Isolasjon, kultur og adipogen induksjon av Neural Crest Original Adipose-Avledet stamceller fra periaortisk fettvev
Summary
Vi presenterer en protokoll for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av neural crest avledet fettavledede stamceller (NCADSCs) fra periaortisk fettvev av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en lett tilgjengelig kilde til ADSCs for modellering av adipogenese eller lipogenesis in vitro.
Abstract
En overdreven mengde fettvev rundt blodårene (perivaskulærfettvev, også kjent som PVAT) er forbundet med høy risiko for kardiovaskulær sykdom. ADSCer avledet fra forskjellige fettvev viser forskjellige funksjoner, og de fra PVAT har ikke vært godt karakterisert. I en nylig studie rapporterte vi at noen ADSCer i periaortisk buefettvev (PAAT) stammer fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkceller som stammer fra ektodermen.
I dette papiret beskriver vi en protokoll for å isolere rødt fluorescerende protein (RFP)-merkede NCCer fra PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og indusere deres adipogenic differensiering in vitro. Kort sagt, stromal vaskulær fraksjon (SVF) er enzymatically dissosiert fra PAAT, og RFP+ neural crest avledede ADSCs (NCADSCs) er isolert av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). NCADSCs differensiere til både brune og hvite adipocytter, kan kryokonservert, og beholde sitt adipogene potensial for ~ 3-5 passasjer. Vår protokoll kan generere rikelig ADSCer fra PVAT for modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Dermed kan disse NCADSCs gi et verdifullt system for å studere molekylære brytere som er involvert i PVAT-differensiering.
Introduction
Forekomsten av fedme øker over hele verden, noe som øker risikoen for relaterte kroniske sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes1. PVAT omgir blodkar og er en viktig kilde til endokrine og paracrine faktorer involvert i vaskulaturfunksjon. Kliniske studier viser at høyt PVAT-innhold er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom2,3, og dens patologiske funksjon avhenger av fenotypen til bestanddelene avstolper avledede stamceller (ADSCer)4.
Selv om ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A og OP9 er nyttige cellulære modeller for å studere adipogenese eller lipogenesis5, er regulatoriske mekanismer for adipogenese forskjellig mellom cellelinjer og primære celler. ADSCs i stromal vaskulær celle fraksjon (SVF) isolert direkte fra fettvev og indusert til å skille seg inn i adipocytes mest sannsynlig rekapitulere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skjørhet, oppdrift og variasjonene i størrelse og immunfenotyper av ADSCs gjør deres direkte isolasjon utfordrende. I tillegg kan de ulike isolasjonsprosedyrene også påvirke fenotypen og adipogen potensiale til disse cellene7betydelig, og dermed understreke behovet for en protokoll som opprettholder ADSC-integritet.
Fettvev er vanligvis klassifisert som enten morfologisk og funksjonelt distinkt hvitt fettvev (WAT), eller det brune fettvevet (BAT)8, som har forskjellige ADSCs9. Mens ADSCs isolert fra perigonadal og inguinal subkutane WATs har vært preget i tidligere studier9,10,11,12, mindre er kjent om ADSCs fra PVAT som hovedsakelig består av BAT13.
I en nylig studie fant vi at en del av de bosatte ADSCene i periaortisk buefettvev (PAAT) er avledet fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkstamceller som stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus ble brukt til sporing neural crest celle utvikling16,17. Vi krysset Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP / + mus for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, der NCCer og deres etterkommere er merket med rødt fluorescerende protein (RFP) og spores lett in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode for å isolere nevrale crest avledede ADSCer (NC-avledede ADSCer eller NCADSCs) fra muse-PAAT og indusere NCADSCs til å skille seg inn i hvite adipocytter eller brune adipocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien presenterer vi en pålitelig metode for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av NCADSCs hentet fra PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet for å produsere RFP+ ADSCer. Tidligere rapporter viser at det ikke er noen signifikant forskjell i uttrykket av generelle multipotente mesenchymale stamceller (MSCer) markører i NCADSCs og ikke NCADSCs22, og at NCADSCs har et sterkt potensial til å skille seg inn i adipocytes in vitro<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ga midler til denne studien .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
