Summary
Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.
Abstract
Uma quantidade excessiva de tecido adiposo ao redor dos vasos sanguíneos (tecido adiposo perivascular, também conhecido como PVAT) está associada a um alto risco de doenças cardiovasculares. Os ADSCs derivados de diferentes tecidos adiposos apresentam características distintas, e os do PVAT não foram bem caracterizados. Em um estudo recente, relatamos que alguns ADSCs no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) descendem das células da crista neural (NCCs), uma população passageira de células migratórias originárias do ectoderm.
Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar AS NCCs vermelhas fluorescentes (RFP) rotuladas pelo PAAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos e indução de sua diferenciação adipogênica in vitro. Resumidamente, a fração vascular estromal (SVF) é enzimáticamente dissociada do PAAT, e os ADSCs derivados da crista neural RFP+ neural (NCADSCs) são isolados pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os NCADSCs se diferenciam tanto em adipócitos marrons quanto brancos, podem ser crioreservadoss e manter seu potencial adipogênico para ~3-5 passagens. Nosso protocolo pode gerar ADSCs abundantes a partir do PVAT para modelar adipogênese PVAT ou lipogênese in vitro. Assim, esses NCADSCs podem fornecer um sistema valioso para estudar os interruptores moleculares envolvidos na diferenciação de PVAT.
Introduction
A prevalência de obesidade está aumentando em todo o mundo, o que aumenta o risco de doenças crônicas relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares e diabetes1. PvAT envolve vasos sanguíneos e é uma das principais fontes de fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na função vasculatura. Estudos clínicos mostram que o alto teor de PVAT é um fator de risco independente de doenças cardiovasculares2,3, e sua função patológica depende do fenótipo das células-tronco derivadas de adiposos constituintes (ADSCs)4.
Embora linhas celulares ADSC como a murina 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sejam modelos celulares úteis para estudar adipogênese ou lipogênese5,os mecanismos regulatórios para adipogênese diferem entre linhas celulares e células primárias. Os ADSCs na fração de célulavascular estrônita (SVF) isolaram-se diretamente dos tecidos adippose e induzidos a diferenciar em adipócitos provavelmente recapitulando na adipogênese vivo e lipogênese6. No entanto, a fragilidade, a flutuação e as variações de tamanho e imunofenótipos dos ADSCs tornam seu isolamento direto desafiador. Além disso, os diferentes procedimentos de isolamento também podem afetar significativamente a capacidade potencial fenótipo e adipogênica dessas células7,enfatizando assim a necessidade de um protocolo que mantenha a integridade do ADSC.
O tecido adiposo é tipicamente classificado como o tecido adiposo branco morfologicamente e funcionalmente distinto (WAT), ou o tecido adiposo marrom (BAT)8, que abriga ADSCs distintos9. Embora as ADSCs isoladas de WATs subcutâneos e subcutâneos foram caracterizadas em estudos anteriores9,10,11,12, menos se sabe em relação aos ADSCs da PVAT que é composto principalmente por BAT13.
Em um estudo recente, descobrimos que uma parte dos ADSCs residentes no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) são derivados de células de crista neural (NCCs), uma população transitória de células progenitoras migratórias que se originam do ectoderm14,15. Os camundongos transgênicos Wnt1-Cre foram usados para rastrear o desenvolvimento de células de crista neural16,17. Cruzamos os mouses Wnt1-Cre+ com ratos Rosa26RFP/+ para gerar O Cre Wnt-1+/-; Os camundongos Rosa26RFP/+, nos quais as NCCs e seus descendentes são rotulados com proteína fluorescente vermelha (RFP) e são facilmente rastreados in vivo e in vitro15. Aqui, descrevemos um método para isolar adsCs derivados da crista neural (ADSCs derivados de NC, ou NCADSCs) do PAAT do mouse e induzir os NCADSCs a diferenciar em adipócitos brancos ou adipócitos marrons.
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Protocol
O protocolo animal foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Xangai Jiao Tong.
1. Geração de Wnt-1 Cre+/-; Ratos Rosa26RFP/+
- Cross Wnt-1 Cre+/- mouses16 com rosnado Rosa26RFP/+ 18 para gerar Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Ratos domésticos um ciclo claro/escuro de 12h em uma instalação livre de patógenos a 25 °C e 45% de umidade até que tenham de 4 a 8 semanas de idade.
2. Dissecação do PAAT
NOTA: Veja a Figura 1.
- Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas (por exemplo, tesoura cirúrgica, fórceps padrão e tesouras e fórceps microcirúrgicos) por autoclaving a 121 °C por 30 min.
- Prepare o meio de digestão (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] contendo 2 mg/mL colagenase tipo I). Prepare o meio cultural (HDMEM contendo 10% de soro bovino fetal [FBS] e 1% v/v penicilina-estreptomicina [PS]). Esterilizar usando um filtro de seringa de 0,22 μm antes de usar.
- Esterilizar os reagentes da cultura celular usando UV, etanol, filtração ou vapor, conforme apropriado.
- Prepare uma placa de Petri com a Solução Salina Balanceada (HBSS) de Hanks e um tubo cônico de 15 mL com 10 mL de HBSS complementado com 1% v/v de solução PS. Mantenha os dois no gelo.
- Anestesiar os camundongos15 com isoflurano e sacrifício por luxação cervical. Mergulhe os corpos em um béquer cheio de 75% de álcool (200 mL) por 5 min para esterilizar a superfície da pele.
- Corte e separe a pele no abdômen e corte ao longo da linha média ventral da pélvis para o pescoço. Abra o abdômen e mova o fígado para expor o diafragma19.
- Corte o diafragma e as costelas em ambos os lados da linha média e exponha o coração e os pulmões descascando as costelas.
- Remova o pulmão e o timo e extrai o PAAT junto com a aorta e o coração.
- Corte a aorta na raiz aórtica para remover o coração. Faça um corte entre o arco aórtico e a aorta descendente e separe cuidadosamente o tecido adiposo ao redor de ambas as estruturas e as artérias carótidas comuns da esquerda e direita da parede torácica posterior. Transfira o tecido para o tampão HBSS gelado na placa de Petri.
- Usando fórceps estéreis, remova o máximo da vasculatura (por exemplo, aorta, artérias carótidas comuns e outras vasculaturas pequenas) e fáscia possível, e transfira o tecido adiposo para os tubos Eppendorf de 2 mL contêm 0,5 mL tampão HBSS frio no gelo.
3. Isolamento do SVF
Colete o PAAT de 5-6 camundongos em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 1 mL recém-preparado meio de digestão e picar o tecido usando tesoura cirúrgica em um tubo Eppendorf à temperatura ambiente (RT).
- Transfira o mix para tubos de 50 mL contendo 9 mL do meio de digestão. Homogeneize os tecidos canalizando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL 10x.
- Incubar os tubos a 37 °C com constante oscilação a 100 rpm por 30-45 min e verificar a cada 5-10 min para evitar a sobredigestão. Isso é fundamental para melhorar a viabilidade celular e o rendimento.
NOTA: Uma boa digestão tecidual resultará em um tecido adiposo amarelo claro homogêneo que é visível a olho nu ao girar suavemente o tubo. - Pare a digestão adicionando 5 mL de HDMEM contendo 10% de FBS e 1% v/v PS na RT e misture bem com tubos.
- Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min na RT. O SVF será visível como uma pelota marrom. Cuidadosamente aspirar os adipócitos flutuantes e decantar o supernatante restante sem perturbar o SVF. Dissolva a pelota SVF em 10 mL de meio cultural e filtre através de um filtro de células de 70 μm.
- Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min, remova o supernatant e suspenda suavemente a pelota em 5 mL de tampão de lise eritropócito em um tubo cônico de 15 mL por 10 min na RT.
- Pare a reação adicionando 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS. Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min a 4 °C, remova o supernatante e resuspenda a pelota em 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS.
- Centrífuga simê as células novamente a 500 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatant e resuspenda a pelota em 5 mL de cultura média em um tubo conical de 15 mL a 4 °C.
- Após uma rodada final de centrífuga (500 x g por 5 min a 4 °C), resuspender as células pelleted em 5 mL de tampão FACS (PBS contendo 10% FBS, 100 unidades/mL DNA I, e 1% v/v PS) no gelo, e contar as células com hemocilômetro.
4. Isolamento de NCADSCs por FACS
- Configure e otimize o aparelho celular seguindo o manual de instruções. Selecione o bico de 100 μm, esterilize os tubos de coleta, instale o dispositivo de coleta necessário e configure os fluxos laterais20.
- Recomenda-se um laser amarelo/verde de 561 nm e filtro óptico 579/16 para triagem de células RFP+. Realize a compensação usando o controle negativo e os controles positivos manchados únicos. Veja a Figura 2A para o esquema de gating.
- Filtrar as células através de um filtro de 40 μm, centrífuga em 500 x g por 5 min, e resuspender as células em 2 mL de tampão FACS a uma densidade de 0,5-1 x 107/mL. Transfira as células para tubos de poliestireno traseiro redondo de 5 mL claramente rotulados e carregue para o sorter.
- Execute o tubo amostral experimental a 4 °C, ligue as placas de deflexão e classifique em um tubo cônico de 15 mL pré-revestido com RPMI contendo 1% fbs e 1% v/v PS.
NOTA: Proteja as amostras de luz forte para minimizar o saque rfp.
5. Cultura dos NCADSCs
- Coloque as células classificadas a uma densidade de 5.000 células/cm2 em uma placa de cultura de 12 poços em meio de cultura completa e incuba a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 para 20-24 h.
- Remova o meio de cultura, lave as células com PBS pré-aquecidos (37 °C) para remover detritos celulares e adicionar meio de cultura fresca.
- Uma vez que as células são de 80 a 90% de confluentes, digerir a monocamada usando uma solução EDTA de tentação de 0,25% a 37 °C em uma incubadora por 3-5 min, e neutralize com 2 mL de meio cultural.
- Centrífuga sem células colhidas por 15 min a 250 x g na RT, remova o supernatante e resuspenda as células em 1 mL de meio cultural. Conte as células com um hemocímetro.
- Sementes as células em uma placa de cultura de 12 poços na densidade de 5.000 células/cm2.
- Resuspender as células remanescentes em meio cultural contendo 10% de DMSO, congelar e armazenar nitrogênio líquido.
6. Indução adipogênica de NCADSCs
- Induzir diferenciação adipogênica dos NCADSCs em 80-90% de confluência e condições culturais padrão21.
- Para indução adipogênica marrom, primeiro trate as células cultivadas com meio de indução adipogênica marrom (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1μM/L dexamethasona, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine e 1 μg/mL insulina) para 2 dias. Lave as células com PBS 2x e substitua por meio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodotilina e 1 μg/mL insulina). Troque esse meio a cada 2 dias para um total de 3-5x.
- Para indução adipogênica branca, primeiro trate as células com meio de indução adipogênica branca (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexametasona e 1 μg/mL insulina) por 2 dias. Lave as células com PBS 2x e substitua por meio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS e 1 μg/mL insulina). Troque esse meio a cada 2 dias para um total de 3-5x.
- Analise as células adipogênicas conforme apropriado.
NOTA: Seja gentil ao lavar as células com PBS. Adipócitos diferenciados podem facilmente lavar.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito acima, obtivemos ~0,5-1.0 x 106 ADSCs de 5-6 Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+ (48 semanas, homem ou mulher).
O fluxo grama de coleta de PAAT de camundongos é apresentado na Figura 1. A morfologia dos NCADSCs era semelhante ao ADSC de outros tecidos adiposos de camundongos. As NCADSCs cultivadas atingiram 80-90% de confluência após 7-8 dias de cultura, e os NCADSCs tiveram uma morfologia expandida semelhante ao fibroblasto(Figura 2B,C).
Para confirmar ainda que os NCADSCs tinham potencial adipogênico, a diferenciação dos NCADSCs em adipócitos brancos ou marrons foi induzida. A coloração vermelha do óleo foi usada para detectar os adipócitos maduros(Figura 2). Os NCADSCs apresentaram forte potencial adipogênico tanto para adipócitos brancos quanto marrons após a indução. Os adipócitos maduros foram observados após 8 dias de indução adipogênica branca ou marrom, com mais de 60% das NCADSCs mostrando diferenciação adipogênica(Figura 2D,F,H). Prolongar o tempo de indução adipogênica melhorou a taxa de colheita de adipócitos maduros (dados não mostrados). Os NCADSCs reduziram consideravelmente o potencial adipogênico após a passagem(Figura 2E,G,H).
O PCR em tempo real imunoaborreto e quantitativo (qRT-PCR) (ver Arquivo Suplementar 1 para primers usados) provou que os níveis de expressão de proteínas e genes relativos específicos de adipocito (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) nas DCADSCs adipogenicamente diferenciadas aumentaram significativamente após 8 dias de indução adipogênica branca(Figura 3A,B). Os resultados qRT-PCR mostraram que a indução de genes específicos de adipocito (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) e genes específicos do adipocito marrom (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) aumentou significativamente em 8 dias de indução adipogênica marrom de NCADSCs (Figura 3B,C,D).
Figura 1: Gráfico de fluxo de coleta de PAAT de camundongos. (A)anestesiar e sacrificar o Cre Wnt-1+/-; Rosa26RFP/+ camundongos e realiza dissecação longitudinal do camundongo para expor coração e pulmões; (B) Remova os pulmões e o timo; (C) Expor PAAT, arco aorta e coração; (D) Remova PVAT, aorta e coração em tampão HBSS pré-refrigerado; (E) Colher PAAT e transferir para o buffer HBSS pré-refrigerado. H = Coração; AA = Arco aorta; T = Timo; L = Pulmão. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Diferenciação adipogênica de NCADSCs isolados do PAAT. (A)Esquema geral de gating para caracterização e classificação de populações ncadscs (RFP). (B) Imagens de microscópio de fluorescência mostram que os NCADSCs aderiram e expandiram após 96 h semeados em uma placa de cultura de 12 poços. (C-G) Imagens representativas mostrando que o óleo vermelho O manchado NCADSCs do PAAT após indução adipogênica. (C) Controle (sem indução). (D) NCADSCs primários e (E) DCADSCs com passagem de 3x após 10 dias de indução adipogênica branca. (F) NCADSCs primários e (G) 3x-passaged NCADSCs após 10 dias de indução adipogênica marrom. (H) Resultados estatísticos da área de coloração vermelha do óleo das NCADSCs principais e 3x passagens pelo PAAT após 8 dias de indução adipogênica. n = 6. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (DP). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Caracterização da indução adipogênica branca e marrom de NCADSCs. (A)Imunoblot mostrando níveis de expressão de proteínas específicas de adipocito (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) nas NCADSCs adipogenicamente diferenciadas brancas. (B) resultados qRT-PCR mostrando a indução de genes específicos de adipocito, Cebp/α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 nas NCADSCs adipogenicamente diferenciadas brancas e pardas. (C) resultados qRT-PCR mostrando a indução de genes específicos do adipocito marrom, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16 nas NCADSCs adipogenicamente diferenciadas brancas e marrons. Os níveis de expressão foram normalizados em relação ao HPRT e medidos pelo método Ct (CT). Resultado representativo de n = 3 experimentos independentes. Os valores são expressos como média ± SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD. SD.Unpaired 2-tailed Student t-test foi usado para comparações entre os dois grupos. *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Arquivo Suplementar 1. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).
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Discussion
Neste estudo, apresentamos um método confiável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de NCADSCs extraídos do PVAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos transgênicos projetados para produzir RFP+ ADSCs. Relatórios anteriores mostram que não há diferença significativa na expressão de marcadores de células-tronco mesenquinais multipotentes gerais (MSCs) em NCADSCs e não NCADSCs22, e que os NCADSCs têm um forte potencial para diferenciar em adipócitos in vitro15,22,23. Assim, os NCADSCs isolados com este protocolo devem ser adequados para a maioria dos estudos da ADSC.
A vantagem do método atual é que o repórter fluorescente inerente nas NCADSCs transgênicas torna o processo de isolamento simples e econômico sem a necessidade de anticorpos ou FACS baseados em sondas, ou classificação de células magnéticas ativadas24. Além disso, a intensidade de fluorescência do RFP é mais forte que a FITC, o que melhora ainda mais a eficiência do FACS.
A chave para este protocolo é a utilização de camundongos jovens. Embora camundongos mais velhos e maiores possam produzir uma maior quantidade de tecido adippose, a proporção de adipócitos derivados da NC no PAAT diminui com a idade porque as NCCs contribuem principalmente para o desenvolvimento precoce do PAAT15. Assim, o potencial adipogênico dessas células diminui com a idade. Com base em nossos experimentos, a janela de tempo ideal para o isolamento ncadsc em camundongos é de 4 a 8 semanas.
Nosso método é simples, prático e pode gerar ADSCs abundantes para o estudo da adipogênese pvat ou lipogênese in vitro, e testar novas drogas contra obesidade e doenças cardiovasculares. Além disso, os NCADSCs do Wnt-1 Cre+/-; Os camundongos Rosa26RFP/+ também podem ser um sistema in vitro eficaz para outros campos de pesquisa. No entanto, várias ressalvas permanecem: Primeiro, essas células são mais sensíveis e frágeis do que as linhas de adipocito imortalizada. Em segundo lugar, sua alta taxa de proliferação e diferenciação adipogênica é contrariada pelo fato de que eles tendem a perder seu potencial adipogênico após um máximo de cinco passagens.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1312504), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81970378, 81670360, 81870293) e Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17411971000, 17140902402) forneceram os fundos para este estudo .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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