Här presenterar vi ett protokoll för in vivo förstoring av Gut-homing reglerande T cell induktion. I detta protokoll är dendritiska celler konstruerade för att lokalt producera höga koncentrationer av den aktiva vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och den aktiva vitamin a (retinoic syra eller ra) de Novo.
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en inflammatorisk kronisk sjukdom i magtarmkanalen (GUT). I USA, det finns cirka 1 400 000 IBD patienter. Det är allmänt accepterat att ett dysreglerat immunsvar mot tarmbakterier initierar sjukdomen och stör slemhinnor epitelial barriären. Vi visar nyligen att Gut-homing reglerande T (Treg) celler är en lovande terapi för IBD. I denna artikel presenteras därför ett protokoll för in vivo-förstärkning av Treg-cellinduktion i tarmen. I detta protokoll är dendritiska celler konstruerade för att producera lokalt höga koncentrationer av två molekyler de Novo, aktiv D-vitamin (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och aktiv vitamin a (retinoic syra eller ra). Vi valde 1,25 (OH)2d och ra baserat på tidigare fynd som visar att 1,25 (OH)2d kan inducera uttrycket av regulatoriska molekyler (t. ex. Forkhead Box P3 och interleukin-10) och att ra kan stimulera uttrycket av Gut-homing-receptorer i T-celler. För att generera sådana konstruerade dendritiska celler, använder vi en lentiviral vektor för att transduce dendritiska celler att överuttrycka två gener. En gen är cytokrom P450-familjen 27 underfamiljen B-medlem 1 som kodar för 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, som fysiologiskt katalyserar syntesen av 1,25 (OH)2D. Den andra genen är aldehydehydrogenas 1 familjemedlem a2 som kodar retinaldehydehydrogenas 2, som fysiologiskt katalyserar syntesen av RA. Detta protokoll kan användas för framtida utredning av Gut-homing Treg celler in vivo.
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en inflammatorisk kronisk sjukdom i magtarmkanalen (GUT). I USA, det finns cirka 1 400 000 IBD patienter. Det är allmänt accepterat att ett dysreglerat immunsvar mot tarmbakterier initierar sjukdomen och stör slemhinnor epitelial barriär1,2. Av denna anledning, för närvarande tillgängliga amerikanska Food and Drug Administration (FDA)-godkända läkemedel hämmar funktionerna av inflammatoriska mediatorer eller blockera homing av immunceller i tarmen. Men de inflammatoriska mediatorer och immunceller som är riktade är också nödvändiga för immunförsvaret. Som ett resultat, den inflammatoriska medlaren inhibitorer kompromiss system immunförsvaret och immunceller homing blockerare försvaga Gut immunförsvaret, som båda kan leda till allvarliga konsekvenser3,4. Dessutom kan immun cells homing blockerare blockerar också homing av reglerande T (Treg) celler i tarmen och därmed kan förvärra redan äventyras Gut immuntolerans hos IBD patienter. Dessutom, blockering av Treg cell homing i tarmen kan också leda till systemisk immunsuppression på grund av ansamling av Treg celler i blodet5. Slutligen, hämmare och blockerare funktion transitivt och, därmed, kräver täta administrationer. Frekvent administrering av dessa hämmare och blockerare kan ytterligare förvärra ogynnsamma biverkningar.
Nyligen föreslog vi en ny strategi som potentiellt kan mildra eller till och med eliminera de biverkningar som förknippas med nuvarande läkemedel för IBD behandling6. Denna strategi förstärker induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader6. Den logiska grunden för denna strategi är att Gut-homing Treg celler specifikt hem till tarmen och därmed kommer inte att äventyra systemiskt immunförsvar. Dessutom, eftersom Treg celler potentiellt kan bilda minne7,8, Gut-homing Treg celler kan potentiellt ge en stabil kontroll av kronisk tarminflammation i IBD patienter och därmed, behandling bör inte behöva administreras så ofta. Dessutom, eftersom denna strategi förstärker induktion av Gut-homing Treg celler in vivo, det har inte oron för in vivo instabilitet i en mycket proinflammatorisk miljö som är associerad med adoptiv överföring av in vitro-genererade Treg celler9,10. I detta avseende, in vitro-genererade Treg celler är en av de föreslagna strategierna för behandling av autoimmuna sjukdomar11,12,13 och transplantatavstötning14,15. Slutligen, i denna strategi, dendritiska celler (DCs) är konstruerade för att producera lokalt höga koncentrationer av två molekyler de Novo: aktiv vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och aktiv vitamin a (retinoic syra eller ra). Vi valde 1,25 (OH)2d och ra eftersom 1,25 (OH)2d kan inducera uttrycket av regulatoriska molekyler (t. ex., forkhead Box P3 [FoxP3] och interleukin-10 [Il-10])16,17 och att ra kan stimulera uttrycket av Gut-homing receptorer i T-celler18. Eftersom både 1,25 (OH)2D och ra kan också tolerize DCS28,29, vi anledning att de konstruerade DCS kommer att stabilt upprätthållas i en tolerogen status in vivo och därmed kringgå in vivo instabilitet oro som är förknippade med in vitro genererade tolerogena DCS (toldcs)19,20,21. I detta avseende är toldcs också en av de föreslagna strategierna för in vivo förstoring av Treg cellfunktioner19,20,21. För att stödja vårt resonemang har vi visat att de konstruerade DCs, på in vivo leverans, kan öka induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader6.
En ytterligare fördel med vår föreslagna strategi är att 1,25 (OH)2D också har andra funktioner som potentiellt kan gynna IBD patienter. Dessa andra funktioner inkluderar möjligheten att 1,25 (OH)2D för att stimulera utsöndringen av antimikrobiella medel22 och för att undertrycka carcinogenes23. Infektioner och cancer är ofta förknippade med IBD24,25.
För att generera DCs som kan producera lokalt höga koncentrationer av både 1,25 (OH)2D och ra de Novo, använder vi en lentiviral vektor för att konstruera DCS att överuttrycka två gener. En gen är cytokrom P450-familjen 27 underfamiljen B-medlem 1 (CYP27B1) som kodar för 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylas (1α-hydroxylase), som fysiologiskt katalyserar syntesen av 1,25 (OH)2d. Den andra genen är aldehydehydrogenas 1 familjemedlem a2 (ALDH1a2) som kodar retinaldehydehydrogenas 2 (RALDH2), som fysiologiskt katalyserar syntesen av RA6.
Eftersom in vivo förstoring av Gut-homing Treg cell induktion är potentiellt viktigt vid behandling av IBD, i följande protokoll kommer vi att specificera de förfaranden för generering av 1α-hydroxylase-RALDH2-överuttryck DCS (DC-CYP-aldh celler) som kan användas för framtida utredning av Gut-homing Treg celler in vivo.
I denna artikel beskriver vi användningen av DC-CYP-ALDH celler, för att öka induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader. Våra data har visat att DC-CYP-ALDH-cellerna kan syntetisera lokalt höga koncentrationer de Novo på både 1,25 (OH)2D och ra in vitro i närvaro av motsvarande substrat (dvs. 25 [Oh] D respektive retinol). Eftersom tillräckliga blodkoncentrationer av 25 (OH) D och retinol lätt kan uppnås genom vitamin D och en kompletteringar respektive hos patienter som har b…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av kontoret för biträdande försvarsministern för hälsofrågor genom peer reviewed medicinsk forskning program under Award No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är de av författaren och inte nödvändigtvis stöds av försvarsdepartementet. Detta arbete stöddes också delvis av forsknings Innovationsbidrag från Institutionen för medicin vid Loma Linda University (681207-2967 [XT och GG], 681205-2967 [XT] och 325491 [DJB]).
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |