Her presenterer vi en protokoll for in vivo styrking av gut-homing regulatoriske T celle induksjon. I denne protokollen, dendrittiske celler er konstruert for å lokalt produsere høye konsentrasjoner av den aktive vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og den aktive vitamin A (retinoic syre eller ra) de Novo.
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sykdom i mage-tarmkanalen (GUT). I USA er det ca 1 400 000 IBD pasienter. Det er allment akseptert at en dysregulated immunrespons på tarmbakterier initierer sykdommen og forstyrrer slimhinnene epitel barriere. Vi har nylig viser at gut-homing regulatoriske T (treg) celler er en lovende terapi for IBD. Følgelig presenterer denne artikkelen en protokoll for in vivo styrking av gut-homing treg celle induksjon. I denne protokollen er dendrittiske celler konstruert for å produsere lokalt høye konsentrasjoner av to molekyler de Novo, aktiv vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og aktiv vitamin A (retinoic syre eller ra). Vi valgte 1, 25 (OH)2D og ra basert på tidligere funn som viser at 1, 25 (Oh)2D kan indusere uttrykk for regulatoriske molekyler (f. eks stallgreip boksen P3 og interleukin-10) og at ra kan stimulere uttrykket av gut-homing reseptorer i T-celler. For å generere slike konstruerte dendrittiske celler, bruker vi en lentiviral vektor for å overfører dendrittiske celler til overekspresjon to gener. Ett gen er cytokrom P450 familien 27 gruppe B-medlem 1 som koder 25-hydroksyvitamin D 1 α-hydroksylase, som fysiologisk katalyserer syntesen av 1, 25 (OH)2D. Det andre genet er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2 som koder retinaldehyde dehydrogenase 2, som fysiologisk katalyserer syntesen av RA. Denne protokollen kan brukes for fremtidig undersøkelse av gut-homing treg celler in vivo.
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sykdom i mage-tarmkanalen (GUT). I USA er det ca 1 400 000 IBD pasienter. Det er allment akseptert at en dysregulated immunrespons til gut bakterier initierer sykdommen og forstyrrer slimhinnene epitel barriere1,2. Av denne grunn, for tiden tilgjengelig US Food and Drug Administration (FDA)-godkjente legemidler hemme funksjonene til inflammatoriske meglere eller blokkere homing av immunceller i tarmen. Men, den inflammatoriske meglere og immunceller som er målrettet er også nødvendig for immunforsvar. Som et resultat, inflammatorisk megler hemmere kompromiss systemisk immunforsvaret og immun cellen homing blokkere svekke gut immune forsvar, som begge kan føre til alvorlige konsekvenser3,4. I tillegg kan immun cellen homing blokkere også blokkere homing av regulatoriske T (treg) celler i tarmen og dermed kan forverre allerede kompromittert gut uimottakelig toleranse i IBD pasienter. Videre blokkering av treg celle Homing inn i tarmen kan også føre til systemisk immun bekjempelse på grunn av akkumulering av treg celler i blodet5. Til slutt, hemmere og blokkere funksjon midlertidig og dermed krever hyppige administrasjoner. Hyppig administrering av disse hemmere og blokkere kan ytterligere forverre uheldige bivirkninger.
Nylig foreslo vi en ny strategi som kan potensielt dempe eller eliminere bivirkningene forbundet med dagens medikamenter for IBD behandling6. Denne strategien forsterker induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev6. Begrunnelsen for denne strategien er at gut-homing treg celler spesielt hjem til tarmen og dermed ikke vil kompromittere systemisk immunforsvar. I tillegg, siden treg celler kan potensielt danne minne7,8, gut-homing treg celler kan potensielt gi en stabil kontroll av kronisk gut betennelse hos IBD pasienter, og dermed bør behandlingen ikke må administreres som ofte. Videre, siden denne strategien forsterker induksjon av gut-homing treg celler in vivo, det har ikke bekymring for in vivo ustabilitet i et svært proinflammatoriske miljø som er forbundet med adoptiv overføring av in vitro generert treg celler9,10. I denne forbindelse, in vitro generert treg celler er en av de foreslåtte strategiene for behandling av autoimmune sykdommer11,12,13 og transplantasjon avvisning14,15. Til slutt, i denne strategien, dendrittiske celler (DCs) er konstruert for å produsere lokalt høye konsentrasjoner av to molekyler de Novo: aktiv vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og aktiv vitamin A (retinoic syre eller ra). Vi valgte 1, 25 (Oh)2d og ra fordi 1, 25 (Oh)2d kan indusere uttrykk for regulatoriske molekyler (f. eks stallgreip boksen P3 [foxp3] og interleukin-10 [Il-10])16,17 og at ra kan stimulere uttrykket av gut-homing reseptorer i T celler18. Fordi både 1, 25 (Oh)2D og ra også kan tolerize DCS28,29, har vi grunn til at de konstruerte DCS vil bli stabilt vedlikeholdt i en tolerogenic status in vivo og dermed omgå in vivo ustabilitet som er knyttet til in vitro-genererte tolerogenic-DCS (TolDCs)19,20,21. I så henseende er TolDCs også en av de foreslåtte strategiene for in vivo styrking av treg celle funksjoner19,20,21. For å støtte vårt resonnement, har vi vist at konstruert DCs, på in vivo levering, kan øke induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev6.
En ekstra fordel med våre foreslåtte strategien er at 1, 25 (OH)2D har også andre funksjoner som kan potensielt nytte IBD pasienter. Disse andre funksjoner inkluderer evnen til 1, 25 (OH)2D for å stimulere utskillelsen av antimikrobielle stoffer22 og å undertrykker kreft23. Infeksjoner og kreft er ofte assosiert med IBD24,25.
For å generere DCs som kan produsere lokalt høye konsentrasjoner av både 1, 25 (OH)2D og ra de Novo, bruker vi en lentiviral vektor for å konstruere DCS til å overekspresjon to gener. Ett gen er cytokrom P450 familien 27 gruppe B-medlem 1 (CYP27B1) som koder 25-hydroksyvitamin D 1 α-hydroksylase (1 α-hydroksylase), som fysiologisk katalyserer syntesen av 1, 25 (OH)2D. Det andre genet er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2 (ALDH1a2) som koder retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2), som fysiologisk katalyserer syntesen av RA6.
Fordi in vivo styrking av gut-homing treg celle induksjon er potensielt viktig i behandlingen av IBD, i følgende protokoll vil vi detalj prosedyrene for generering av 1 α-hydroksylase-RALDH2-overexpressing DCs (DC-CYP-ALDH celler) som kan brukes for fremtidig undersøkelse av gut-homing treg celler in vivo.
I denne artikkelen beskriver vi bruken av DC-CYP-ALDH celler, for augmenting induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev. Våre data har vist at DC-CYP-ALDH celler kan syntetisere lokalt høye konsentrasjoner de Novo av både 1, 25 (OH)2D og ra in vitro i nærvær av tilsvarende underlag (dvs. 25 [oh] D og retinol, henholdsvis). Fordi tilstrekkelig blodkonsentrasjoner av 25 (Oh) D og retinol kan enkelt oppnås gjennom vitamin D og A fyllinger henholdsvis hos pasienter som har mangler<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Office of Assistant Secretary of Defense for Health Affairs gjennom peer anmeldt Medical Research program under Award no. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er de av forfatteren og er ikke nødvendigvis godkjent av Department of Defense. Dette arbeidet ble også delvis støttet av forsknings innovasjon Grants fra Institutt for medisin ved Loma Linda University (681207-2967 [XT og GG], 681205-2967 [XT], og 325491 [DJB]).
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |