 DC에서 높은 감전 효율을 위해 필요하다.
이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 DC의 전송 효율입니다. DC-CYP-ALDH 세포는 이 기술에서 시험관 내에서 내재화되지 않기 때문에, DC-CYP-ALDH 세포가 생체 내에서 창자 호밍 Treg 세포의 유도를 효율적으로 증가시킬 수 있도록 환전 율이 90% 이상이어야 합니다. 또한, DC-CYP-ALDH 세포는 생체 내투여(32)전에 FACS에 의해 추가로 정제될 수 있다.
이 프로토콜의 독특한 장점은 DC-CYP-ALDH 세포가 생체 내 투여 전에 시험관 내에서 관용화될 필요가 없다는 것이다. DC-CYP-ALDH 세포는 1,25(OH)2D 및 RA의 결합된 동작의 결과로, 1,25(OH)2D 및 RA 모두 DCs33,34를내용시키는 것으로 나타났기 때문에 생체 내에서 내성 상태로 유지될 것으로 예상된다. 따라서, 우리는 DC-CYP-ALDH 세포가 생체 내 전염증성 환경에서 불안정성 우려를 갖지 않을 것으로 예상한다.
현재, 우리는 단지 DC-CYP-ALDH 세포가 말초 림프 조직 및 내장에서 창자 -homing Treg 세포의 주파수 (수)를 증가시킬 수 있음을 입증했다6. 결과적으로, 창자에 있는 Treg 세포의 백분율이 증가하기 때문에 전체적으로 창자에 있는 규정하는 기능은 강화됩니다. 그림 4는 대조군 치료법과 비교할 때 DC-CYP-ALDH 세포를 가진 복강 내 치료가 장간막 림프절에서 CCR9+foxp3+ Treg 세포의 비율을 현저하게 증가시켰으며, 이는 장간막 림프절의 더 많은 Treg 세포가 장 내 조직으로 구체적으로 집으로 돌아갈 수 있음을 의미합니다. 도 4는 장간막 림프절에서 대부분의 foxp3+ T 세포가 CCR9에 대해 부정적이며 따라서 장-호밍 용량이 없다는 것을 보여줍니다. 그러나 DC-CYP-ALDH 세포가 각 Treg 셀의 규제 기능을 향상시킬 수 있는지 여부(예: foxp3 및/또는 IL-10의 향상된 발현 수준)는 추가 조사가 필요합니다.
여기에 설명된 시약 및 재료는 동물 연구를 위한 것입니다. 그러나, 이 프로토콜은 인간에서 말초 혈액 단핵구로부터 DC가 생성된다는 점을 제외하고는 상응하는 인간 시약 및 물질을 이용하여 인간 연구에 적용가능하다. 이 프로토콜의 궁극적인 목표는 IBD의 처리를 위한 임상 등급 DC-CYP-ALDH 세포의 생성입니다.
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Disclosures
Xiaolei Tang 박사와 데이비드 J. 베이링크 박사는 이 연구와 관련된 출원 중인 특허의 발명가입니다.
Acknowledgments
이 작품은 수상 번호에 따라 동료 검토 의료 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실에 의해 지원되었다. W81XWH-15-1-0240 (XT). 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부의 승인을 받지는 않습니다. 이 작품은 또한 부분적으로 로마 린다 대학에서 의학부의 연구 혁신 보조금에 의해 지원되었다 (681207-2967 [XT와 GG], 681205-2967 [XT], 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
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