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Genetics

Ein neues Toolkit zur Bewertung von Genfunktionen mit bedingter Cas9-Stabilisierung

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Hier beschreiben wir ein Genom-Editing-Tool, das auf der zeitlichen und bedingten Stabilisierung des geclusterten, regelmäßig interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) assoziierten Proteins 9 (Cas9) unter dem kleinen Molekül Shield-1 basiert. Die Methode kann für kultivierte Zellen und Tiermodelle verwendet werden.

Abstract

Die CRISPR/Cas9-Technologie (CRISPR-) (Clustered Short Palindromic Repeat- 9) ist zu einem weit verbreiteten Laborwerkzeug geworden, um genaue und gezielte Modifikationen im Genom einzuführen. Seine enorme Popularität und schnelle Verbreitung werden auf seine einfache Bedienung und Genauigkeit im Vergleich zu seinen Vorgängern zurückgeführt. Die konstitutive Aktivierung des Systems hat jedoch nur begrenzte Anwendungen. In diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode, die eine zeitliche Kontrolle der CRISPR/Cas9-Aktivität basierend auf der bedingten Stabilisierung des Cas9-Proteins ermöglicht. Die Verschmelzung einer engineered Mutante des Rapamycin-bindenden Proteins FKBP12 mit Cas9 (DD-Cas9) ermöglicht den schnellen Abbau von Cas9, der wiederum durch das Vorhandensein eines synthetischen FKBP12-Liganden (Shield-1) stabilisiert werden kann. Im Gegensatz zu anderen induzierbaren Methoden kann dieses System leicht angepasst werden, um bi-cistronische Systeme zu erzeugen, um DD-Cas9 mit einem anderen Gen von Interesse zu koexprimieren, ohne bedingte Regulation des zweiten Gens. Diese Methode ermöglicht die Generierung rückverfolgbarer Systeme sowie die parallele, unabhängige Manipulation von Allelen, auf die die Cas9-Nuklease abzielt. Die Plattform dieser Methode kann für die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene und die Abfrage der funktionellen Interaktionen von Genen in in vitro und in vivo Settings genutzt werden.

Introduction

CRISPR-Cas9, das für"clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9"steht,wurde erstmals im Rahmen von Studien zur bakteriellen adaptiven Immunität1,2entdeckt. Heute ist CRISPR/Cas9 das bekannteste Werkzeug für programmierbare Genbearbeitung und verschiedene Iterationen des Systems wurden entwickelt, um transkriptionelle und epigenetische Modulationen zu ermöglichen3. Diese Technologie ermöglicht die hochpräzise genetische Manipulation nahezu jeder DNA-Sequenz4.

Die wesentlichen Bestandteile jeder CRISPR-Genbearbeitung sind eine anpassbare Guide-RNA-Sequenz und die Cas9-Nuklease5. Der RNA-Guide bindet an die zielprolementarische Sequenz in der DNA und weist die Cas9-Nuklease an, an einem bestimmten Punkt im Genom einen Doppelstrangbruch durchzuführen3,4. Die resultierende Spaltstelle wird dann durch nicht-homologe Endfügung (NHEJ) oder homologiegerichtete Reparatur (HDR) repariert, mit der daraus resultierenden Einführung von Veränderungen in der zielgerichteten DNA-Sequenz5.

CRISPR/Cas9-basierte Genbearbeitung ist einfach zu bedienen und relativ kostengünstig im Vergleich zu früheren Gen-Editing-Techniken und hat sich in einer Vielzahl von Systemen als effizient und robusterwiesen 2,4,5. Das System stellt jedoch einige Einschränkungen dar. Es wurde oft gezeigt, dass die konstitutive Expression von Cas9 zu einer erhöhten Anzahl von Off-Targets und einer hohen Zelltoxizitätführt 4,6,7,8. Darüber hinaus nimmt das konstitutive Targeting von essentiellen und Zellüberlebensgenen durch Cas9 seine Fähigkeit, bestimmte Arten von funktionellen Studien wie kinetische Studien des Zelltods durchzuführen7.

Verschiedene induzierbare oder bedingt gesteuerte CRISPR-Cas9-Tools wurden entwickelt, um diese Probleme zu lösen6, wie Tet-ON und Tet-Off9; standortspezifische Rekombination10; chemisch induzierte Nähe11; inteinabhängiges Spleißen3; und 4-Hydroxytamoxifen Östrogenrezeptor (ER) basierte kerne Lokalisationssysteme12. Im Allgemeinen bieten die meisten dieser Verfahren (Intein-Spleißen und chemisch induzierte Proximity-Split-Systeme) keine reversible Kontrolle, zeigen eine sehr langsame kinetische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung (Tet-On/Off-System) oder sind für Hochdurchsatzmanipulationen nicht zugänglich6.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges Toolkit entwickelt, das nicht nur eine schnelle und robuste zeitgesteuerte Genbearbeitung ermöglicht, sondern auch Rückverfolgbarkeit, Abstimmbarkeit und Zugänglichkeit zur Genmanipulation mit hohem Durchsatz gewährleistet. Diese neuartige Technologie kann in Zelllinien, Organoiden und Tiermodellen eingesetzt werden. Unser System basiert auf einer entwickelten Domäne, die, wenn sie mit Cas9 verschmolzen ist, ihren schnellen Abbau induziert. Es kann jedoch schnell mit einem hochselektiven, ungiftigen, zelldurchlässigen kleinen Molekül stabilisiert werden. Genauer gesagt haben wir die humane FKBP12-Mutante "destabilisierende Domäne" (DD) zu Cas9 entwickelt und Cas9 für einen schnellen und konstitutiven Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System markiert, wenn es in Säugetierzellen exprimiert wird13. Der synthetische DD-Ligand Shield-1 kann die DD-Konformation stabilisieren und dadurch den Abbau von proteinen, die mit DD verschmolzen sind (wie Cas9), auf sehr effiziente Weise und mit einer schnellen kinetischen Reaktion verhindern14,15. Bemerkenswert ist, dass Shield-1 mit drei Größenordnungen enger an die Mutante FKBP12 bindet als an sein Wildtyp-Gegenstück14.

Das DD-Cas9/Shield-1-Paar kann verwendet werden, um die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene in kultivierten Zellen und Tiermodellen zu untersuchen, wie wir zuvor gezeigt haben, indem wir bedingt auf das CypD-Gen abzielen, das eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Mitochondrien spielt; EGFR, ein wichtiger Akteur in der onkogenen Transformation; und Tp53, ein zentrales Gen in der DNA-Schadensreaktion. Neben der zeitlich und bedingt kontrollierten Genbearbeitung besteht ein weiterer Vorteil der Methode darin, dass die Stabilisierung von DD-Cas9 unabhängig von seiner Transkription erfolgt. Diese Eigenschaft ermöglicht die Co-Expression von rückverfolgbaren Markern sowie Rekombinasen, wie der Östrogenrezeptor-abhängigen Rekombinase, CREER,unter dem gleichen Promotor. In dieser Arbeit zeigen wir, wie unsere Methode in vitro erfolgreich eingesetzt werden kann, um beispielsweise das DNA-Replikationsgen RPA3 bedingt anzusprechen.

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Protocol

1.Der DD-Cas9-Vektor

  1. Erhalten Sie den DD-Cas9-Vektor von Addgene (DD-Cas9 mit Füllstoffsequenz und Venus (EDCPV), Plasmid 90085).
    HINWEIS: Dies ist ein lentivirales DD-Cas9-Plasmid mit einem U6-Promotor, der die Single-Guide-RNA (sgRNA)-Transkription antreibt, während der EFS-Promotor die DD-Cas9-Transkription antreibt. Die DYKDDDDK-Sequenz (Flag-Tag) ist am C-Terminal von Cas9 vorhanden, gefolgt von einem selbstspaltenden 2A-Peptid (P2A), das DD-Cas9 und das modifizierte fluoreszierende Protein Venus (mVenus) trennt.

2. Kleines Guide-RNA-Design (sgRNA)

  1. Entwerfen Sie eine kleine Leit-RNA (sgRNA), die mit einem von mehreren Algorithmen in den DD-Cas9-Vektor geklont wird und auf eine bestimmte genomische Region abzielt.
    HINWEIS: Um die Off-Target-Effekte zu reduzieren, wählen Sie sgRNA-Sequenzen mit der höchsten Punktzahl aus, indem Sie die Website verwenden: http://crispr.mit.edu.
  2. Entwerfen und ordnen Sie zwei Oligonukleotide pro sgRNA-Sequenz, um eine vollständige sgRNA herzustellen.
    HINWEIS: Da das Plasmid vom BsmBI-Enzym verdaut wird, entwerfen Sie das vordere und das umgekehrte Oligonukleotid, indem Sie der sgRNA-Sequenz BsmBI-Verdauungsüberhänge hinzufügen. Verwenden Sie die Vorlage aus Tabelle 1.

3. Klonen von sgRNA in den lentiviralen DD-Cas9-Vektor

  1. Dephosphorylat der 5′-Enden des DD-Cas9-Plasmids unter Verwendung von alkalischer Phosphatase (FastAP) in einer Restriktionsenzym-Verdauungsreaktion.
    HINWEIS: Vektoren können während der Ligatur re-zirkularisieren, insbesondere wenn sie durch ein einzelnes Restriktionsenzym linearisiert werden. Um sicherzustellen, dass der Vektor nicht wieder zirkularisiert, entphosphorylieren Sie das Plasmid, indem Sie Phosphatase direkt in die Verdauungsreaktion geben.
    1. Dephosphorylat und Verdauung des Plasmids mit BsmBI-Enzym durch Herstellung einer Mischung aus 5 μg DD-Cas9-Plasmid, 6 μL Verdauungspuffer (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, addieren Sie bis zu 60 μL nukleasefreies Wasser, um 60 μL des gesamten Reaktionsvolumens zu bilden.
      HINWEIS: Fügen Sie am Ende das BsmBI-Enzym und FastAP zur Mischung hinzu.
    2. Inkubieren Sie die Mischung für 30 min bei 37 °C Hitzeblock oder Thermocycler.
  2. Reinigen Sie das verdaute DD-Cas9-Plasmid.
    1. Bereiten Sie ein 0,8% ige DNA-Agarosegel vor, um unvollständig verdautes Plasmid und Spuren von Enzymen zu entfernen. Verwenden Sie einen breiteren Gelkamm für eine bessere Trennung und führen Sie das Gel bei 90 V aus.
    2. Visualisieren Sie Bänder unter 360-365 nm UV-Licht und schneiden Sie das größere Plasmidband aus dem Gel. Verwerfen Sie das 2 kb-Fragment, das dem Füllstoff entspricht.
    3. Reinigen Sie das große geschnittene Gelband mit einem handelsüblichen Gelreinigungskit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
  3. Ligate geglühte Oligos mit verdautem DD-Cas9-Plasmid.
    1. Phosphorylat und Glühen der sgRNA-Oligos.
      1. Bereiten Sie die Mischung aus 1 μL T4-Ligationspuffer (10x), 1 μL Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL nukleasefreiem Wasser vor. Fügen Sie schließlich 0,5 μL T4 PNK hinzu. Das Gesamtvolumen dieser Reaktion beträgt 10 μL.
      2. Fügen Sie das Reaktionsgemisch dem Thermocycler unter folgenden Bedingungen hinzu: 37 °C für 30 min, 95 °C für 5 min und dann mit einer Geschwindigkeit von 5 °C/min auf 25 °C herunterfahren.
        HINWEIS: Das PNK muss hitzeinaktiviert werden, bevor die Oligonukleotide in die Ligatur gegeben werden, sonst wird das PNK den Vektor phosphorylatieren. Der Phosphorylierungsschritt und der Glühschritt werden zusammen in einem Thermocycler durchgeführt. Der Phosphorylierungsschritt, bei dem den sgRNA-Oligonukleotiden 5'-Phosphat zugesetzt wird, ist für die Ligatur erforderlich.
    2. Ligate DD-Cas9 verdaute Plasmid und sgRNA Oligos.
      1. Verdünnen Sie die geglühten Oligos auf 1:200 in nukleasefreiem Wasser und verwenden Sie 50 ng Plasmid-DNA in der Ligationsreaktion.
        HINWEIS: Verwenden Sie das molare Verhältnis des Vektors 6 Insert : 1, um die Integration von Inserts zu fördern, oder verwenden Sie einen Ligationsrechner, um das Molverhältnis zu berechnen: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Bereiten Sie die Ligationsreaktionsmischung vor: 50 ng verdauter und gereinigter DD-Cas9-Vektor, geeignetes Volumen verdünnter geglühter Oligos, 1 μL T4-Ligationspuffer (10x), 1 μL T4-DNA-Ligase, bis zu 10 μL nukleasefreies Wasser, um das Gesamtvolumen der Reaktion 10 μL zu erhalten.
      3. Wenn Sie eine Ligase mit "hoher Konzentration" verwenden, inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 5 min. Andernfalls 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder, um eine höhere Ligationsausbeute zu erzielen, bei 16 °C über Nacht inkubieren.
        HINWEIS: Hitzeinaktivieren, wenn Sie die Standard-T4-DNA-Ligase bei 65 °C für 20 Minuten verwenden. Nicht inaktivieren, wenn Sie Ligase-Master-Mischungen verwenden.

4. Bakterielle Transformation

  1. Vorwärmen 10 cm LB-Ampicillin-Agarplatten bei Raumtemperatur.
  2. 50 μL "One shot Stbl3" kompetente Bakterienzellen auf Eis auftauen.
  3. Fügen Sie 2-3 μL Ligationsmischung zu 50 μL kompetenter Bakterienzellen hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie den Boden der Röhre mit einem Finger 4 Mal streichen. 30 Min. auf Eis inkubieren.
  4. Hitzeschocken Sie die Zellen bei genau 42 °C für 40 Sekunden mit einem Timer. Kühlen Sie die Bakterienzellen auf Eis für 5 min ab.
  5. 500 μL SOC-Medien ohne Antibiotikum in die Bakterienzellen geben und im Schüttelinkubator bei 250 U/min für 45 min bei 37 °C züchten.
  6. Verteilen Sie 100 μL transformierte Bakterien auf vorwarmen LB-Ampicillin-Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.

5. Mini/Maxi-Vorbereitung von ligaiertem Plasmid

  1. Bereiten Sie eine Maxi-/Mini-Prep-Starterkultur vor.
    1. Am nächsten Tag wählen Sie einen einzelnen bakteriellen Klon und impfen Sie eine Starterkultur mit 8 ml LB-Medium, das Ampicillin enthält.
    2. Züchten Sie die Bakterien im Schüttelbrutschrank bei 250 U / min, 37 °C für 10-12 h.
    3. Verwenden Sie 3-5 ml Bakterien für die Mini-Vorbereitung oder verwenden Sie sie als Starterkultur für die Maxi-Vorbereitung. Verwenden Sie den Rest der Bakterien als bakterielle Glycerin-Brühe, indem Sie 100% Glycerin im Verhältnis von Bakterienkultur: Glycerin ist 1: 1.
      HINWEIS: Hier beschreiben wir das Mini-Prep-Verfahren.
  2. Mini-Vorbereitungsverfahren
    1. Ernte 3-5 ml Bakterienzellen und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min.
    2. Resuspend das Pellet von Bakterienzellen mit 200 μL P1-Puffer, der RNase A enthält und bei 4 °C gelagert wird.
    3. Fügen Sie 200 μL Puffer P2 hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 10 Mal umkehren, bis die Flüssigkeit klärt.
    4. Fügen Sie 300 μL Puffer P3 hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 10 Mal invertieren. Die Flüssigkeit wird trüb. Fahren Sie sofort mit dem Zentrifugal der Proben bei 12.000 x g für 10 min fort.
    5. Durchsichtigen Überstand auf die Spinsäule und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min übertragen.
      Verwerfen Sie den Durchfluss.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Überstand geklärt ist. Partikel können die Spinsäule verstopfen und die Säuleneffizienz verringern.
    6. Fügen Sie 400 μL PD-Puffer und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min hinzu. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    7. Fügen Sie 600 μL PW-Puffer hinzu, um die Schleudersäule und die Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    8. Zentrifugieren Sie die Spinsäule erneut mit Höchstgeschwindigkeit für 3 min, um die Pufferrückstände zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss und lassen Sie ihn 2 Minuten einlegen.
    9. Legen Sie die Spinsäule in ein frisches Rohr und fügen Sie 50 μL Elutionspuffer hinzu. 5 min inkubieren und 2 min bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugieren.
    10. Verwenden Sie das Nanodrop-Gerät, um die Konzentration des gereinigten DD-Cas9-Plasmids mit dem sgRNA-Insert (ng/μL) zu messen.
  3. Validierung der sgRNA-Klonierung durch DNA-Sequenzierung des DD-Cas9-Plasmids. Verwenden Sie die U6-Primersequenz in Tabelle 2.

6. Lentivirale Zubereitung

  1. Bereiten Sie HEK293T-Verpackungszellen für die Transfektion vor.
    1. Verwenden Sie gesunde HEK293T bis Passage 10 und säen Sie sie gleichmäßig bei Dichte 1-2 x 106 Zellen pro 10 cm Gewebekulturplatte. Verwenden Sie 10 ml Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% gefiltertem fetalem Rinderserum (FBS). Inkubieren Sie die Zellen im Gewebekultur-Inkubator bei 5% CO2 und 37 °C für 20 h.
    2. Bestätigen Sie am nächsten Tag, dass die Zellen durch Hellfeldmikroskopie eine Konfluenz von 70% erreicht haben und dass sie gleichmäßig über die Platte verteilt sind. Wechseln Sie das Medium 1 h vor der Transfektion mit dem endvolumen von 10 ml in Zellen.
      HINWEIS: Die Medien sollten keine Antibiotika und Antimykotika haben.
    3. Bereiten Sie die Mischung aus 2 Röhrchen mit 500 μL warmen Medien (z. B. OptiMEM) vor.
      1. 25 μL Transfektionsreagenz in Röhrchen 1 mit warmen 500 μL Medium geben und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      2. In der Zwischenzeit eine Mischung von Plasmiden zu Röhrchen 2 mit 3,5 μg DD-Cas9 mit geklonter sgRNA, 6 μg des Verpackungsplasmids (psPAX2) und 3 μg des Hüllplasmids (pMD2.G) in warme 500 μL Medium vorbereiten.
      3. Rohr 1 mit Röhrchen 2 zu einer Transfektionsmischung mischen und bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
      4. Dropwise die Transfektionsmischung zu HEK293T-Zellen und Inkubationsplatte im Gewebekultur-Inkubator, bei 5% CO2 und 37 °C über Nacht.
      5. Wechseln Sie das Medium nach 18 h vorsichtig auf 10 ml frisches DMEM mit 10% FBS, um das Transfektionsreagenz zu entfernen. Inkubieren Sie für die nächsten 48 Stunden.
      6. Nach 48 h den Überstand mit einer 10-ml-Spritze auffangen und durch einen 0,45 μm-Filter leiten.
      7. Aliquot und lagern Sie den Virusüberstand bei -80 °C.

7. Bestimmung der Wirksamkeit von Virustiter und Transduktion mit Durchflusszytometrie

  1. Die HEK293T-Zellen mit 5 x 105 Zellen/Vertiefung in eine 6-Well-Platte einsäen. Samen Sie Zellen in zwei 6-Well-Platten. Verwenden Sie eine Platte zum Zählen am nächsten Tag.
  2. Inkubieren Sie die Platten im Inkubator bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 über Nacht, um am nächsten Tag 50-60% Konfluenz zu erreichen.
  3. Verwenden Sie am nächsten Tag eine der 6-Well-Platten, um die Zellen in 6 Wells zu zählen.
  4. Tauen Sie das Virus-Aliquot auf, das zur Durchführung der seriellen Verdünnung verwendet wird, und fügen Sie 8 μg / ml Polybrenreagenz hinzu.
  5. Bereiten Sie DMEM mit 10% FBS für die serielle Verdünnung des Virus vor und fügen Sie 8 μg / ml Polybrenreagenz hinzu.
  6. 2 ml zehnfache serielle Verdünnungen des Lentivirus von 1 x10-1 bis 1 x 10-4 in polybrenhaltigen Medien vorbereiten.
  7. Entfernen Sie Medien von der 6-Well-Platte und fügen Sie 1 ml virale Verdünnungen zu den Vertiefungen hinzu. Lassen Sie einen Brunnen mit Medien allein als Negativkontrolle und einen Brunnen mit 100% Virus.
  8. Inkubieren Sie Zellen mit dem Virus im Inkubator für 24 h.
  9. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium mit Virus von 6-Well-Platten und wechseln Sie es gegen 2 ml frisches DMEM mit 10% FBS. Inkubieren Sie Zellen für 48-72 h. Beobachten Sie GFP jeden Tag mit einem Fluoreszenzmikroskop.
  10. Nach 48-72 h die Zellen abnehmen und im MACS-Puffer wieder aufbringen.
  11. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um den Prozentsatz der GFP-Expression zu bestimmen.
  12. Berechnen Sie den Virustiter mit der folgenden Formel: TU/ml = (Anzahl der aufnehmerten Zellen x Prozent fluoreszierend x Verdünnungsfaktor)/(Transduktionsvolumen in ml)

8. Lentivirale Transduktion von Zielzellen

  1. Platten Sie die Zelllinie von Interesse auf eine 10 cm Platte und inkubieren Sie über Nacht, um am nächsten Tag eine Konfluenz von 50-60% zu erreichen.
    HINWEIS: Wir verwendeten die A549-Zelllinie, die DD-Cas9 exprimiert, und zwei unabhängige RPA3-Gen-sgRNAs. Wir haben auch den A549-Zelllinienexpress-Vektor mit Renilla-Steuerung verwendet. Wir haben diese Zellen mit der Dichte von 2 x 103Zellen/cm2 ausgesät und bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 über Nacht inkubiert, um am nächsten Tag 50-60% Konfluenz zu erreichen. Wir verwendeten RPMI-Medien mit 10% gefilterten FBS. Wir gingen mit den nächsten Schritten wie folgt vor:
  2. Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit 500-2000 μL Viruspartikeln in 10 ml Gesamtvolumen des Kulturmediums. Inkubieren Sie virale Medien für 24 h.
  3. Wechseln Sie am nächsten Tag die viralen Medien in Nährmedien und bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie.
  4. Selektion von GFP-positiven Zellen durch FACS-Zellsortierung oder durch Bleomycin-Selektion.
  5. Erweitern Sie positiv ausgewählte Zellen und frieren Sie einen Bestand ein.

9. Bedingte Induktion der Cas9-vermittelten Genbearbeitung

  1. Platte positiv ausgewählte Zellen 24 h nach der Infektion sowie untransduzierte Zellen zu 12-Well-Platte separat. Warten Sie, bis sich die Zellen anlagern, und wechseln Sie das Medium in Zellkulturmedien mit 200 nM Shield-1. Ersetzen Sie die Medien in den Platten durch transduzierte und untransduzierte Zellen, so dass 2 Wells pro Platte mit regulären Medien als Negativkontrolle übrig bleiben.
  2. Inkubieren und extrahieren Sie Proteine aus jeder Vertiefung zu verschiedenen Zeitpunkten: Zeit 0, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h und 72 h nach Zugabe des Shield-1 zu den Vertiefungen.
  3. Entfernen Sie dann das Medium mit Shield-1 aus den restlichen Vertiefungen und wechseln Sie es gegen normale Zellmedien.
  4. Sammeln Sie die Proteine aus diesen Vertiefungen 2 h, 6 h und 12 h nach dem Wechsel der Medien.
  5. Visualisieren Sie durch Western-Blot-Analyse die Reversibilität und Schnelligkeit der destabilisierten DD-Cas9-Proteinregulation nach der Zugabe und dem Entzug ihres Liganden Shield-1. Verwenden Sie Antikörper, die auf dykDDDDK-Tag gerichtet sind, um Proteine und einen Kontrollantikörper zu visualisieren, der beispielsweise auf Beta-Tubulin abzielt.
  6. Bestimmen Sie die optimale Dosis von Shield-1 anhand der Dosis-Wirkungs-Kurve, die bei der Western Blot-Analyse beobachtet wurde.

10. Validierung der Genbearbeitung

HINWEIS: Die GFP-Expressionstests, wie die Durchflusszytometrie-Analyse und der Bleomycin-Selektionsmarker, bestätigen nur die erfolgreiche CRISPR-Reagenzienabgabe, bestimmen jedoch nicht, ob die gewünschte Sequenz erfolgreich anvisiert wurde. Die gebräuchlichsten Assays zur Bestätigung des erfolgreichen Gen-Targetings durch das CRISPR-Experiment sind Sanger DNA-Sequenzierung, Next-Generation-Sequenzierung, der Surveyor Nuclease Assay, der Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) Assay oder Western Blot Analyse16,17,18.

  1. Plattenpositiv ausgewählte Zellen und Medienwechsel auf 200 nM Shield-1-haltige Medien. Inkubieren Sie die Zellen für 5 Tage und wechseln Sie die Medien mit Shield-1 alle 3 Tage.
  2. Verwenden Sie die oben genannten Validierungstechniken 5 Tage nach der DD-Cas9-Induktion durch Shield-1.

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Representative Results

Um die bedingte Expression von Cas9 zu ermöglichen, entwickelten wir ein duales lentivirales Vektorkonstrukt, bestehend aus einem U6-getriebenen Promotor zur konstitutiven Expression von sgRNA und einem EF-1α-Kernpromotor, um die Expression des DD-Cas9-Fusionsproteins voranzutreiben (Abbildung 1A)19. Als Paradigma zur Veranschaulichung der Robustheit und Effizienz des Systems haben wir die lungenkarzinomale A549-Zelllinie mit dem lentiviralen Konstrukt transduziert. Die Cas9-Spiegel in Gegenwart oder Abwesenheit des Liganden Shield-1 wurden durch Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Western-Blot-Analyse mit einem Anti-Flag-spezifischen Antikörper gemessen. Wir verwendeten nicht infizierte Zellen und mock-infizierte Zellen (das Fahrzeug) als Kontrollen. Die Zellen wurden mit einer Konzentration von Shield-1 im Bereich von 10 bis 1000 nM für 7 d behandelt. Wie gezeigt, konnte die Behandlung mit Shield-1 die Expression von DD-Cas9 stark dosisabhängig regulieren (Abbildung 1B und Abbildung 2A). Die RT-PCR-Analyse mit spezifischen Primern für DD-Cas9 und Kontrollprimern für Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) bestätigte, dass die mRNA-Expression von DD-Cas9 zwischen den übertragenen Zellen und dem Vehikel trotz des Vorhandenseins oder Fehlens von Shield-1 ähnlich waren (Abbildung 2B). Dies bestätigt, dass die Induktion des Cas9-Proteins ein posttranskriptionelles Ereignis ist.

Dieses System ermöglicht eine schnelle und reversible Stabilisierung des DD-Cas9-Proteins. Abbildung 3 zeigt eine ausreichende Induktion der Cas9-Expression in der transduzierten A549-Zelllinie 2 h nach Behandlung mit 200 nM Shield-1 im Vergleich zu den nicht infizierten A549-Zellen. Der Entzug von Shield-1 führt jedoch zu einer schnellen Abnahme des DD-Cas9-Proteins, die innerhalb von 6 bis 12 h vernachlässigbar wird (Abbildung 3).

Das RPA3-Protein ist Bestandteil des humanen Replikationsproteins A (RPA) Heterotrimer. Es ist ein einzelsträngiger DNA-Bindungskomplex, der eine wichtige Rolle bei der DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur spielt. Um die Verwendung des Systems zur Untersuchung essentieller Gene zu validieren, haben wir das RPA3-Gen ins Visier genommen. Dazu haben wir zwei unabhängige lokusspezifische Einzelführungs-RNAs (Guides 25 und 44) sowie Renilla als Steuerung (Guide 208) verwendet. Die mit dem DD-Cas9 lentiviralen Konstrukt transduzierten A549-Zellen wurden mit 200 nM Shield-1 für 3 d behandelt. Eine Abnahme der Zellzahl in Shield-1-behandelten transduzierten A549-Zellen, die die RPA3-Leit-RNA enthielten, war nach 48 Stunden Behandlung offensichtlich, und es wurde keine Wirkung auf die Zellzahl in der Renilla-Probe beobachtet (Abbildung 4A). Um die Erschöpfung des RPA3-Proteins zu validieren, führten wir eine Immunoblotting-Analyse mit einem Antikörper gegen RPA3 3 d nach Sheild-1-Induktion durch (Abbildung 4B). Darüber hinaus bestätigten wir Gen-Editing-Inversion oder Indel-Mutationen mit Surveyor-Nuklease-Assays und DNA-Sequenzierung (Abbildung 4C).

Das von uns entwickelte lentivirale Vektorkonstrukt weist ein Alleinstellungsmerkmal auf: Die Regulation der DD-Cas9-Proteinstabilität ist unabhängig von seiner mRNA-Expression. Dies ermöglicht die Erzeugung bicistronischer Systeme, um ein anderes Gen von Interesse unter demselben EF-1a-Promotor zu exprimieren, ohne durch das destabilisierte DD-Cas9 moduliert zu werden (Abbildung 5A, 5B). Wir haben auch ein 2A selbstspaltendes Peptid (P2A) zwischen DD-Cas9 und mVenus hinzugefügt, ein modifiziertes fluoreszierendes Protein, das zur Rückverfolgung infizierter Zellen verwendet werden kann (Abbildung 5A). Da mVenus nach P2A platziert wird, wie die Ergebnisse der Western Blot-Analyse in Abbildung 5Bzeigen, wurde die Expression des mVenus-Proteins im Vehikel und in den A549-transduzierten Zellen unabhängig von der DD-Cas9-Expression und der Shield-1-Behandlung beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des lentiviralen Konstrukts und verschiedener Gen-Editing-Werkzeuge. A) Das lentivirale Rückgrat DD-Cas9 enthält einen U6-Promotor, sgRNA, EF-1a-Promotor, DD, spCas9, Nucleoplasmin NLS und Flag-Tag. B) Vergleich zwischen dem DD-Cas9-System (linkes Panel) und verschiedenen Tet-On-Systemen (rechtes Panel), die als Gen-Editing-Tools verwendet werden. Lad-Ladder, NI-nicht infizierte Zellen, Veh-Vehicle, -Sh-Zellen ohne Shield-1 behandelt, + Sh-Zellen, die mit 200 nM Shield behandelt wurden, - Doxyzellen ohne Doxycyclin-Behandlung, + Doxy-Zellen, die mit Doxycyclin behandelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der dosisabhängigen DD-Cas9-Stabilisierung durch Shield-1. A) Western Blot-Analyse mit einem Anti-Flag-Tag-Antikörper stabilisierter DD-Cas9-Expression in Zellen, die mit steigenden Konzentrationen von Shield-1 behandelt wurden. Als Kontrolle wurden die nicht infizierten Zellen (NI) und mock-behandelten Zellen (Veh) verwendet. Das Fusionsprotein DD-Cas9 war in beiden Kontrollen nicht nachweisbar. B)Die RT-PCR-Ergebnisse der mRNA-Expressionsniveaus von DD-Cas9 in transduzierten Zellen in Abwesenheit oder dosisabhängiger Behandlung von Shield-1 waren bei transduzierten Zellen und Vehikeln ähnlich, wobei GAPDH-Primer als interne Kontrolle verwendet wurden. Diese Zahl wurde von Serif et al19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Western Blot-Analyse veranschaulicht die Reversibilität und Schnelligkeit der destabilisierten DD-Cas9-Proteinregulation nach dem Entzug ihres Liganden Shield-1. Transduzierte A549-Zelllinien mit DD-Cas9 und nicht infiziertem A549 als Kontrolle wurden 24 h nach der Infektion mit 200 nM Shield-1-Liganden für die angegebenen Zeitpunkte behandelt. Der Proteinspiegel von DD-Cas9 in simulierten Kontrollzellen war nicht nachweisbar. Diese Zahl wurde von Serif et al19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Das DD-Cas9-System kann eine robuste Genbearbeitung in "in-vitro"- und "in-vivo"-Einstellungen induzieren. A) Die Zelllinie A549 wurde mit einem Vektor transduziert, der sgRNA für das RPA3-Gen und DD-Cas9 (RPA3) exprimiert. Als Kontrollmittel wurde A549 verwendet, das mit einem Vektor transduziert wurde, der sgRNA für Renilla (Ren) exprimiert. Die Zellen wurden 3 Tage lang mit Shield-1 (200 nM) behandelt, was zu einer schnellen Abnahme der Zelllebensfähigkeit in Zellen führte, die RPA3 sgRNA exprimierten, ohne Einfluss auf die Zellzahl in der Renilla-Kontrollprobe. Die Wirksamkeit der RPA3-Genbearbeitung in der A549-Zelllinie wurde durch B) Western Blot-Analyse mit dem Antikörper gegen Flag-Tag in RPA3 A549 und Renilla A549 in Gegenwart und Abwesenheit von 3 Tagen Shield-1 (200 nM) -Behandlung und C) durch SURVEYOR Nuklease-Assay validiert. Die Pfeile in Panel C) zeigen die Fragmente des SURVEYOR Nuklease-Assays. Diese Zahl wurde von Serif et al19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schema eines bicistronischen DD-Cas9 lentiviralen Konstrukts, um die Expression von mVenus unabhängig von DD-Cas9 zu steuern. A)Das Konstrukt besteht aus U6-Promotor, sgRNA, EF-1a-Promotor, DD-Cas9, P2A und mVenus. B)Transdukierte A549-Zellen mit einem lentiviralen Plasmid, das DD-Cas9, P2A und mVenus enthält, wurden 3 Tage lang mit dem 50 mM-Liganden Shield-1 behandelt. Am dritten Tag wurde die Western-Blot-Analyse mit Zelllysat durchgeführt, wobei der Antikörper gegen GFP und Flag-Tag separat verwendet wurde. Abbildung 5B wurde von Serif et al19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Vorwärts (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Rückwärts (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'

Tabelle 1:Das Design des vorwärts- und umgekehrten sgRNA-Oligonukleotids. Das vordere (Oligo 1) und das umgekehrte (Oligo 2) Oligonukleotid wird durch Zugabe von BsmBI-Enzymverdauung über die SgRNA-Sequenz entwickelt. "N" bezeichnet die verschiedenen Nukleotide, die in Ihrer sgRNA-Sequenz vorhanden sind, der Rest sind Überhänge für die BsmBI-Verdauung.

U6 Primer-Sequenz 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tabelle 2: Die U6-Promotorsequenz für die Validierung des sgRNA-Klonens. Um zu validieren, wie erfolgreich das klonen der sgRNA ist, verwenden Sie die U6-Promotorsequenz für die DNA-Sequenzierung des DD-Cas9-Plasmids.

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Discussion

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die Fähigkeit zur funktionellen Abfrage von Genomen revolutioniert2. Die Inaktivierung von Genen führt jedoch häufig zu Zellletalität, funktionellen Defiziten und Entwicklungsdefekten, was den Nutzen solcher Ansätze für die Untersuchung von Genfunktionen einschränkt7. Darüber hinaus kann die konstitutive Expression von Cas9 zu Toxizität und der Erzeugung von Off-Target-Effekten führen6. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um CRISPR-Cas9-basierte Genom-Editing-Technologien zeitlich zu kontrollieren6. Diese Systeme basieren entweder auf der transkriptionellen Kontrolle von Cas9 und/oder sgRNA oder auf der posttranskriptionellen und post-translationalen Aktivierung von Cas921,22,23. Als Alternative zu diesen Systemen haben wir ein neuartiges Toolkit entwickelt, das auf der bedingten Destabilisierung von Cas9 basiert.

Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist das Design von mindestens zwei oder drei sgRNA für ein bestimmtes Gen, um Off-Target-Effekte zu vermeiden und eine effiziente Genbearbeitung zu ermöglichen. Ein ratenbegrenzender Schritt ist eine effiziente Transformation der Zelllinie mit dem DD-Cas9-Vektor. Die Qualität der Lentivirus-Partikel (hohe Titer) hängt von den HEK-293T-Zellen ab. Es ist wichtig, eine niedrige Durchgangszahl (bis zu Durchgang 10) der HEK-293T-Zellen zu verwenden, die ordnungsgemäß gewartet wurden (geteilt, wenn sie 70% Konfluenz erreichten, normalerweise zweimal pro Woche im Verhältnis 1: 6). Als Alternative kann die HEK-293 Lenti-X Zelllinie verwendet werden, die klonal ausgewählt wurde, um 30× höhere Viraltiter als normale HEK-293T-Zellen zu liefern24. Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Optimierung des Verhältnisses von DD-Cas9 Plasmid, psPAX2 Verpackungsplasmid und pMD2.G Hüllplasmid. Unserer Erfahrung nach haben sowohl das Volumen, in dem die Transfektionsmischung mit Lipofektamin hergestellt wird, als auch das Plasmidverhältnis einen wesentlichen Einfluss auf die Transfektionseffizienz. Wir empfehlen, die Schritte in unserem Protokoll zu befolgen, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Der nächste entscheidende Schritt für eine effiziente Genbearbeitung ist die Optimierung der Shield-1-Konzentrationen. Wir empfehlen eine Endkonzentration von 200 nM, aber um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte die Konzentration auf eine bestimmte transduzierte Zelllinie optimiert werden. Das DD/Shield-1-System wurde erfolgreich in verschiedenen Zellkulturen, Keimzellen, dem Protozoen Entamoeba histolytica,dem Plattwurm Caenorhabditis elegans, transgenenXenografts, transgenen Mäusen und Medaka25eingesetzt. Eine der größten Einschränkungen sind die hohen Kosten des Shield-1-Moleküls, insbesondere wenn es in Vivo-Umgebungen verwendet wird. Darüber hinaus wurde bereits gezeigt, dass die Proteine, die auf bestimmte Zellkompartimente wie die mitochondriale Matrix oder das Lumen des endoplasmatischen Retikulums abzielen, in Abwesenheit von Shield-1 stabilisiert oder akkumuliert werden können. Dies liegt daran, dass verschiedene Proteine unterschiedliche lokale Proteinqualitätskontrollmaschinenhaben 26. Während DD-Fusionen im Zytoplasma oder Zellkern in Säugetierzellen sehr effizient abgebaut und durch Shield-1 stabilisiert werden können, empfehlen wir zur Überwindung der oben genannten Einschränkungen die Verwendung einer alternativen destabilisierenden Domäne, die von der bakteriellen Dihydrofolatreduktase abgeleitet ist27. Dieses System verwendet Trimethoprim als Bindungsmolekül zur Stabilisierung der Destabilisierungsdomäne und ist auch eine kostengünstigere Alternative zu Shield-127.

Neben der Transkription von DD-Cas9 als unabhängiger Expression sind die Vorteile dieser Methode im Vergleich zu anderen induzierbaren oder bedingt kontrollierten CRISPR-Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen eine zeitlich und bedingt kontrollierte Genbearbeitung, ein geringerer Off-Target-Effekt und eine geringere Zelltoxizität4,6,7,8. Die Effizienz und Einfachheit der Shield-1/DD-Cas9-Methode ermöglicht die Generierung einer Vielzahl von Werkzeugen, die leicht angepasst und in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden können. Das System kann auch problemlos in In-vivo-Einstellungen verwendet werden, und es wurde gezeigt, dass Shield-1 effizient durch das Blut-Hirn-Barier eindringen kann19,25,28,29. Obwohl dieser Artikel den Einsatz der CRISPR-Cas9-Technologie zur Charakterisierung essentieller Zellgene beschreibt, könnte derselbe Ansatz leicht für die Identifizierung von Genen implementiert werden, die für das Überleben oder Fortschreiten von Tumoren erforderlich sind.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Wir danken den früheren Mitgliedern unseres Labors und Wissenschaftler Serif Senturk für die bisherige Arbeit. Wir danken Danilo Segovia für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Studie war möglich und wurde von Swim Across America und dem National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-Programm unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

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References

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Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

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