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Genetics

सशर्त Cas9 स्थिरीकरण का उपयोग कर जीन कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक नया टूलकिट

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

यहां, हम छोटे अणु, शील्ड-1 के तहत क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट-(CRISPR-) संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) के लौकिक और सशर्त स्थिरीकरण के आधार पर एक जीनोम-संपादन उपकरण का वर्णन करते हैं । विधि सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

संकुल नियमित रूप से लघु palindromic दोहराने-(CRISPR-) संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रौद्योगिकी जीनोम में सटीक और लक्षित संशोधनों को लागू करने के लिए एक प्रचलित प्रयोगशाला उपकरण बन गया है । इसकी भारी लोकप्रियता और तेजी से प्रसार अपने पूर्ववर्तियों की तुलना में इसके आसान उपयोग और सटीकता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। फिर भी, प्रणाली के संविलियन सक्रियण के पास सीमित अनुप्रयोग हैं। इस पेपर में, हम एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो Cas9 प्रोटीन के सशर्त स्थिरीकरण के आधार पर CRISPR/Cas9 गतिविधि के लौकिक नियंत्रण की अनुमति देता है । रैपामाइसिन-बाइंडिंग प्रोटीन FKBP12 के एक इंजीनियर उत्परिवर्ती को Cas9 (डीडी-Cas9) में फ्यूज करने से Cas9 की तेजी से गिरावट में सक्षम बनाता है कि बदले में FKBP12 सिंथेटिक लिगांड (शील्ड-1) की उपस्थिति से स्थिर किया जा सकता है। अन्य प्रेरक तरीकों के विपरीत, इस प्रणाली को आसानी से दूसरे जीन के सशर्त विनियमन के बिना, रुचि के एक और जीन के साथ डीडी-Cas9 को सह-एक्सप्रेस करने के लिए द्वि-सिस्ट्रोनिक सिस्टम उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह विधि ट्रेस करने योग्य प्रणालियों के उत्पादन के साथ-साथ Cas9 नाभिक द्वारा लक्षित एलील्स के समानांतर, स्वतंत्र हेरफेर को सक्षम बनाती है। इस विधि के मंच का उपयोग आवश्यक जीनों की व्यवस्थित पहचान और लक्षण वर्णन और इन विट्रो और वीवो सेटिंग्स में जीन के कार्यात्मक इंटरैक्शन की पूछताछ के लिए किया जा सकता है।

Introduction

CRISPR-Cas9 जो "के लिए खड़ाहै" क्लस्टर नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता से जुड़े प्रोटीन 9" पहली बार बैक्टीरियल अनुकूली प्रतिरक्षा1, 2पर अध्ययन के भाग के रूप में खोजा गया था । आज, CRISPR/Cas9 प्रोग्राम करने योग्य जीन संपादन के लिए सबसे अधिक मान्यता प्राप्त उपकरण बन गया है और प्रतिलेखन और एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन3की अनुमति देने के लिए प्रणाली के विभिन्न पुनरावृत्तियों को विकसित किया गया है। यह तकनीक डीएनए4के लगभग किसी भी अनुक्रम के अत्यधिक सटीक आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम बनाती है ।

किसी भी CRISPR जीन संपादन के आवश्यक घटक एक अनुकूलन गाइड आरएनए अनुक्रम और Cas9 नाभिक5हैं । आरएनए गाइड डीएनए में लक्ष्य-पूरक अनुक्रम को बांधता है, जो Cas9 नाभिक को जीनोम3, 4में एक विशिष्ट बिंदु पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक करने कानिर्देशदेता है। परिणामस्वरूप दरार साइट तो गैर अनुरूप अंत में शामिल होने (NHEJ) या होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (HDR) द्वारा मरंमत की है, लक्षित डीएनए अनुक्रम5में परिवर्तन की शुरूआत के परिणामस्वरूप ।

CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन का उपयोग करना आसान है, और पिछले जीन-संपादन तकनीकों की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ती है औरयह सिस्टम2,4,5की बहुलता में कुशल और मजबूत दोनों साबित हुआ है। फिर भी, प्रणाली कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है। Cas9 की संविलियन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप अक्सर ऑफ-टारगेट और उच्च कोशिका विषाक्तता 4,6 ,7,8की संख्या में वृद्धि हुई है। इसके अतिरिक्त, Cas9 द्वारा आवश्यक और कोशिका अस्तित्व जीन का संविलियन लक्ष्यीकरण कुछ प्रकार के कार्यात्मक अध्ययनों जैसे कि कोशिका मृत्यु के गतिज अध्ययन ों को करने की क्षमता से दूर लेजाताहै।

टीईटी-ऑन और टीईटी-ऑफ9जैसे 6 मुद्दों के समाधान के लिए विभिन्न अक्षाकीय यासशर्तनियंत्रित CRISPR-Cas9 उपकरण विकसित किए गए हैं; साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन10; रासायनिक रूप से प्रेरित निकटता11; इंटीरीन निर्भर3; और 4-हाइड्रोक्सीटामोक्सिफेन एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) आधारित न्यूक्लियर लोकलाइजेशन सिस्टम12। सामान्य तौर पर, इनमें से अधिकांश प्रक्रियाएं (इंटीरिन स्प्लिसिंग और रासायनिक रूप से प्रेरित निकटता विभाजन प्रणाली) रिवर्सिबल नियंत्रण प्रदान नहीं करती हैं, दवा उपचार (टीईटी-ऑन/ऑफ सिस्टम) के लिए बहुत धीमी गतिज प्रतिक्रिया पेश करती हैं, या उच्च-थ्रूपुट हेरफेर6के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए हमने एक उपन्यास टूलकिट विकसित किया जो न केवल तेज और मजबूत लौकिक नियंत्रित जीन संपादन प्रदान करता है बल्कि उच्च थ्रूपुट जीन हेरफेर के लिए पता लगाने की क्षमता, ट्यूनेबिलिटी और योग्यता भी सुनिश्चित करता है। इस उपन्यास तकनीक का उपयोग सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड और पशु मॉडल में किया जा सकता है। हमारी प्रणाली एक इंजीनियर डोमेन पर आधारित है, जब Cas9 से जुड़े, यह अपनी तेजी से गिरावट लाती है । हालांकि, यह तेजी से एक अत्यधिक चयनात्मक, गैर विषाक्त, सेल पार पार पार करने योग्य छोटे अणु के साथ स्थिर किया जा सकता है । अधिक विशेष रूप से, हमने मानव FKBP12 उत्परिवर्ती "अस्थिर डोमेन" (डीडी) को Cas9 में इंजीनियर किया, जो स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त होने पर सर्वव्यापी-प्रोटीसोम प्रणाली के माध्यम से तेजी से और संविलियन क्षरण के लिए Cas9 को चिह्नितकरताहै। डीडी सिंथेटिक लिगांड, शील्ड-1 डीडी संरचना को स्थिर कर सकता है, जिससे डीडी (जैसे Cas9) को बहुत ही कुशल तरीके से और तेजी से गतिज प्रतिक्रिया14, 15के साथ प्रोटीन के क्षरण को रोकाजासकता है। ध्यान दें, शील्ड-1 अपने जंगली प्रकार के समकक्ष14की तुलना में उत्परिवर्ती FKBP12 के लिए सख्त परिमाण के तीन आदेश के साथ बांधता है ।

डीडी-Cas9/शील्ड-1 जोड़ी का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु मॉडलों में आवश्यक जीन की व्यवस्थित पहचान और लक्षण वर्णन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि हमने पहले सिपड जीन को सशर्त लक्षित करके दिखाया था, जो माइटोकॉन्ड्रिया के चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; ईजीएफआर, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन में एक प्रमुख खिलाड़ी; और Tp53, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में एक केंद्रीय जीन । अस्थायी और सशर्त नियंत्रित जीन संपादन के अलावा, विधि का एक और लाभ यह है कि डीडी-Cas9 का स्थिरीकरण इसके प्रतिलेखन से स्वतंत्र है। यह सुविधा एक ही प्रमोटर के तहत, ट्रेस करने योग्य मार्कर के साथ-साथ रिकॉम्बिनेंटस के सह-अभिव्यक्ति को सक्षम बनाती है, जैसे एस्ट्रोजन रिसेप्टर-निर्भर रिकॉम्बेनेस,सीआरई ईआर। इस काम में, हम दिखाते हैं कि कैसे हमारी विधि को सफलतापूर्वक विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए सशर्त लक्ष्य, डीएनए प्रतिकृति जीन, RPA3।

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Protocol

1. डीडी-कैस9 वेक्टर

  1. Addgene से डीडी-Cas9 वेक्टर प्राप्त करें (भराव अनुक्रम और वीनस (EDCPV), प्लाज्मिड 90085 के साथ डीडी-Cas9।
    नोट: यह एक U6 प्रमोटर के साथ एक लेंटीवियरल डीडी-Cas9 प्लाज्मिड है जो सिंगल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) ट्रांसक्रिप्शन को चलाता है जबकि ईएफएस प्रमोटर डीडी-Cas9 ट्रांसक्रिप्शन को ड्राइव करता है। DYKDDDDK अनुक्रम (फ्लैग-टैग) Cas9 के सी-टर्मिनल पर मौजूद है जिसके बाद 2A सेल्फ क्लीविंग पेप्टाइड (P2A) है जो डीडी-Cas9 और संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस (mVenus) को अलग करता है ।

2. छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) डिजाइन

  1. डिजाइन छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) कि कई एल्गोरिदम में से एक का उपयोग करके डीडी-Cas9 वेक्टर में क्लोन किया जाएगा, एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र को लक्षित ।
    नोट: ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए, वेबसाइट का उपयोग करके उच्चतम स्कोर वाले sgRNA दृश्यों का चयन करें: http://crispr.mit.edu।
  2. एक पूर्ण एसजीआरएनए बनाने के लिए एसजीआरएनए अनुक्रम के अनुसार दो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन और ऑर्डर करें।
    नोट: चूंकि प्लाज्मिड को बीएसएमबीआई एंजाइम द्वारा पचाया जाएगा, इसलिए एसजीआरएनए अनुक्रम में बीएसएमबीआई पाचन ओवरहैंग जोड़कर आगे और रिवर्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन करें। तालिका 1से टेम्पलेट का उपयोग करें।

3. लेंटीविरल डीडी-Cas9 वेक्टर में SgRNA की क्लोनिंग

  1. एक प्रतिबंध एंजाइम पाचन प्रतिक्रिया में क्षारीय फॉस्फेट (FastAP) का उपयोग करके डीडी-Cas9 प्लाज्मिड के 5'-सिरों को डेफोस्फोरलेट करें।
    नोट: वैक्टर लिगेशन के दौरान फिर से परिपत्रीकृत कर सकते हैं, खासकर जब वे एक ही प्रतिबंध एंजाइम द्वारा रैखिकीकृत होते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वेक्टर फिर से परिपत्र नहीं होगा, पाचन प्रतिक्रिया में सीधे फॉस्फेटेस जोड़कर प्लाज्मिड को डी-फॉस्फोरलेट करें।
    1. डीफोस्फोरिलेट और डीडी-Cas9 प्लाज्मिड के 5 माइक्रोग्राम का मिश्रण तैयार करके बीएसएएमबीआई एंजाइम के साथ प्लाज्मिड को पचा लें, डाइजेस्ट बफर (10x) के 6 माइक्रोन, डीटीटी के 0.6 माइक्रोन (100 mM), बीएसएएमबीआई के 3 माइक्रोन, फास्टएपी के 3 माइक्रोन, कुल प्रतिक्रिया मात्रा बनाने के लिए 60 माइक्रोन नाभिक मुक्त पानी जोड़ते हैं।
      नोट: अंत में मिश्रण में BSmBI एंजाइम और FastAP जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक या थर्मोसाइकिलर पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  2. पचा डीडी-Cas9 प्लाज्मिड को शुद्ध करें।
    1. एंजाइमों के अधूरे पचाए गए प्लाज्मिड और निशान को हटाने के लिए 0.8% डीएनए एगर उठे जेल तैयार करें। बेहतर पृथक्करण के लिए एक व्यापक जेल-कंघी का उपयोग करें और 90 वी पर जेल चलाएं।
    2. 360-365 एनएम यूवी प्रकाश के तहत बैंड की कल्पना करें और बड़े प्लाज्मिड बैंड को जेल से बाहर काटें। 2 केबी टुकड़े को त्यागें जो भराव के अनुरूप है।
    3. एक वाणिज्यिक जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके बड़े कट जेल-बैंड को शुद्ध करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  3. पचा डीडी-Cas9 प्लाज्मिड के साथ लिगेट एनील्ड ओलिगोस।
    1. फॉस्फोरिलेट और एनील द स्ग्रना ओलिगोस।
      1. T4 Ligation बफर (10x), ओलिगो 1 (100 माइक्रोनएम), ओलिगो 2 (100 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन, नाभिक मुक्त पानी के 6.5 माइक्रोन का मिश्रण तैयार करें। अंत में, T4 PNK के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। इस प्रतिक्रिया की कुल मात्रा 10 माइक्रोन है।
      2. निम्नलिखित शर्तों के साथ थर्मोसाइकिलर में रिएक्शन-मिक्स जोड़ें: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और फिर 5 डिग्री सेल्सियस/मिनट की गति के साथ 25 डिग्री सेल्सियस तक नीचे रैंप।
        नोट: PNK गर्मी-निष्क्रिय किया जाना चाहिए इससे पहले कि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को लिगेशन में डाल दिया जाता है अन्यथा पीएनके वेक्टर फॉस्फोरलेट करेगा। फॉस्फोरिलेशन स्टेप और एनीलिंग स्टेप को थर्मोसाइकिलर में एक साथ किया जाता है। फॉस्फोरिलेशन चरण जहां 5 'फॉस्फेट को एसजीआरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में जोड़ा जाता है, लिगामेंट होने के लिए आवश्यक है।
    2. लिगेट डीडी-Cas9 ने प्लाज्मिड और एसजीआरएनए ओलिगोस को पचा लिया।
      1. नाभिक मुक्त पानी में 1:200 के लिए annealed ओलिगोस पतला और लिगेशन प्रतिक्रिया में प्लाज्मिड डीएनए के ५० एनजी का उपयोग करें ।
        नोट: 6 डालने के मोलर अनुपात का उपयोग करें: 1 वेक्टर, एकीकरण को बढ़ावा देने या मोलर अनुपात की गणना करने के लिए एक लिगेशन कैलकुलेटर का उपयोग करने के लिए: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation।
      2. लिगेशन रिएक्शन मिक्स तैयार करें: पचा और शुद्ध डीडी-Cas9 वेक्टर के 50 एनजी, पतला एनील्ड ओलिगोस की उचित मात्रा, T4 लिगेशन बफर (10x) के 1 माइक्रोन, T4 डीएनए लिगाज़ के 1 माइक्रोन, प्रतिक्रिया की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोन न्यूकलेस-मुक्त पानी तक।
      3. यदि "उच्च एकाग्रता" लिगाज़ का उपयोग कर रहे हैं, तो 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया को बढ़ाएं। अन्यथा, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, या लिगेशन की अधिक उपज प्राप्त करने के लिए, रात 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: यदि मानक T4 डीएनए लिगाज़ का उपयोग 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है तो हीट-निष्क्रिय। यदि आप लिगाज़ मास्टर मिक्स का उपयोग कर रहे हैं तो गर्मी-निष्क्रिय न करें।

4. बैक्टीरियल ट्रांसफॉर्मेशन

  1. कमरे के तापमान पर पूर्व गर्म 10 सेमी एलबी-एम्पीसिलिन आगर प्लेटें।
  2. बर्फ पर "एक शॉट Stbl3" सक्षम जीवाणु कोशिकाओं के 50 μL गल।
  3. सक्षम जीवाणु कोशिकाओं के 50 माइक्रोन में लिगेशन मिश्रण के 2-3 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से ट्यूब के नीचे को 4 बार उंगली से फ्लिक करके मिलाएं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
  4. हीट-शॉक एक टाइमर का उपयोग करके, 40 सेकंड के लिए ठीक 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को झटका देता है। बर्फ पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को 5 मिनट तक ठंडा करें।
  5. बैक्टीरियल कोशिकाओं में एंटीबायोटिक के बिना एसओसी मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें 45 मिनट के लिए 250 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं।
  6. पूर्व गर्म पौंड-एम्पीसिलिन प्लेटों पर परिवर्तित बैक्टीरिया के 100 माइक्रोन फैलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।

5. लिगाटेड प्लाज्मिड की मिनी/मैक्सी-प्रेप

  1. एक मैक्सी/मिनी तैयारी स्टार्टर संस्कृति तैयार करें ।
    1. अगले दिन एक जीवाणु क्लोन लेने और ampicillin युक्त पौंड मीडिया के 8 एमएल के साथ एक स्टार्टर संस्कृति टीका ।
    2. 250 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में बैक्टीरिया उगाएं, 10-12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
    3. मिनी-प्रेप के लिए बैक्टीरिया के 3-5 एमएल का उपयोग करें या इसे मैक्सी-प्रेप के लिए स्टार्टर संस्कृति के रूप में उपयोग करें। बैक्टीरिया संस्कृति के अनुपात में 100% ग्लिसरोल जोड़कर बैक्टीरिया ग्लिसेरोल-स्टॉक के रूप में बाकी बैक्टीरिया का उपयोग करें: ग्लिसरोल 1:1 है।
      नोट: यहां, हम मिनी तैयारी प्रक्रिया का वर्णन करेंगे ।
  2. मिनी तैयारी प्रक्रिया
    1. 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर बैक्टीरियल कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र की फसल 3-5 एमएल।
    2. पी 1 बफर के 200 माइक्रोन के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं के गोली को फिर से रीसुस्ल करें, जिसमें आरएनएसई ए होता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होता है।
    3. बफर P2 के 200 μL जोड़ें और धीरे से ट्यूब उलटा द्वारा मिश्रण 10 बार जब तक तरल स्पष्ट करता है।
    4. बफर पी 3 के 300 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूब को 10 बार उलटा करके मिलाएं। लिक्विड बादल बन जाएंगे। 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूनों अपकेंद्रित्र के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
    5. स्पिन कॉलम और अपकेंद्रित्र को 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर स्पष्ट सुपरनैंट स्थानांतरित करें।
      प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सुपरनेट स्पष्ट है। कण स्पिन कॉलम को रोक सकते हैं और कॉलम प्रभावकारिता को कम कर सकते हैं।
    6. 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर पीडी बफर और अपकेंद्रित्र के 400 माइक्रोल जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    7. 1 मिनट के लिए स्पिन कॉलम और अपकेंद्रित्र को 12,000 x ग्राम पर धोने के लिए पीडब्ल्यू बफर के 600 माइक्रोन जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    8. बफर अवशेषों को हटाने के लिए 3 मिनट के लिए शीर्ष गति पर स्पिन कॉलम फिर से सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और इसे 2 मिनट के लिए बैठने दें।
    9. स्पिन कॉलम को एक ताजा ट्यूब में रखें और 50 माइक्रोन एल्यूशन बफर जोड़ें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 2 मिनट के लिए शीर्ष गति पर अपकेंद्रित्र ।
    10. sgRNA डालने (एनजी/μL) के साथ शुद्ध डीडी-Cas9 प्लाज्मिड की एकाग्रता को मापने के लिए नैनोड्रॉप डिवाइस का उपयोग करें ।
  3. डीडी-Cas9 प्लाज्मिड के डीएनए अनुक्रमण द्वारा SgRNA क्लोनिंग मान्य करें। तालिका 2में U6 प्राइमर अनुक्रम का उपयोग करें ।

6. लेंटीविराल तैयारी

  1. ट्रांसफैक्शन के लिए HEK293T पैकेजिंग सेल तैयार करें।
    1. 10 पारित करने के लिए स्वस्थ HEK293T का उपयोग करें और उन्हें समान रूप से घनत्व 1-2 x 106 कोशिकाओं प्रति 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट पर बीज। 10% फ़िल्टर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 10 एमएल का उपयोग करें। ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट कोशिकाओं, 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए।
    2. अगले दिन, पुष्टि करें कि कोशिकाएं ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा 70% तक पहुंच गई हैं और वे समान रूप से प्लेट में फैले हुए हैं। 10 एमएल की अंतिम मात्रा के साथ ट्रांसफैक्शन से पहले मीडिया को 1 घंटे कोशिकाओं में बदलें।
      नोट: मीडिया एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीमाइकोटिक्स के अनुपस्थित होना चाहिए ।
    3. गर्म मीडिया (जैसे, ऑप्टिमईएम) के 500 माइक्रोल के साथ 2 ट्यूबों का मिश्रण तैयार करें।
      1. मीडिया के गर्म 500 माइक्रोन युक्त ट्यूब 1 में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 25 माइक्रोन जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      2. इस बीच, क्लोन किए गए sgRNAd (psPAX2) के 6 माइक्रोन युक्त डीडी-Cas9 के 3.5 माइक्रोग्राम वाले ट्यूब 2 में प्लाज्मिड का मिश्रण तैयार करें, और लिफाफे प्लाज्मिड (pMD2.G) के 3 माइक्रोन को मीडिया के गर्म 500 L में तैयार करें।
      3. ट्यूब 1 को ट्यूब 2 के साथ मिक्स करें ताकि ट्रांसफैक्शन मिश्रण बन सके और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया जा सके।
      4. ड्रॉपवाइज एचईके 293टी कोशिकाओं और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट प्लेट के लिए ट्रांसफैक्शन मिश्रण, 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
      5. 18 घंटे के बाद, ध्यान से ट्रांसफैक्शन रीएजेंट को हटाने के लिए 10% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएम के 10 मिलीएल में मीडिया को बदलें। अगले 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
      6. 48 घंटे के बाद, 10 एमएल सिरिंज के साथ सुपरनैंट इकट्ठा करें और इसे 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित करें।
      7. Aliquot और -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस सुपरनॉट स्टोर करें।

7. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ वायरस टाइटर और ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता का निर्धारण

  1. 5 x 105 कोशिकाओं के साथ HEK293T कोशिकाओं बीज/ बीज कोशिकाओं को दो 6-अच्छी प्लेटों में। अगले दिन गिनती के लिए एक प्लेट का प्रयोग करें।
  2. इनक्यूबेटर में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता, 5% सीओ2 रात को 50-60% की मजबूती तक पहुंचने के लिए अगले दिन 50-60% तक इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन 6 कुओं में कोशिकाओं की गिनती के लिए 6-कुएं प्लेटों में से एक का इस्तेमाल करें ।
  4. गल वायरस aliquot है कि धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन और पॉलीब्रेन reagent के 8 μg/mL जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  5. वायरस के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम तैयार करें और पॉलीब्रेन रीएजेंट के 8 μg/l जोड़ें।
  6. पॉलीब्रेन युक्त मीडिया में 1 x 10 -1 से 1 x10 -4 तक लेंटीवायरस के दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने की2 एमसीएल तैयार करें।
  7. 6-वेल प्लेट से मीडिया निकालें और कुओं में वायरल कमजोर पड़ने की 1 एमएल जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अकेले मीडिया के साथ एक अच्छी तरह से छोड़ दो और १००% वायरस के साथ एक अच्छी तरह से ।
  8. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वायरस के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट।
  9. अगले दिन, 6-वेल प्लेटों से वायरस के साथ मीडिया को हटा दें और इसे 10% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएम के 2 मिलील के लिए बदलें। 48-72 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं। हर दिन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी का निरीक्षण करें।
  10. 48-72 घंटे के बाद, कोशिकाओं को अलग करें और उन्हें एमएसी बफर में फिर से खर्च करें।
  11. जीएफपी अभिव्यक्ति का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें।
  12. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके वायरस टाइटर की गणना करें: TU/mL = (कोशिकाओं की संख्या ट्रांसड्यूड एक्स प्रतिशत फ्लोरोसेंट एक्स कमजोर पड़ने फैक्टर)/(एमएल में ट्रांसडक्शन वॉल्यूम)

8. लक्ष्य कोशिकाओं का लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन

  1. एक 10 सेमी प्लेट के लिए ब्याज की सेल लाइन प्लेट और अगले दिन 50-60% तक पहुंचने के लिए रात भर इनक्यूबेट ।
    नोट: हम DD-Cas9 और दो स्वतंत्र RPA3-जीन sgRNAs व्यक्त A549 सेल लाइन का इस्तेमाल किया । हमने रेनिला नियंत्रण के साथ वेक्टर व्यक्त करते हुए A549 सेल लाइन का भी उपयोग किया। हमने उन कोशिकाओं को 2 x 103कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर वरीयता प्राप्त की और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता, 5% सीओ2 रात भर 50-60% तक पहुंचने के लिए अगले दिन 50-60% तक पहुंचने के लिए प्रेरित किया। हमने 10% फ़िल्टर किए गए एफबीएस के साथ आरपीएमआई मीडिया का उपयोग किया। हम अनुवर्ती कार्रवाई के रूप में अगले कदम के साथ आगे बढ़े:
  2. अगले दिन, संस्कृति माध्यम की कुल मात्रा में 10 एमएल में वायरस कणों के 500-2000 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को संक्रमित । 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट वायरल मीडिया ।
  3. अगले दिन, वायरल मीडिया को संस्कृति मीडिया में बदलें और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें।
  4. एफएसीएसएस सेल छंटाई द्वारा या ब्लेमसिन चयन का उपयोग करके जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करें।
  5. सकारात्मक चयनित कोशिकाओं का विस्तार और एक शेयर फ्रीज।

9. Cas9 मध्यस्थता जीन संपादन के सशर्त प्रेरण

  1. प्लेट सकारात्मक चयनित कोशिकाओं 24 घंटे संक्रमण के बाद और साथ ही 12-अच्छी तरह से प्लेट के लिए अलग से अनट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं । जब तक कोशिकाओं को देते है और सेल संस्कृति शील्ड-1 के २०० एनएम युक्त मीडिया के लिए मीडिया को बदलने के लिए रुको । प्लेटों में मीडिया को ट्रांसड्यूडेड और अनट्रांसड्यूड-सेल्स के साथ बदलें, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नियमित मीडिया के साथ प्रति प्लेट 2 कुओं को छोड़ दें।
  2. विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक कुएं से प्रोटीन को इनक्यूबेट और निकालें: समय 0, 2 घंटे, 6 एच, 12 घंटे, 24 एच, 48 एच, और 72 घंटे कुएं में शील्ड-1 जोड़ने के बाद।
  3. इसके बाद बाकी कुओं से शील्ड-1 के साथ मीडिया को हटा दें और इसे रेगुलर सेल मीडिया के लिए बदल दें।
  4. मीडिया बदलने के बाद उन कुओं 2 घंटे, 6 घंटे और 12 घंटे से प्रोटीन ले लीजिए।
  5. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा कल्पना करें इसके अलावा और इसके लिगामेंट, शील्ड-1 की वापसी के बाद अस्थिर डीडी-Cas9 प्रोटीन विनियमन की रिवर्सिबिलिटी और तेजी। प्रोटीन की कल्पना करने के लिए DYKDDDDK टैग की ओर निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करें और उदाहरण के लिए बीटा-ट्यूबलिन को लक्षित करने वाला नियंत्रण एंटीबॉडी।
  6. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मनाए गए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र द्वारा शील्ड-1 की इष्टतम खुराक का निर्धारण करें।

10. जीन संपादन का सत्यापन

नोट: जीएफपी अभिव्यक्ति परख, जैसे प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और ब्लेसोमिसिन चयन मार्कर केवल सफल CRISPR रीएजेंट डिलीवरी की पुष्टि करते हैं, लेकिन वे यह निर्धारित नहीं करते हैं कि वांछित अनुक्रम को सफलतापूर्वक लक्षित किया गया था या नहीं। CRISPR प्रयोग द्वारा सफल जीन लक्ष्यीकरण की पुष्टि करने के लिए सबसे आम परख सेंगर डीएनए अनुक्रमण, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, सर्वेयर नाभिक परख, अपघटन (ज्वार) परख, या पश्चिमी दाग विश्लेषण16,17,18द्वारा Indels की ट्रैकिंग कर रहे हैं ।

  1. प्लेट सकारात्मक कोशिकाओं का चयन किया और मीडिया युक्त शील्ड-1 के 200 एनएम करने के लिए मीडिया बदल जाते हैं। 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं, शील्ड-1 के साथ मीडिया बदलना हर 3 दिन में।
  2. शील्ड-1 द्वारा डीडी-Cas9 प्रेरण के 5 दिन बाद उपर्युक्त सत्यापन तकनीकों का उपयोग करें।

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Representative Results

Cas9 की सशर्त अभिव्यक्ति को सक्षम करने के लिए, हमने एक दोहरी लेंटीविरायल वेक्टर निर्माण विकसित किया जिसमें एक U6-चालित प्रमोटर शामिल है, जो SgRNA को अभिव्यक्त करने के लिए, और डीडी-कैस 9 फ्यूजन प्रोटीन(चित्रा 1A) 19की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक EF-1α कोर प्रमोटर है। सिस्टम की मजबूती और दक्षता को समझाने के लिए एक प्रतिमान के रूप में, हमने लेंटीवायरल निर्माण के साथ फेफड़ों के कार्सिनोमेटस A549 सेल लाइन को स्थानांतरित कर दिया। लिगांड शील्ड-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में Cas9 के स्तर को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) और एंटी-फ्लैग विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा गया था। हमने असंक्रमित कोशिकाओं और नकली संक्रमित कोशिकाओं (वाहन) को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया। कोशिकाओं को 7 डी के लिए 10 से 1000 एनएम तक शील्ड-1 की एकाग्रता के साथ इलाज किया गया। जैसा कि दिखाया गया है, शील्ड-1 के साथ उपचार एक मजबूत खुराक पर निर्भर तरीके से डीडी-Cas9 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने में सक्षम था(चित्रा 1B और चित्रा 2A)। डीडी-Cas9 के लिए विशिष्ट प्राइमर के साथ आरटी-पीसीआर विश्लेषण और ग्लाइकरल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़ (GAPDH) के लिए नियंत्रण प्राइमर ने पुष्टि की कि डीडी-कैस 9 की एमआरएनए अभिव्यक्ति का स्तर ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं और वाहन के बीच समान था, जो शील्ड-1(चित्रा 2B)की उपस्थिति या अनुपस्थिति के बावजूद था। यह इस बात की पुष्टि करता है कि Cas9 प्रोटीन का शामिल करना एक पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल घटना है।

यह प्रणाली डीडी-Cas9 प्रोटीन के तेज और प्रतिवर्ती स्थिरीकरण को सक्षम बनाती है। चित्रा 3 असंक्रमित A549 कोशिकाओं की तुलना में शील्ड-1 के 200 एनएम के साथ उपचार के बाद ट्रांसड्यूडेड A549 सेल लाइन 2 घंटे में Cas9 अभिव्यक्ति के पर्याप्त प्रेरण से पता चलता है। हालांकि, शील्ड-1 की वापसी के परिणामस्वरूप डीडी-Cas9 प्रोटीन की तेजी से कमी आती है, जो 6 से 12 घंटे(चित्रा 3)के भीतर नगण्य हो जाता है।

आरपीए3 प्रोटीन मानव प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) हेट्रोट्रिमर का एक घटक है। यह एक एकल फंसे डीएनए बाध्यकारी परिसर है कि डीएनए प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, और मरम्मत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । आवश्यक जीन का अध्ययन करने के लिए प्रणाली के उपयोग को मान्य करने के लिए, हमने RPA3 जीन को लक्षित किया । इस उद्देश्य के लिए, हमने दो स्वतंत्र लोकस-विशिष्ट एकल गाइड आरएनए (गाइड 25 और 44) के साथ-साथ रेनिला को नियंत्रण (गाइड 208) के रूप में उपयोग किया। डीडी-Cas9 लेंटीविरल निर्माण के साथ स्थानांतरित A549 कोशिकाओं को 3 डी के लिए शील्ड-1 के 200 एनएम के साथ इलाज किया गया था। शील्ड-1-इलाज ट्रांसड्यूडेड A549 कोशिकाओं में सेल संख्या में कमी आरपीए 3 गाइड आरएनए युक्त उपचार के 48 एच के बाद स्पष्ट था, और रेनिलानमूने (चित्रा 4A)में सेल संख्या पर कोई प्रभाव नहीं देखा गया था। आरपीए3 प्रोटीन की कमी को मान्य करने के लिए, हमने शेल्ड-1 प्रेरण(चित्रा 4B)के बाद आरपीए3 3 डी के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके एक इम्यूनोब्लोटिंग विश्लेषण किया। इसके अलावा, हमने सर्वेयर नाभिक परख और डीएनए अनुक्रमण(चित्र 4सी)का उपयोग करके जीन संपादन उलटा या इनडेल म्यूटेशन की पुष्टि की।

लेंटीवायरल वेक्टर निर्माण हम डिजाइन एक अनूठी विशेषता भालू: डीडी-Cas9 प्रोटीन स्थिरता के विनियमन अपनी mRNA अभिव्यक्ति से स्वतंत्र है । यह अस्थिर डीडी-Cas9(चित्रा 5A,5B)द्वारा संग्राहक किए बिना एक ही ईएफ-1ए प्रमोटर के तहत ब्याज की एक और जीन व्यक्त करने के लिए बायोसिस्ट्रोनिक सिस्टम की पीढ़ी को सक्षम बनाता है । हमने डीडी-Cas9 और mVenus के बीच एक 2A सेल्फ-क्लीविंग पेप्टाइड (P2A) भी जोड़ा, एक संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन जिसका उपयोग संक्रमित कोशिकाओं(चित्रा 5A)का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि एमवेनस को पी 2 ए के बाद रखा गया है, जैसा कि चित्रा 5 Bमें पश्चिमी दाग विश्लेषण के परिणामों द्वारा दिखाया गया है, वाहन में एमवेनस प्रोटीन की अभिव्यक्ति और डीडी-कैस 9 अभिव्यक्ति और शील्ड-1 उपचार से स्वतंत्र A549 ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं में मनाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1:लेंटीवायरल निर्माण और विभिन्न जीन-संपादन उपकरणों की योजनाबद्ध। A)डीडी-Cas9 लेंटीविरल बैकबोन में एक U6 प्रमोटर, sgRNA, EF-1a प्रमोटर, डीडी, spCas9, न्यूक्लियोप्लैमिन एनएलएस और फ्लैग-टैग शामिल हैं । B)डीडी-Cas9 सिस्टम (बाएं पैनल) और जीन-संपादन उपकरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न टीईटी-ऑन सिस्टम (दाएं पैनल) के बीच तुलना। बालक-सीढ़ी, एनआई-गैर-संक्रमित कोशिकाएं, वेह-वाहन, -एसएच कोशिकाओं का इलाज बिना शील्ड-1, + एसएच कोशिकाओं का इलाज 200 एनएम शील्ड के साथ किया जाता है, - डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के बिना डॉक्सी कोशिकाएं, + डॉक्सी कोशिकाओं को डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:शील्ड-1 द्वारा खुराक पर निर्भर डीडी-Cas9 स्थिरीकरण के प्रतिनिधि परिणाम। A)शील्ड-1 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज कोशिकाओं में स्थिर डीडी-Cas9 अभिव्यक्ति के एक विरोधी झंडा टैग एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी दाग विश्लेषण । एक नियंत्रण के रूप में, असंक्रमित कोशिकाओं (एनआई) और नकली-इलाज कोशिकाओं (Veh) का उपयोग किया गया था। फ्यूजन प्रोटीन डीडी-Cas9 दोनों नियंत्रणों में अज्ञेय था । B)शील्ड-1 की अनुपस्थिति या खुराक-निर्भर उपचारों में ट्रांसड्यूड कोशिकाओं में डीडी-Cas9 के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों के आरटी-पीसीआर परिणाम ट्रांसड्यूड कोशिकाओं और वाहन के बीच समान थे, जो एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में गैपध प्राइमर का उपयोग कर रहे थे। इस आंकड़े को सेरिफ एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पश्चिमी दाग विश्लेषण अपनी लिगांड शील्ड-1 की वापसी के बाद अस्थिर डीडी-Cas9 प्रोटीन विनियमन की रिवर्सिबिलिटी और तेजी को दर्शाता है । डीडी-Cas9 और असंक्रमित A549 के साथ ट्रांसड्यूसेड A549 सेल लाइन को नियंत्रण के रूप में संकेतित समय बिंदुओं के लिए शील्ड-1 लिगामेंट के 200 एनएम के साथ संक्रमण के बाद 24 घंटे का इलाज किया गया। मॉक कंट्रोल सेल में डीडी-सीए9 का प्रोटीन लेवल अज्ञेय था। इस आंकड़े को सेरिफ एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:डीडी-Cas9 प्रणाली "इन-विट्रो" और "इन-वीवो" सेटिंग्स में मजबूत जीन संपादन को प्रेरित कर सकती है। A)सेल लाइन A549 RPA3 जीन और डीडी-Cas9 (RPA3) के लिए sgRNA व्यक्त एक वेक्टर के साथ transduced । एक नियंत्रण के रूप में A549 एक वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूड किया गया था जो रेनिला (रेन) के लिए sgRNA व्यक्त करता था। कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए शील्ड-1 (200 एनएम) के साथ इलाज किया गया जिसके परिणामस्वरूप आरपीए 3 sgRNA व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता में तेजी से कमी आई, जिसमें रेनिला नियंत्रण नमूने में सेल संख्या पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। A549 सेल लाइन में RPA3 जीन संपादन की दक्षता बी द्वारा मान्य किया गया था) पश्चिमी दाग विश्लेषण RPA3 A549 और रेनिला A549 में फ्लैग टैग के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर 3 दिन शील्ड-1 (२०० एनएम) उपचार और सी की अनुपस्थिति में सर्वेयर नाभिक परख द्वारा । पैनल सी में तीर) सर्वेक्षक नाभिक परख के टुकड़े दिखाते हैं। इस आंकड़े को सेरिफ एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:डीडी-कैस 9 से स्वतंत्र रूप से एमवेनस की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक बायोसिस्ट्रोनिक डीडी-कैस9 लेंटीवायरल निर्माण की योजना। A)निर्माण U6 प्रमोटर, sgRNA, EF-1a प्रमोटर, डीडी-Cas9, P2A, और mVenus के होते हैं । B)डीडी-Cas9, P2A और एमवेनस युक्त लेंटीवायरल प्लाज्मिड वाली ट्रांसड्यूड A549 कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए 50 एमएम लिगामेंट शील्ड-1 के साथ इलाज किया गया। तीसरे दिन वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस सेल lysate के साथ किया गया, जिसमें अलग से जीएफपी और फ्लैग-टैग के खिलाफ एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया । चित्रा 5B को सेरिफ एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फॉरवर्ड (ओलिगो 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNnnn-3'
रिवर्स (ओलिगो 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNC-3'

तालिका 1:आगे और रिवर्स sgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का डिजाइन। फॉरवर्ड (ओलिगो 1) और रिवर्स (ओलिगो 2) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को बीएसएमबीआई एंजाइम पाचन को जोड़कर डिजाइन किया गया है जो आपके एसजीआरएनए अनुक्रम को ओवरहैंग करता है। "एन" आपके एसजीआरएनए अनुक्रम में मौजूद विभिन्न न्यूक्लियोटिड्स को दर्शाता है, बाकी बीएसएएमबीआई पाचन के लिए ओवरहैंग हैं।

U6 प्राइमर अनुक्रम 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

तालिका 2: SgRNA क्लोनिंग सत्यापन के लिए U6 प्रमोटर अनुक्रम। SgRNA क्लोनिंग कितना सफल है मान्य करने के लिए, डीडी-Cas9 प्लाज्मिड के डीएनए अनुक्रमण के लिए U6 प्रमोटर अनुक्रम का उपयोग करें ।

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Discussion

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी ने जीनोम2से कार्यात्मक रूप से पूछताछ करने की क्षमता में क्रांतिकारी बदलाव किया है । हालांकि, जीन की निष्क्रियता के परिणामस्वरूप अक्सर कोशिका घातकता, कार्यात्मक घाटे और विकासात्मक दोष होते हैं, जो जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए ऐसे दृष्टिकोणों की उपयोगिता को सीमित करते हैं7। इसके अतिरिक्त, Cas9 की संविलियन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप विषाक्तता और ऑफ-टारगेट प्रभाव6की पीढ़ी हो सकती है। CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों6को अस्थायी रूप से नियंत्रित करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । ये प्रणालियां या तो Cas9 और/या sgRNA के ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण पर आधारित हैं, या Cas9 पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसलेशनल एक्टिवेशन21,22, 23पर आधारित हैं । इन प्रणालियों के विकल्प के रूप में, हमने Cas9 के सशर्त अस्थिरता के आधार पर एक उपन्यास टूलकिट विकसित किया।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम एक विशिष्ट जीन के लिए कम से दो या तीन sgRNA के डिजाइन के लिए बंद लक्ष्य प्रभाव से बचने और कुशल जीन संपादन की सुविधा है । एक दर-सीमित कदम डीडी-Cas9 वेक्टर के साथ सेल लाइन का एक कुशल परिवर्तन है। लेंटीवायरस कणों (उच्च टाइटर्स) की गुणवत्ता एचईके-293T कोशिकाओं पर निर्भर करती है। एचईके-293T कोशिकाओं के कम मार्ग संख्या (10 मार्ग तक) का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिन्हें ठीक से बनाए रखा गया था (विभाजन जब वे 70% की भरफ़ुमेकी तक पहुंच जाते हैं, आमतौर पर सप्ताह में दो बार 1:6 अनुपात में)। एक विकल्प के रूप में, HEK-293 Lenti-X सेल लाइन, जो क्लोन रूप से नियमित एचईके-293T कोशिकाओं की तुलना में 30× उच्च वायरल टाइटर्स उपज के लिए चुना गया था24इस्तेमाल किया जा सकता है । एक अन्य महत्वपूर्ण कदम डीडी-Cas9 प्लाज्मिड, psPAX2 पैकेजिंग प्लाज्मिड, और pMD2.G लिफाफा प्लाज्मिड के अनुपात का अनुकूलन है। हमारे अनुभव में, दोनों मात्रा जिसमें लिपोफेक्टामाइन के साथ ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार किया जाता है, साथ ही प्लाज्मिड अनुपात, ट्रांसफैक्शन दक्षता पर पर्याप्त प्रभाव डालता है। हम सर्वोत्तम परिणामों के लिए अपने प्रोटोकॉल में चरणों का पालन करने की सलाह देते हैं। कुशल जीन संपादन के लिए अगला महत्वपूर्ण कदम शील्ड-1 सांद्रता का अनुकूलन है। हम 200 एनएम की अंतिम एकाग्रता की सलाह देते हैं लेकिन सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए, एकाग्रता को एक विशिष्ट ट्रांसड्यूड सेल लाइन में अनुकूलित किया जाना चाहिए। डीडी/शील्ड-1 प्रणाली का सफलतापूर्वक विभिन्न कोशिका संस्कृतियों, रोगाणु कोशिकाओं, प्रोटोज़ोआन एंटामोबा हिस्टोलिटिका,फ्लैटवर्म कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,ट्रांसजेनिक ज़ेनोग्रेफ्ट, ट्रांसजेनिक चूहों और मेडाका25में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। सबसे बड़ी सीमाओं में से एक शील्ड-1 अणु की उच्च लागत है, खासकर जब वीवो सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा रहा है । इसके अतिरिक्त, यह पहले दिखाया गया है कि प्रोटीन है कि कुछ सेल डिब्बों के लिए लक्षित कर रहे हैं, जैसे माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के lumen स्थिर या ढाल-1 की अनुपस्थिति में संचित किया जा सकता है । इसका कारण यह है कि विभिन्न प्रोटीनों में विभिन्न स्थानीय प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी26 होतीहै । जबकि साइटोप्लाज्म या नाभिक में डीडी संलयन को स्तनधारी कोशिकाओं में बहुत कुशलता से अपमानित किया जा सकता है और शील्ड-1 द्वारा स्थिर किया जा सकता है, ऊपर उल्लिखित सीमाओं को दूर करने के लिए, हम बैक्टीरियल डियेड्रोफोलेट रिप्रेक्टेज27से प्राप्त एक वैकल्पिक अस्थिर डोमेन का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह प्रणाली अस्थिरता डोमेन को स्थिर करने के लिए एक बाध्यकारी अणु के रूप में त्रिमेथोप्रिम का उपयोग करती है और शील्ड-127के लिए एक कम महंगा विकल्प भी है।

डीडी-Cas9 के प्रतिलेखन को अपनी स्वतंत्र अभिव्यक्ति के रूप में प्राप्त करने के अलावा, अन्य अकक्षित या सशर्त नियंत्रित CRISPR-Cas9 जीन संपादन उपकरणों की तुलना में इस विधि के फायदे, अस्थायी और सशर्त नियंत्रित जीन संपादन, कम लक्ष्य प्रभाव, और निचले सेल विषाक्तता4,6,7,8हैं। शील्ड-1/डीडी-Cas9 विधि की दक्षता और सादगी विभिन्न प्रकार के उपकरणों की पीढ़ी को सक्षम करती है जिन्हें अनुप्रयोगों की बहुलता में आसानी से अनुकूलित और उपयोग किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग वीवो सेटिंग्स में भी आसानी से किया जा सकता है, और यह दिखाया गया है कि शील्ड-1रक्त-मस्तिष्क बैरियर19,25, 28,29के माध्यम से कुशलतापूर्वक प्रवेश कर सकता है। हालांकि इस कागज आवश्यक सेल जीन के लक्षण वर्णन के लिए CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन किया है, एक ही दृष्टिकोण आसानी से अस्तित्व या ट्यूमर की प्रगति के लिए आवश्यक जीन की पहचान के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम पिछले काम के लिए हमारी प्रयोगशाला और वैज्ञानिक सेरिफ सेंटुर्क के पिछले सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि को समीक्षकों द्वारा पढ़ने के लिए डैनिलो सेगोविया को धन्यवाद देते हैं । यह अध्ययन संभव था और अमेरिका भर में तैरना और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर लक्ष्य डिस्कवरी और विकास केंद्र कार्यक्रम द्वारा समर्थित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

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References

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जेनेटिक्स अंक 175 जीन संपादन कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन CRISPR Cas9 अस्थिर डोमेन अकक्षित
सशर्त Cas9 स्थिरीकरण का उपयोग कर जीन कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक नया टूलकिट
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