Summary
Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.
Abstract
We demonstreren een methode voor de generatie van gecontroleerde, dynamische chemische pulsen-waar gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar wordt op de microschaal- om micro-omgevingen te creëren voor microbiële chemotaxis experimenten. Om chemische pulsen te maken, ontwikkelden we een systeem om aminozuurbronnen bijna onmiddellijk te introduceren door fotolyse van gekooide aminozuren in een polydimethylsiloxane (PDMS) microfluïde kamer met een bacteriële suspensie. We hebben deze methode toegepast op de chemotactische bacterie, Vibrio ordalii, die actief deze dynamische chemische gradiënten kan beklimmen terwijl ze worden gevolgd door videomicroscopie. Aminozuren, biologisch inert ('gekooid') door chemische modificatie met een fotoverwijderbare beschermende groep, zijn gelijkmatig aanwezig in de suspensie, maar niet beschikbaar voor consumptie tot hun plotselinge release, die optreedt op door de gebruiker gedefinieerde punten in tijd en ruimte door middel van een bijna UV-A gerichte LED-balk. Het aantal moleculen dat vrijkomt in de puls kan worden bepaald door een kalibratierelatie tussen blootstellingstijd en ontwetelste fractie, waarbij het absorptiespectrum na fotolyse wordt gekenmerkt door het gebruik van UV-Vis spectroscopie. Een nanoporeus polycarbonaat (PCTE) membraan kan worden geïntegreerd in het microfluïde apparaat om de continue verwijdering door stroom van de ontgaardde verbindingen en de verbruikte media mogelijk te maken. Een sterke, onomkeerbare binding tussen het PCTE membraan en de PDMS microfluidic structuur wordt bereikt door het membraan te coaten met een oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), gevolgd door plasmaactivering van de te binden oppervlakken. Een computergestuurd systeem kan door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten, om hulpbronnenlandschappen te creëren met voorgeschreven ruimtelijke en temporele variabiliteit. In elk chemisch landschap kan de dynamiek van bacteriële beweging op individuele schaal en hun accumulatie op populatieniveau worden verkregen, waardoor de kwantificering van de chemotactische prestaties en de effecten ervan op bacteriële aggregaties in ecologisch relevante omgevingen mogelijk wordt.
Introduction
Microben vertrouwen op chemotaxis, het proces van het detecteren van chemische gradiënten en het wijzigen van de beweeglijkheid in reactie1,om chemische landschappen te navigeren, voedingsbronnen en gastheren te benaderen en schadelijke stoffen te ontsnappen. Deze microschaalprocessen bepalen de macroschaalkinetiek van interacties tussen microben en hun omgeving2,3. Recente ontwikkelingen in microfluidica en microfabricage technologieën, waaronder zachte lithografie4,hebben een revolutie teweeggebracht ons vermogen om gecontroleerde micro-omgevingen te creëren waarin de interacties van microben te bestuderen. In het verleden zijn bijvoorbeeld bacteriële chemotaxi's onderzocht door sterk gecontroleerde, stabiele gradiënten van tussenliggende tot hoge nutriëntenconcentraties te genereren5,6. In natuurlijke omgevingen kunnen chemische gradiënten op microschaal echter van korte duur zijn, verdrijving door moleculaire diffusie en achtergrondomstandigheden zijn vaak sterk verdund7. Om de chemotactische respons van microbiële populaties die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische omgevingen direct te meten, bedachten en beschrijven we hier methoden om microfluïdetechnologie te combineren met fotolyse, waardoor gradiënten nabootsen die wilde bacteriën in de natuur tegenkomen.
Uncaging technologie maakt gebruik van lichtgevoelige sondes die functioneel biomoleculen in een inactieve vorm inkapselen. Doorstraling komt het gekooide molecuul vrij, waardoor een biologisch proces gericht kan worden verstoord8. Als gevolg van de snelle en nauwkeurige controle van cellulaire chemie die de ontwering biedt9, fotolyse van gekooide verbindingen is traditioneel gebruikt door biologen, fysiologen en neurowetenschappers om de activering van genen te bestuderen10, ionkanalen11, en neuronen12. Meer recent hebben wetenschappers gebruik gemaakt van de aanzienlijke voordelen van fotolyse om chemotaxis13te bestuderen , om de flagella switching dynamiek van individuele bacteriële cellen blootgesteld aan een stapsgewijze chemoattractant stimulus14,15te bepalen en om beweeglijkheidspatronen van enkele zaadcellen in driedimensionale (3D) gradiënten te onderzoeken16.
In onze aanpak implementeren we fotolyse van gekooide aminozuren in microfluïdische apparaten om de gedragsreactie van een bacteriële populatie te bestuderen op gecontroleerde chemische pulsen, die bijna onmiddellijk beschikbaar worden via fotorelease. Het gebruik van een doelstelling met een lage vergroting (4x) (NA = 0,13, diepte van de focus ongeveer 40 μm) maakt zowel de waarneming van de aggregatieve respons op populatieniveau van duizenden bacteriën over een groot gezichtsveld (3,2 mm x 3,2 mm) als de meting van beweging op eencellige niveau mogelijk. We presenteren twee toepassingen van deze methode: 1) het vrijkomen van een enkele chemische puls om bacteriële accumulatie−dissipatiedynamiek te bestuderen vanaf uniforme omstandigheden, en 2i) het vrijkomen van meerdere pulsen om de bacteriële accumulatiedynamiek te karakteriseren onder tijdsvariërende, ruimtelijk heterogene chemoattractante omstandigheden. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii die chemotaxis uitvoeren in de richting van het aminozuur glutamaat17, maar de methode is in grote lijnen van toepassing op verschillende combinaties van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis (bijvoorbeeld, opname van voedingsstoffen, blootstelling aan antibiotica, quorumsensing). Deze aanpak belooft te helpen de ecologie en het gedrag van micro-organismen in realistische omgevingen te verduidelijken en de verborgen afwegingen te ontdekken waarmee individuele bacteriën worden geconfronteerd bij het navigeren in kortstondige dynamische gradiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van het microfluïde apparaat voor het single chemical-pulse experiment
- Ontwerp het kanaal met behulp van computer-aided design (CAD) software en print het op een transparantie film om de foto masker(Figuur 1A)te maken.
- Fabriceer de meester door zachte lithografie (onder clean-room omstandigheden).
- Reinig een silicium wafer (4 inch) in snelle opeenvolging met aceton, methanol en isopropanol, dan droog met behulp van stikstof. Bak de wafel 5 min in de oven op 130 °C.
- Plaats de wafer in het midden van een spin-coater en giet SU-8 fotoresist op de wafer. Verhoog de snelheid van de spin-coater tot 500 tpm over 5 s, en houd bij 500 rpm voor 10 s. Ramp tot de uiteindelijke snelheid van meer dan 10 s en handhaven op deze snelheid voor 30 s.
OPMERKING: De exacte waarde van de uiteindelijke snelheid is afhankelijk van de beoogde coatingdikte en de gebruikte SU-8. - Bak na het spincoatingproces de wafer op 65 °C en vervolgens bij 95 °C. Laat de wafer minstens 5 min afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: De baktijd is afhankelijk van de beoogde dikte en het type fotoresist gebruikt. In het algemeen moet de wafer voor elke laag van 100 μm gedurende 5 min bij 65 °C en 45 min bij 95 °C worden gebakken. - Plaats het fotomasker op de wafer om ervoor te zorgen dat alleen het gebied van belang wordt blootgesteld en gepolymeriseerd. Bloot stellen aan UV-licht voor de aanbevolen tijd in de SU-8 handleiding.
LET OP: Hier, met blootstellingsenergie van 200 mJ cm-2 op een golflengte van 350 nm, werd de wafer blootgesteld voor 150 s. - Bak de wafer op 65 °C en 95 °C voor de aanbevolen tijd in de SU-8 handleiding.
OPMERKING: Voor elke laag van 100 μm moet de wafer voor elke laag van 100 μm gedurende 5 min bij 65 °C en 45 min bij 95 °C worden gebakken. - Dompel de wafer onder in een beker gevuld met polymethyl methacrylaat (PMMA) ontwikkelaar om de meester te verkrijgen. Schud het bekerglas voorzichtig om ervoor te zorgen dat de ongepolymeriseerde fotoresist wordt uitgewassen. Bak de master op 200 °C om de SU-8 laag verder te verbinden.
- Bereid een polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel door het combineren van de elastomer met zijn uithardingsmiddel(Tabel met materialen)op een 10:1 verhouding in een beker (hier, 40 mL). Meng krachtig tot de vloeistof homogeen is.
OPMERKING: Het PDMS-mengsel ziet er ondoorzichtig uit omdat er tijdens het mengproces bellen worden gegenereerd.
LET OP: Om te voorkomen dat de huid in contact komt met potentieel gevaarlijke chemische stoffen of biologisch materiaal, draag u altijd een labjas en wegwerpplastic handschoenen gedurende het protocol en volg u specifieke veiligheidsprotocollen volgens het materiaal Veiligheidsgegevensblad (MSDS). - Ontgassen het PDMS mengsel in een vacuümkamer gedurende 45 min bij RT. Om het proces te versnellen, laat u het vacuüm periodiek los om de bellen die zich vormen op de interface te laten barsten.
OPMERKING: Het ontgassingsproces moet binnen 1 uur worden uitgevoerd om te voorkomen dat het PDMS-mengsel begint te genezen. - Verwijder stof van het oppervlak van de meester met een reiniger onder druk, giet het ontgasste PDMS-mengsel op de meester en bak in een oven op 80 °C gedurende 2 uur.
OPMERKING: Als alternatief zou het bakken 's nachts (of voor ten minste 12 uur) bij 60 °C dezelfde geharde PDMS bereiken. - Snijd de PDMS met een mes rond de microstructuren (op een afstand van ongeveer 5 mm) en pel de PDMS voorzichtig van de master.
- Punch gaten te dienen als inlaat en uitlaat van het microkanaal (hier, een inlaat en een uitlaat, zie Figuur 1A). Zorg ervoor dat niets de onderkant van de PDMS raakt waar de functies zich bevinden.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het microkanaal moet worden verzegeld met plakband om ophoping van stof en andere deeltjes tijdens de opslag te voorkomen. - Bind het PDMS-microkanaal op een glazen schuif.
- Maak een glazen glijbaan grondig schoon met zeep, isopropanol en gedeïoniseerd water. Laat het glas drogen of gebruik perslucht om het proces te versnellen.
- Verwijder stofdeeltjes door te deppen met plakband. Bind het PDMS-microkanaal op de schone glazen schuif, onmiddellijk na de behandeling van beide oppervlakken met plasma (met behulp van een coronasysteem of een plasmazuurstofkamer) gedurende 2 min.
- Plaats het microfluïde apparaat om minstens 1 uur op een hete plaat te verwarmen op 80 °C om de chemische binding met het glas te versterken.
2. Fabricage van het 3D-geprinte Millifluidic Device voor het experiment met meerdere pulsen
- Ontwerp de 3D-vorm met behulp van 3D-ontwerpsoftware en print de master voor de PDMS-mal met een 3D-printer met hoge resolutie(figuur 1B).
OPMERKING: Zie Tabel met materialen voor de 3D-printer en matrijsmateriaal dat wordt gebruikt om de master te maken. - Herhaal stap 1.3−1.4 en maak het oppervlak van de master schoon door te deppen met plakband. Zet de meester op een schaal, dan, terwijl het vermijden van de centrale regio van de meester die zal worden bezet door het membraan, giet op de exacte hoeveelheid niet-genezen PDMS mengsel (hier, 23,4 g) om de gewenste hoogte van PDMS te verkrijgen door het afstemmen van de hoogte van de meester (hier, 0,5 mm). Verwijder de resterende bellen met behulp van perslucht.
- Plaats de PDMS-cast op de meester in een oven op 45 °C om minstens 12 uur te bakken.
- Bond de 3D PDMS mal aan een petrischaaltje.
- Pel voorzichtig de geharde PDMS-laag en ponsinlaat- en uitlaatgaten af voor de injectie van de bacteriële suspensie(figuur 1C).
- Activeer zowel het oppervlak van een petrischaal (90 mm x 15 mm) als de PDMS-mal met zuurstofplasma gedurende 2 min. Bond de PDMS-mal op de petrischaal. Druk voorzichtig op de mal naar de petrischaal, maar druk niet op waar de functies zich bevinden, omdat dit de verhoorkamer kan instorten.
- Plaats de petrischaal die aan de PDMS 3D-mal is bevestigd in een oven op 45 °C gedurende ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Membraanoppervlakfunctionalisatie18
- Activeer het nanoporeuze polycarbonaat (PCTE) membraan gedurende 1 min in een zuurstofplasmakamer bij RT.
LET OP: Vermijd het gebruik van een corona systeem voor de plasma activering, omdat het het membraan zal beschadigen. - Onder een chemische kap, verdun een commerciële oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) in gedeïoniseerd water tot 1% in volume (hier, 40 mL), met behulp van een polypropyleen buis.
LET OP: De APTES-oplossing is acuut giftig (MSDS-gezondheidsrisicoscore 3) en moet uitsluitend onder een chemische kap met handschoenen met uiterste zorg worden behandeld. Verander handschoenen onmiddellijk na het hanteren van APTES-oplossing. APTES dampen zijn destructief voor de slijmvliezen en de bovenste luchtwegen. De doelorganen van APTES zijn zenuwen, lever en nieren. Als er geen rookkap beschikbaar is, moeten een gezichtsschild en een full-face respirator worden uitgevoerd. - Breng de verdunde APTES-oplossing over in een petrischaaltje en dompel het geactiveerde membraan gedurende 20 min onder in de APTES-oplossing.
- Verwijder het membraan uit de APTES-oplossing met een pincet en leg het op een cleanroomdoek om te drogen.
- Activeer het nanoporeuze polycarbonaat (PCTE) membraan gedurende 1 min in een zuurstofplasmakamer bij RT.
- Voor de fabricage van de PDMS microfluïde kanalen die op het membraan zullen liggen en het wassen van de bacteriële arena mogelijk maken, herhaalt u stap 1.1−1.7.
- Bind de PDMS waskanalen aan het gefunctionaliseerde membraan.
- Activeer zowel het PDMS waskanaal als het PCTE membraan gedurende 2 min met een zuurstofplasmakamer.
OPMERKING: Het membraan, dat wordt ingeklemd tussen twee PDMS-lagen, moet kleiner zijn dan het PDMS-waskanaal. - Breng onmiddellijk na de plasmabehandeling het gefunctionaliseerde membraan en het PDMS-waskanaal in contact door het PDMS-waskanaal voorzichtig op het membraan te drukken.
OPMERKING: Breng in dit stadium geen overmatige druk uit, omdat het (onomkeerbare) bevestiging van het membraan aan het dak van het kanaal kan veroorzaken, waardoor het kanaal wordt geblokkeerd.
- Activeer zowel het PDMS waskanaal als het PCTE membraan gedurende 2 min met een zuurstofplasmakamer.
- Sandwich het membraan tussen twee PDMS lagen(figuur 1E).
- Activeer zowel het gebonden laminaat PDMS waskanaal−PCTE membraan als de 3D PDMS mal die eerder met een zuurstofplasmakamer gedurende 2 min aan de petrischaal is gebonden. Breng ze 2 min in contact en druk samen.
- Plaats de petrischaal die ten minste 12 uur aan de sandwichstructuur in een oven is gebonden op 45 °C om de chemische binding te versterken.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Celcultuur
- Laat een populatie van V. ordalii (stam 12B09 of 12B09pGFP) 's nachts groeien voor 20 uur in 2216 medium19 op een orbitale shaker (600 rpm) bij 30 °C en oogst cellen in de late exponentiële fase. Voor isolaten die pGFP herbergen, voegt u spectinomycine (50 μg mL-1)toe om de plasmid te behouden.
- Centrifugeer een 1 mL aliquot van cellen bij 2500 x g gedurende 3 min, verwijder de supernatant en breg de cellen opnieuw op in 1 mL gefilterd kunstmatig zeewater. Herhaal deze stap.
- Verhonger de populatie V. ordalii op een orbitale shaker (600 tpm) bij 30 °C gedurende 3 uur.
- Bereid een stock kunstmatige zeewater oplossing van 10 mM (hier, 1 mL) van 4-methoxy-7-nitroindoline-gekooid- L-glutamaat (MNI-gekooid-L-glutamaat) en op te slaan op -20 °C.
OPMERKING: Bescherm de MNI-gekooide- L-glutamaatoplossing tegen omgevingslicht om fotolyse te voorkomen. - Verdun de cellen 50x door de uitgehongerde cellen opnieuw op te schorten in eenkunstmatige zeewateroplossing van 1 mM MNI-gekooid- L-glutamaat.
OPMERKING: Dit zal zorgen voor een laatste bacteriële concentratie lager dan 5 x 107 mL-1 (de exacte waarde is afhankelijk van de initiële concentratie van cellen in de late exponentiële, die meestal ~ 109 mL-1). Bacteriële concentratie werd geschat met behulp van een spectrofotometer bij optische dichtheid (OD) van 600 nm.
4. Kalibratie van het uncagingprotocol
- Plaats een druppel (20 μL) van een kunstmatige zeewateroplossing van MNI-gekooide- L-glutamaat20 bij een concentratie C0 = 10 mM op een glazen glijbaan. Vat de druppel in door deze af te dekken met een cirkelvormige PDMS-kamer (diameter d = 5 mm, hoogte h = 250 μm).
- Plaats de glazen schuif op een microscoopfase en stel de hele kamer voor 20 ms bloot aan een LED-balk met een golflengte van 395 nm (vermogen 295 mW) met behulp van een 4x-doelstelling (numeriek diafragma [NA] = 0,13).
- Open de PDMS-kamer en haal een druppel (1 μL) eruit voor analyse met een UV-Vis spectrofotometer.
- Herhaal stap 4.1−4.3 voor verschillende duur van LED-verlichting van 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (of tot verzadiging van de chemische reactie) en 0 s (om de achtergrond te verkrijgen). Repliceren van de procedure stappen 4.1−4.4 ten minste 3x (hier, 4x).
- Uit het absorptiespectrum, extract van de waarde op 405 nm, die de piek in het absorptiespectrum van de kooi molecuul21vertegenwoordigen. Om de snelheid k van de chemische uncaging reactie door de LED-blootstelling14te bepalen, gebruikt u de volgende eerste-orde kinetiekvergelijking voor de numerieke pasvorm van de experimentele gegevens17
waarbij C(t) is de waarde van het absorptiespectrum van de oplossing op 405 nm (na verwijdering van de achtergrond) met een ontwemuur tijd van t seconden. Voor kleine uncaging tijd t zodanig dat kt 1, Eq. 1 kan worden vereenvoudigd tot de lineaire formulering
5. Single Chemical-pulse Experiment
- Houd het microfluïde kanaal 20 min onder vacuüm om de gasconcentratie in de PDMS te verminderen, zodat er minder kans is op bellen tijdens het vulproces.
- Haal het kanaal uit de vacuümpomp en introduceer onmiddellijk deverdunde bacteriële suspensie in 1 mM MNI-gekooide- L-glutamaat in kunstmatig zeewater voorzichtig met behulp van een micropipetom om flagellarschade door mechanische schuifkrachten te voorkomen (hier duurde het hele vulproces 5-10 s). Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuigen de oplossing in overmaat met papieren handdoek, en verzegelen inlaat en uitlaat met PDMS stekkers door zachtjes te drukken ze in de gaten.
LET OP: Op deze manier wordt de vloeistofstroom in de kamer voorkomen. - Plaats het microkanaal op een microscoopfase en verplaats het podium om het gezichtsveld in het middenkanaal te plaatsen. Stel de microscoop in om beeldvorming in fasecontrast (4x doelstelling) uit te voeren met een framesnelheid van 12 fps.
OPMERKING: Deze waarde kan worden gevarieerd, maar mag niet minder dan 10 fps zijn om de reconstructie van de bacteriële trajecten door middel van beeldanalyse mogelijk te maken (zie protocol sectie 7). - Stel het gaatje van de LED-balk op het minimale diafragma. Door de belichtingstijd van de camera op 5 s in te stellen, neemt u enkele frames op om nauwkeurige metingen te verkrijgen van de ruimtelijke locatie en grootte van de LED-balk.
OPMERKING: De LED-lichtbron maakt verbinding met de epifluorescentie-verlichting van de microscoop via een vloeistoflichtgeleiderverbinding. De LED-balk heeft geen invloed op het vastleggen van video's, omdat video-acquisitie en LED-stimulatie onafhankelijk via software worden bevolen. - Voer continue beeldvorming uit gedurende een totale duur van 10 min (20 min voor de grootste chemische puls) en activeer tegelijkertijd de gerichte LED-balk op 395 nm voor de gewenste duur (in dit experiment, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) op een door de gebruiker gedefinieerd tijdpunt (hier, 10 s na het begin van de video-acquisitie) via microscoopsoftware. Om meerdere replicaties van hetzelfde proces te verkrijgen, verplaatst u het podium om de bacteriële respons over verschillende posities van het microfluïde kanaal vast te leggen. Repliceer deze procedure voor elke pulsgrootte, met behulp van een nieuw microkanaal.
OPMERKING: Het uncagingproces genereert een asymmetrische cilindrische puls die radiaal naar buiten verspreidt in het beeldvormingsvlak. - Voer afzonderlijke experimenten uit zonder chemische ontwenning bij hogere vergroting (20x objectief, NA = 0,45) bij een hogere framerate (50 fps) om de onpartijdige zwembeweging van de bacterie vast te leggen.
6. Meervoudig experiment met chemische puls
- Houd de millifluïde kamer 20 min onder vacuüm.
- Plaats de petrischaal met de millifluïde kamer op een microscoopstadium. Vul de kamer onder het membraan met de verdunde bacteriële suspensie (hier duurde het hele vulproces 10−15 s) gfp-fluorescerende V. ordalii in 1 mM MNI-gekooide- L-glutamaatoplossing in kunstmatig zeewater. Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuigen de oplossing in overmaat met papieren handdoek, en verzegelen inlaat en uitlaat met PDMS stekkers door zachtjes te drukken ze in de gaten.
LET OP: Op deze manier wordt de vloeistofstroom in de kamer voorkomen. Om een betere visualisatie van bacteriën in deze setup mogelijk te maken waar de beeldvorming plaatsvindt via het nanoporeuze membraan, wordt het sterk aanbevolen om fluorescerende stammen te gebruiken in plaats van het wilde type (zoals gebruikt in het enkele chemische pulsexperiment). - Vul een spuit met een kunstmatige zeewateroplossing van 1mM MNI-gekooide- L-glutamaat en bevestig buizen aan de inlaat en uitlaat van het waskanaal boven het membraan.
- Sluit de slang aan op een afvalreservoir en zorg ervoor dat de slang volledig in het vloeistofafvalreservoir wordt ondergedompeld om drukschommelingen te voorkomen.
- Stel de juiste stroomsnelheid in op de spuitpomp (hier, 50 μL min-1)om de gewenste gemiddelde stroomsnelheid in het waskanaal te verkrijgen, die afhankelijk is van de kanaalgeometrie.
- Start de spuitpomp om de stroom in het waskanaal boven het membraan vast te stellen.
- Voer de software uit die de LED-straal en microscoopfase regelt om door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen te genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten.
OPMERKING: De continue stroom van de kunstmatige zeewateroplossing van 1mM MNI-gekooide- L-glutamaat in het waskanaal boven het membraan vult de gekooide samengestelde oplossing aan en wast het verbruikte medium uit de bacteriële arena. - Neem video op met behulp van een 4x-doelstelling op regelmatige tijdsintervallen over een periode van enkele uren en over meerdere aaneengesloten locaties om een groot oppervlak te bedekken (hier, 1 cm x 1 cm, figuur 1F).
7. Beeldanalyse en gegevensanalyse
- Reconstructie van de bacteriële trajecten
- Uit de films opgenomen met de 4x doelstelling, reconstrueren de bacteriële trajecten met behulp van tracking software17.
OPMERKING: Deze trajecten vertegenwoordigen de 2D-projecties van de 3D bacteriële beweging in het microkanaal. - Bepaal vanuit de gereconstrueerde bacteriële trajecten de radiale driftsnelheid van elk zwemmend individu door zijn zwemsnelheid over de richting naar het midden van de chemische puls te projecteren (figuur 2D). Gebruik voor de visualisatie van de spatio-temporele dynamiek van de radiale driftsnelheid een binning-raster met een ruimtelijke grootte van 75 μm x 75 μm en tijdelijk venster van 5−10 s interval(figuur 2D,E).
OPMERKING: Vanwege de cilindrische symmetrie van het proces kunnen gegevens worden geanalyseerd in polaire coördinaten en gemiddeld over de hoekdimensie(figuur 3). - Bepaal vanuit de gereconstrueerde bacteriële trajecten de spatio-temporele dynamiek van de verdeling van bacteriën als ze reageren op de chemische pulsen(figuur 2E).
- Uit de films met een hogere resolutie die tijdens de single-pulse-experimenten met de 20x-doelstelling zijn opgenomen, wordt de verdeling van de zwemsnelheid geëxtraheerd en de looptijd van de bacteriële populatie als ze reageren op de chemische puls (figuur 4).
- Uit de films opgenomen met de 4x doelstelling, reconstrueren de bacteriële trajecten met behulp van tracking software17.
- Schat de diffusiecoëfficiënt van bacteriën door rekening te houden met de dissipatiedynamiek van de bacteriële populatie nadat chemotaxis is voltooid17 (hier, voor t > 300 s; Figuur 3).
- Schat de diffusiecoëfficiënt van glutamaat door de Stokes-Einstein vergelijking toe te passen
waarbij wordt aangenomen dat de aminozuurmoleculen bolvormige deeltjes zijn met een hydrodynamische straal22rG, kB is de Boltzmann-constante (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T is de temperatuur (296 K), en η is de dynamische viscositeit van het kunstmatige zeewater (zoutgehalte 36 g kg-1) bij 23 °C (10-3 Pa s)23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten de microfluïde en millifluïde apparaten(figuur 1)om bacteriële accumulatieprofielen te bestuderen onder dynamische voedingscondities. Bacteriële trajecten werden geëxtraheerd uit opgenomen video's die werden verkregen door fasecontrastmicroscopie van de accumulatie-dissipatiedynamiek van een bacteriële populatie na een chemische puls die werd vrijgegeven door fotolyse (figuur 2 en figuur 3). Door het gemiddeld van miljoenen trajecten, de spatiotemporale dynamiek van de radiale drift snelheid en bacteriële concentratie werden verkregen. Statistieken over het zwemmen bij afwezigheid van een chemische gradiënt werden verkregen in afzonderlijke experimenten met een hogere ruimtelijke en temporele resolutie (figuur 4).
Figuur 1: Microfluïde en millifluïde apparaten voor bacteriële experimenten onder dynamische voedingsomstandigheden. (A) Fotomasker van het microfluïdekanaal dat wordt gebruikt om de bacteriële accumulatie van één chemische puls waar te nemen. (B) Fotomasker van het microfluidics kanaal dat wordt gebruikt om de millifluïde bacteriële kamer te wassen voor de multi puls experimenten. De kleine puntjes zijn micropijlers (200 μm groot) die helpen bij het hechten van het membraan aan de PDMS, en tegelijkertijd helpen voorkomen dat het membraan in het midden knikt of instort. (C) Ontwerp van de 3D-geprinte meester die wordt gebruikt om de bacteriële kamer te creëren. (D) De PDMS-laag met de patronen van de bacteriële kamer. (E) Het volledige millifluidische apparaat (bovenste weergave, PCTE membraan in wit). (F) Schematisch van het millifluïde apparaat voor het genereren van dynamische voedingscondities (zijaanzicht). Optische straal diagram wordt getoond op de bodem van het apparaat, waar een violette straal (395 nm) voert de uncaging van de chemoattractant, terwijl een (onafhankelijke) blauwe balk (470 nm) wordt gebruikt voor de observatie van fluorescerende bacteriën (herbergen pGFP) door middel van een sCMOS camera, die de bacteriële dichtheid (onderste centrum) vangt. Het apparaat wordt geplaatst op een gemotoriseerde fase (rechtsonder), die kan worden verplaatst in de x-y vlak om chemische pulsen vrij te geven op door de gebruiker gedefinieerde posities (gecontroleerd via NIS-software, linksonder). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve bacteriële reacties op een chemische puls. (A,B) Maximale intensiteitprojectie met bacteriële positie (wit) over een interval van 0,5 s, onmiddellijk naen(B)40 s na de pulsrelease (doelstelling: 4x, NA = 0,13, Ph 2; video-opname bij 12 fps). (C) Bacteriële trajecten (zwart) getoond 60 s na de puls release. Het gearceerde gebied vertegenwoordigt de chemische puls die door fotolyse bij t = 0 s in het midden van het gebied van mening (zwarte kruis) wordt vrijgegeven, die later verspreidt. Trajecten werden gereconstrueerd met behulp van aangepaste in-house software. (D,E) Temporele dynamiek van de radiale driftsnelheid(D) en van de bacteriële concentratie(E)na een pulsrelease in het midden van het gezichtsveld. In paneel D komen negatieve waarden van de driftsnelheid (in blauwe kleur) overeen met gerichte chemotactische beweging naar het midden van de puls. Dit cijfer is gewijzigd na Brumley et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Spatio-temporele profielen van de radiale driftsnelheid en bacteriële concentratie na een chemische pulsafgifte. (A,B) De radiale driftsnelheid (A) en de bacteriële concentratie(B)als functie van tijd en afstand tot het midden van een 35 μM glutamaatpuls. In paneel A komen negatieve waarden van de driftsnelheid (in blauwe kleur) overeen met gerichte chemotactische beweging naar het midden van de puls. Waarden werden berekend door gemiddeld over alle trajecten. De zwarte stippellijn op t = 250 s beperkt ruwweg de periode van actieve chemotaxis (blauwe arcering in paneel A, regio I), waarna de cellen isotropisch naar buiten verspreiden (groene schaduw in paneel A, regio II). (C) Bacteriële concentratie (opnieuw opgeschaald over de achtergrond B0) als functie van afstand op t = 10, 30, 60 s na het ontstaan van een verspreidende chemische puls. Bacteriën verzamelen zich dicht bij de plaats van de puls als gevolg van chemotaxis. (D) Bacteriële concentratie duurt ~ 20 min om te ontspannen op de achtergrond B0 door bacteriële diffusie. Het begin toont de pasvorm van de verspreiding van de diffusive met een diffusiecoëfficiënt van DB = 165 μm2 s-1. De panelen A, C en D zijn gewijzigd van Brumley et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Zwemstatistieken voor een bacteriële populatie bij afwezigheid van chemische gradiënten. (A) Trajecten vertegenwoordigen de tweedimensionale projecties van de driedimensionale bacteriële beweging in het microkanaal. Bacteriële trajecten worden geëxtraheerd met behulp van een aangepaste in-house tracking script. Hier geeft het blauwe kruis het begin van het spoor aan en rode en groene symbolen geven heroriëntatiegebeurtenissen aan. De gegevens werden opgenomen op 50 fps met een doelstelling van 20x, NA 0,45. (B) Waarschijnlijkheidsverdeling van de gemeten bacteriële zwemsnelheid (zwart) samen met een gammaverdelingspasvorm (blauw). Omdat de diepte van de focus bij beeldvorming met een 20x doelstelling (NA 0,45) is slechts een paar micron24,de opgenomen trajecten zijn in wezen vlakke en metingen van de zwemsnelheid zijn niet beïnvloed door de projectie. (C) Waarschijnlijkheidsverdeling van de tijd tussen opeenvolgende heroriëntaties. Deze gegevens waren nodig om een individueel gebaseerd model dat rekening houdt met het heroriëntatiepatroon, de verdeling van de zwemsnelheid en de heroriëntatiestatistieken van de organismen effectief te kalibreren. Dit cijfer is gewijzigd van Brumley et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële chemotaxis te bestuderen onder gecontroleerde, dynamische gradiënten in micro- en millifluïdische apparaten, waardoor reproduceerbare gegevens kunnen worden verkregen. De bijna ogenblikkelijke creatie van chemische pulsen op microschaal door fotolyse heeft tot doel de soorten voedingspulsen te reproduceren die bacteriën in het wild tegenkomen uit een reeks bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende mariene deeltjes25, of de verspreiding van voedingsstoffen uit lysed fytoplanktoncellen26.
We presenteerden twee toepassingen van deze methode: 1) het vrijkomen van een enkele chemische puls om de bacteriële accumulatie−dissipatiedynamiek te bestuderen vanaf uniforme omstandigheden, en 2) het vrijkomen van meerdere pulsen om de bacteriële accumulatieprofielen te karakteriseren onder niet-evenwichtsvoedingscondities. De eerste toepassing is bijzonder geschikt om de gedragsreacties van microben te karakteriseren bij het voor het eerst tegenkomen van een voedingsbron. Onder dergelijke omstandigheden, waarin de concentratie van chemoattractante moleculen extreem laag is, wordt de vroege fase van chemotaxis gedomineerd door de stochastische bindingsbindende gebeurtenissen van chemoattractante moleculen aan de chemoreceptoren17. Onze methode, door snel en precies het vrijgeven van een bekende massa van chemoattractant in een nul-voedingsstof achtergrond, biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van eerdere benaderingen om de bacteriële respons te karakteriseren onder dynamische omstandigheden27,28,29. Voordelen zijn het kennen van de volledige verdeling van chemoattractant op alle locaties en te allen tijde (aangezien de diffusiviteit bekend is), en het volledig vermijden van de generatie van de vloeistofstroom die inherent is geassocieerd met andere apparaten, zoals de microinjector27 of drie-inlaat geometrieën30.
In de tweede toepassing komen de chemische pulsen voor in een groot, quasi-2D-domein volgens een door de gebruiker gedefinieerde sequentie in ruimte en tijd die volledig aanpasbaar is via software, die kan worden gebruikt om willekeurige sequenties of bepaalde patronen op te leggen. Belangrijk is dat deze methode een krachtig verband biedt tussen de hoge resolutie gedragsdynamiek van bacteriële chemotaxis en de opname van voedingsstoffen over tijdschalen van seconden en langdurige dynamiek, zoals groei en potentieel evolutie. De bacteriële arena is aanzienlijk groter (2 cm x 2 cm) dan de ruimtelijke bereik van chemische interactie van de bacteriën met een enkele puls (van honderden micrometers voor de kleinste pulsen tot een paar millimeter voor de grootste pulsen). De sleutel tot het behoud van een lage chemische achtergrond (veel lager dan de concentratie van de chemische pulsen bij het vrijkomen) is de opname van het nanoporeuze PCTE membraan ingeklemd tussen de twee PDMS-lagen18. Door het toepassen van een vloeistofstroom in het microfluïde kanaal geplaatst aan de bovenkant van het apparaat, een continue wash-out van de ongerijpte verbindingen en besteed medium in de bacteriële arena wordt gerealiseerd door middel van moleculaire diffusie door het nanoporeuze membraan, zonder het creëren van stroom in de testsectie van het apparaat waar bacteriën zich bevinden (Figuur 1).
Door de gerichte LED-balk te moduleren in tijd, amplitude, grootte en geometrie, geeft fotorelease-technologie de experimentator grote flexibiliteit om verschillende soorten chemische omgevingen te genereren. Tegelijkertijd, terwijl de hier gepresenteerde tests werden uitgevoerd onder rustige omstandigheden, kan onze methode verder worden uitgebreid om bacteriële chemotaxis te testen onder verschillende stroomconfiguraties. Door de bacteriële accumulatiedynamiek getrouw te reconstrueren door middel van videomicroscopie, genereert onze methode grote hoeveelheden gegevens van hoge kwaliteit die kunnen worden gebruikt om de statistieken van bacteriegedrag en de potentiële opname van voedingsstoffen door bacteriële cellen te schatten. Onze experimentele microfluïdische benadering, nabootsen voedingslandschappen die bacteriën kunnen worden geconfronteerd onder natuurlijke omgevingsomstandigheden, maakt de systematische studie van het foerageren gedrag van microbiële soorten die essentieel zijn in het fietsen van voedingsstoffen op de macroscopische schaal2,3. Als zodanig is het type gegevens dat via deze methodologie wordt gegenereerd nuttig om de opnamepercentages van de bevolking effectief te kalibreren en voedingskinetiek beter af te leiden in mesoscale-ecosysteemmodellen.
De fabricage van de PDMS mallen om de grote bacteriële arena te maken werd uitgevoerd met behulp van een commerciële 3D-printservice. Vergelijkbare resultaten kunnen echter worden bereikt met behulp van een high-end 3D-printer in huis, met een resolutie van 50−100 μm die nodig is om de kleinste kenmerken van de microkanaalontwerpen op te lossen. Een glad oppervlak van het 3D-geprinte materiaal voor de PDMS-mal is nodig om een goede binding te bereiken tussen de gegoten PDMS en de andere oppervlakken van het apparaat (d.w.z. glas, polystyreen, PDMS). Voor onze toepassing biedt het gebruik van een polystyreen petrischaal (90 mm x 15 mm) als het onderste oppervlak van de 3D-arena twee voordelen ten opzichte van het gebruik van een glazen schuif zoals gewoonlijk gebruikt in microfluidics studies: ten eerste vermindert het de bevestiging van bacteriële cellen aanzienlijk in vergelijking met een glazen oppervlak (hoewel bevestiging kan afhangen van de specifieke oppervlakte-eigenschappen van de betrokken microbe); ten tweede, het biedt secundaire insluiting, die lekkage van media over microscopieapparatuur in het geval van morsen kan voorkomen. Het PDMS-vormuithardingsproces vindt meestal plaats bij een hoge temperatuur (70−80 °C), maar in deze toepassing moet de experimentator de PDMS-mal bakken bij een aanzienlijk lagere temperatuur (45 °C in het huidige geval, zie Materiaaltabel), onder de warmteafbuiging en de smelttemperatuur van het materiaal dat wordt gebruikt voor het 3D-printen van de master. De lagere baktemperatuur verlengt het uithardingsproces ('s nachts) aanzienlijk, maar verandert niets aan de mechanische en chemische eigenschappen van de PDMS.
Hoewel onze methode is toegepast op een bepaalde combinatie van bacteriën en chemoattractant, is de methodologie geschikt om diverse biologische processen te testen, waaronder de opname van voedingsstoffen of blootstelling aan antibiotica, en kan worden toegepast op modelsystemen van verschillende soorten en chemoattractants, gezien het feit dat een groot aantal moleculen zijn (of kunnen worden) gekooid8. Een potentiële beperking is het gevolg van de kosten van commercieel beschikbare gekooide verbindingen, maar deze kosten zijn vergelijkbaar met die welke worden gemaakt bij het gebruik van de moleculaire sondes die doorgaans in de biowetenschappen worden gebruikt voor cellevensvatbaarheid, tellen of intracellulaire vlekken. Ondanks deze mogelijke beperking kan de voorgestelde methodologie brede toepassingen vinden in de biofysische en biomedische wetenschappen, om vroege reacties en aanpassingsdynamiek van microbiële populaties bij eencellige resolutie te karakteriseren tot dynamische chemische gradiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de eerste microfabricagefaciliteit van ETH Zürich. Dit werk werd ondersteund door een Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (aan D.R.B.), een Gordon en Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (aan R.S.), en een Swiss National Science Foundation subsidie 1-002745-000 (naar R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R.
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
