Summary

Isolasjon, kultur og adipogen induksjon av Neural Crest Original Adipose-Avledet stamceller fra periaortisk fettvev

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

Vi presenterer en protokoll for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av neural crest avledet fettavledede stamceller (NCADSCs) fra periaortisk fettvev av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en lett tilgjengelig kilde til ADSCs for modellering av adipogenese eller lipogenesis in vitro.

Abstract

En overdreven mengde fettvev rundt blodårene (perivaskulærfettvev, også kjent som PVAT) er forbundet med høy risiko for kardiovaskulær sykdom. ADSCer avledet fra forskjellige fettvev viser forskjellige funksjoner, og de fra PVAT har ikke vært godt karakterisert. I en nylig studie rapporterte vi at noen ADSCer i periaortisk buefettvev (PAAT) stammer fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkceller som stammer fra ektodermen.

I dette papiret beskriver vi en protokoll for å isolere rødt fluorescerende protein (RFP)-merkede NCCer fra PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og indusere deres adipogenic differensiering in vitro. Kort sagt, stromal vaskulær fraksjon (SVF) er enzymatically dissosiert fra PAAT, og RFP+ neural crest avledede ADSCs (NCADSCs) er isolert av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). NCADSCs differensiere til både brune og hvite adipocytter, kan kryokonservert, og beholde sitt adipogene potensial for ~ 3-5 passasjer. Vår protokoll kan generere rikelig ADSCer fra PVAT for modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Dermed kan disse NCADSCs gi et verdifullt system for å studere molekylære brytere som er involvert i PVAT-differensiering.

Introduction

Forekomsten av fedme øker over hele verden, noe som øker risikoen for relaterte kroniske sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes1. PVAT omgir blodkar og er en viktig kilde til endokrine og paracrine faktorer involvert i vaskulaturfunksjon. Kliniske studier viser at høyt PVAT-innhold er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom2,3, og dens patologiske funksjon avhenger av fenotypen til bestanddelene avstolper avledede stamceller (ADSCer)4.

Selv om ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A og OP9 er nyttige cellulære modeller for å studere adipogenese eller lipogenesis5, er regulatoriske mekanismer for adipogenese forskjellig mellom cellelinjer og primære celler. ADSCs i stromal vaskulær celle fraksjon (SVF) isolert direkte fra fettvev og indusert til å skille seg inn i adipocytes mest sannsynlig rekapitulere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skjørhet, oppdrift og variasjonene i størrelse og immunfenotyper av ADSCs gjør deres direkte isolasjon utfordrende. I tillegg kan de ulike isolasjonsprosedyrene også påvirke fenotypen og adipogen potensiale til disse cellene7betydelig, og dermed understreke behovet for en protokoll som opprettholder ADSC-integritet.

Fettvev er vanligvis klassifisert som enten morfologisk og funksjonelt distinkt hvitt fettvev (WAT), eller det brune fettvevet (BAT)8, som har forskjellige ADSCs9. Mens ADSCs isolert fra perigonadal og inguinal subkutane WATs har vært preget i tidligere studier9,10,11,12, mindre er kjent om ADSCs fra PVAT som hovedsakelig består av BAT13.

I en nylig studie fant vi at en del av de bosatte ADSCene i periaortisk buefettvev (PAAT) er avledet fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkstamceller som stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus ble brukt til sporing neural crest celle utvikling16,17. Vi krysset Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP / + mus for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, der NCCer og deres etterkommere er merket med rødt fluorescerende protein (RFP) og spores lett in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode for å isolere nevrale crest avledede ADSCer (NC-avledede ADSCer eller NCADSCs) fra muse-PAAT og indusere NCADSCs til å skille seg inn i hvite adipocytter eller brune adipocytter.

Protocol

Dyreprotokollen er gjennomgått og godkjent av Dyreomsorgskomiteen ved Shanghai Jiao Tong University. 1. Generasjon av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mus Kryss Wnt-1 Cre+/- mus16 med Rosa26RFP/+ mus18 for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. Husmus under en 12 t lys /mørk syklus i et patogenfritt anlegg ved 25 °C og 45 % fuktighet til de er 4–8 uker gamle. …

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, fikk vi ~0,5–1,0 x 106 ANNONSEANNONSER fra 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus (48 uker gammel, mann eller kvinne). Flytskjemaet for samling av PAAT fra mus presenteres i figur 1. Morfologien til NCADSCs var lik ADSC fra andre mus fett vev. De kultiverte NCADSCs nådde 80–90% samflyt etter 7-8 dager med kultur, og NCADSCs hadde en utvidet fibroblast-lignende morfologi (<strong …

Discussion

I denne studien presenterer vi en pålitelig metode for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av NCADSCs hentet fra PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet for å produsere RFP+ ADSCer. Tidligere rapporter viser at det ikke er noen signifikant forskjell i uttrykket av generelle multipotente mesenchymale stamceller (MSCer) markører i NCADSCs og ikke NCADSCs22, og at NCADSCs har et sterkt potensial til å skille seg inn i adipocytes in vitro<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ga midler til denne studien .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

References

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).

Play Video

Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

View Video