Summary
我们提出了从Wnt-1 Cre+/-的围阴脂肪组织中提取神经峰衍生的干细胞（NCADSCs）的分离、培养和异位诱导方案;罗莎26RFP/+小鼠。NCADSCs 是 ADSC 的一个容易获取的来源，用于在体外模拟脂肪发生或脂肪发生。
Abstract
血管周围过多的脂肪组织（血管内脂肪组织，也称为PVAT）与心血管疾病的高风险有关。从不同的脂肪组织衍生的ADSCs表现出明显的特征，而来自PVAT的ADSC的特征并不明显。在最近的一项研究中，我们报告说，围阴弓脂肪组织（PAAT）中的一些ADSCs从神经峰细胞（NcCs）下降，这是一种来自外端的迁移细胞的瞬态群体。
在本文中，我们描述了从Wnt-1 Cre+/-的PAAT中分离红色荧光蛋白（RFP）标记的NCC的协议;Rosa26RFP/+小鼠在体外诱导其异体分化。简单地说，基质血管分数（SVF）与PAAT酶分离，RFP+神经波峰衍生的ADSCs（NCADSCs）通过荧光活化细胞分选（FACS）分离。NCADSC 分化成棕色和白色的脂肪细胞，可以冷冻保存，并保留其可吸波潜力的 +3⁄5 段落。我们的协议可以从PVAT生成大量的ADSCs，用于在体外模拟PVAT腺化或脂肪发生。因此，这些NCADSCs可以为研究PVAT分化所涉及的分子开关提供有价值的系统。
Introduction
全世界肥胖症的患病率正在上升，这增加了患心血管疾病和糖尿病等相关慢性病的风险。PVAT环绕血管，是血管功能中涉及的内分泌和副项的主要来源。临床研究表明，高PVAT含量是心血管疾病2、3的独立危险因素，其病理功能取决于组成脂肪衍生干细胞（ADSCs）4的表型。
虽然ADSC细胞系，如鼠3T3-L1，3T3-F442A和OP9是研究腺生成或脂肪发生5的有用细胞模型，但细胞系和原细胞之间，腺化的调控机制不同。基质血管细胞部分（SVF）中的ADSCs直接从脂肪组织分离出来，并诱导分化成腺细胞，最有可能在体内重述脂肪发生和脂肪发生6。然而，ADSCs的脆弱性、浮力以及大小和免疫表型的变化使得它们直接隔离具有挑战性。此外，不同的分离程序也会显著影响这些细胞7的表型和增生电位能力，从而强调需要一种维持ADSC完整性的协议。
脂肪组织通常被归类为形态和功能上截然不同的白色脂肪组织（WAT），或棕色脂肪组织（BAT）8，其中含有不同的ADSCs9。虽然在以前的研究中，从围肠和肠下WAT分离的ADSCs在以前的研究中具有特征9，10，11，12，较少知道从PVAT的ADSC，主要由BAT13组成。
在最近的一项研究中，我们发现，围阴弓脂肪组织（PAAT）中一部分常驻ADSC来自神经峰细胞（NcCs），这是一种来自前体14、15的迁移祖细胞的瞬态种群。Wnt1-Cre转基因小鼠用于追踪神经峰细胞发育16、17。我们越过Wnt1-Cre+小鼠与罗莎26RFP/+小鼠生成Wnt-1 Cre[/-;Rosa26RFP/+小鼠，其中NcCs及其后代被标记与红色荧光蛋白（RFP），并很容易跟踪在体内和体外15。在这里，我们描述了一种从小鼠PAAT中分离神经峰衍生ADSCs（NC衍生ADSCs，或NCADSCs）的方法，并诱导NcADSCs分化成白色脂肪细胞或棕色腺细胞。
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Protocol
动物规程经上海交通大学动物护理委员会审查批准。
1. 生成 Wnt-1 Cre+/-;罗莎26RFP/+小鼠
- 交叉 Wnt-1 Cre+/-小鼠16与 Rosa26RFP/+小鼠18生成 Wnt-1 Cre+/-;罗莎26RFP/+小鼠。在25°C和45%湿度的无病原体设施中，在12小时光/暗循环下，将小鼠在4~8周大。
2. PaAT的解剖
注：参见图1。
- 通过在 121°C 下高压灭菌 30 分钟，对所有手术工具（例如手术剪刀、标准钳子、显微手术剪刀和钳子）进行消毒。
- 准备消化介质（高葡萄糖Dulbeco的改性鹰培养基[HDMEM]含有2mg/mL胶原酶I型）。准备培养基（HDMEM含有10%胎儿牛血清[FBS]和1%v/v青霉素-链霉素[PS]）。使用前使用0.22μm注射器过滤器进行消毒。
- 酌情使用紫外线、乙醇、过滤或蒸汽对细胞培养试剂进行消毒。
- 准备一个培养皿与汉克斯的平衡盐水溶液（HBSS）和15 mL锥形管与10 mL的HBSS补充1%v/v PS溶液。两者都放在冰上
- 用异胶麻醉小鼠15麻醉，并因宫颈脱位而牺牲。将身体浸入装满 75% 酒精 （200 mL） 的烧杯中 5 分钟，对皮肤表面进行消毒。
- 剪下腹部的皮肤，沿着骨盆中线切到颈部。打开腹部并移动肝脏以暴露隔膜19。
- 切下中线的隔膜和肋骨，通过剥回肋骨来暴露心脏和肺部。
- 取出肺和胸腺，并提取PAAT与主塔和心脏。
- 切断主动脉根部以切除心脏。在主动脉拱门和下行主动脉之间切开，并小心地将两种结构周围的脂肪组织以及左右常见胡萝卜动脉与后胸壁分开。将组织转移到培养皿中的冰冷的HBSS缓冲液中。
- 使用无菌钳子，尽可能去除血管（例如，主动脉、常见胡萝卜动脉和其他小血管）和筋膜，并将脂肪组织转移到含有0.5 mL冰冷HBSS缓冲液的2 mL Eppendorf管中。
3. SVF 的隔离
将5-6只小鼠的PAAT收集到一个含有1 mL新鲜制备的消化介质的2 mL微离心管中，并在室温（RT）下用手术剪刀在Eppendorf管中切碎组织。
- 将混合物转移到含有9 mL消化介质的50 mL管中。使用 1 mL 移液器 10x 上下移液，使组织均匀化。
- 在 37°C 下孵育管，在 100 rpm 下持续摇动 30-45 分钟，每 5~10 分钟检查一次，以防止过度消化。这对于提高细胞活力和产量至关重要。
注：良好的组织消化将导致一个均匀的，浅黄色的脂肪组织，肉眼在轻轻旋转管时可见。 - 在 RT 时加入包含 10% FBS 和 1% v/v PS 的 5 mL HDMEM，并通过移液很好地混合，从而停止消化。
- 在RT处将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟。SVF 将作为棕色颗粒可见。小心地吸出漂浮的脂肪细胞，并在不干扰SVF的情况下倒出剩余的上清液。将SVF颗粒溶解在10 mL培养基中，并通过70μm细胞滤网过滤。
- 将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，去除上清液，在15 mL锥形管中轻轻将颗粒重新悬浮在5 mL的红细胞赖沙液缓冲液中，在RT处10分钟。
- 加入含有1%FBS的1xPBS的10 mL，停止反应。在4°C下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，去除上清液，并将颗粒重新悬浮在含有1%FBS的1x PBS的10 mL中。
- 在4°C下以500 x g再次将细胞离心5分钟。在4°C的15 mL锥形管中取出上清液，在5 mL培养基中重新悬浮颗粒。
- 最后一轮离心后（500 x g在 4°C 下 5 分钟），在 5 mL 的 FACS 缓冲液（包含 10% FBS、100 单位/mL DNA I 和 1% v/v PS）的 PBS 中重新悬浮于 5 mL 的细胞，并用血细胞计对细胞进行计数。
4. 外地资产管制系统隔离了国家、全球和发援中心
- 按照说明书设置和优化单元分拣机。选择100μm喷嘴，对收集管进行消毒，安装所需的收集装置，并设置侧流20。
- 建议使用 561 nm 黄色/绿色激光和光学滤光片 579/16 对 RFP+电池进行分类。使用负控制和单色正控制执行补偿。有关浇注方案，请参阅图 2A。
- 通过40μm滤网过滤细胞，在500 x g下离心5分钟，以0.5×1 x 107/mL的密度将细胞重新悬浮在2 mL的FACS缓冲液中。将细胞转移到明确标记的 5 mL 圆形底部聚苯乙烯管中，然后加载到分拣机中。
- 在 4°C 下运行实验样品管，打开偏转板，然后分类成 15 mL 锥形管预涂有 RPMI，其中包含 1% FBS 和 1% v/v PS。
注：保护样品免受强光照射，以尽量减少 RFP 淬火。
5. 国家、艾滋病委员会的文化
- 在12孔培养基中，在12孔培养板中以5，000个细胞/cm2的密度将分类细胞板板，并在潮湿环境中以37°C孵育，在5%CO2条件下孵育20-24小时。
- 去除培养基，用预热（37°C）PBS清洗细胞，以清除细胞碎片并添加新的培养基。
- 一旦细胞是80-90%的汇合，在37°C下在培养箱中用0.25%的胰蛋白酶EDTA溶液消化单层，在培养箱中3⁄5分钟，并用2mL培养基中和。
- 在RT处以250 x g将收获的细胞离心15分钟，去除上清液，并在1mL培养基中重新悬浮细胞。用血细胞计计算细胞。
- 以5000个细胞/cm2的密度在12孔培养板中播种细胞。
- 在含有10%DMSO的培养基中重新悬浮剩余的细胞，冷冻并储存在液氮中。
6. 国家发援中心具有诱导性诱导
- 在80-90%的汇合率和标准培养条件21下诱导NCADSCs的异基因分化。
- 对于棕色腺诱导，首先使用棕色腺诱导培养基（HDMEM，10%FBS，1%v/v PS，0.5 mM/L IBMX，0.1μM/L地塞米松、1 μM/L罗格列酮、10 nmol/L三碘甲状腺素和1 μg/mL胰岛素）治疗培养细胞2天。用PBS 2x清洗细胞，用新鲜介质（HDMEM，10%FBS，1%v/v PS，1 μM/L 罗格列酮，10 nmol/L三碘甲状腺素和1 μg/mL胰岛素）代替。每 2 天更改此介质，总计 3⁄5 倍。
- 对于白异体诱导，首先使用白色腺诱导介质（HDMEM，10%FBS，1%v/v PS，0.5 mM/L IBMX，0.1 μM/L二甲酮和1 μg/mL胰岛素）治疗细胞2天。用PBS 2x清洗细胞，用新鲜介质（HDMEM，10%FBS，1%v/v PS和1 μg/mL胰岛素）替换。每 2 天更改此介质，总计 3-5 倍。
- 酌情分析腺化细胞。
注意：用PBS清洗细胞时要温和。差异化的脂肪细胞可以很容易地洗掉。
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Representative Results
使用上述协议，我们从 5⁄6 Wnt-1 Cre+/-获得 ±0.5±1.0 x 106 ADSCs;Rosa26RFP/+小鼠（48周大，雄性或雌性）。
图1显示了从小鼠中收集PAAT的流程图。NCADSCs的形态与其他小鼠脂肪组织的ADSC相似。培养的NCADSC在培养7~8天后达到80-90%的汇合，而NCADSC具有扩大的成纤维细胞样形态（图2B，C）。
为了进一步确认NCADSCs具有抗性潜力，诱导了NcADSCs分化为白色或棕色脂肪细胞。油红染色用于检测成熟的脂肪细胞 （图 2）。诱导后，NCADSC对白细胞和棕色脂肪细胞表现出很强的抗性潜力。在8天白色或棕色腺诱导后观察到成熟腺细胞，超过60%的NCADSCs表现出腺基因分化（图2D，F，H）。延长腺诱导时间提高了成熟腺细胞的收获率（未显示数据）。NCADSC在通过后大大降低了抗性潜力（图2E，G，H）。
免疫镀金和定量实时PCR（qRT-PCR）（参见补充文件1用于引物）证明，在白蛋白诱导8天后，在腺基质分化的NCADSC中，腺细胞特异性相对蛋白和基因（佩里利平、PPARé、Cebp/+）的表达水平显著增加（图3A，B）。qRT-PCR结果表明，在NCADSC的棕色增生诱导8天内，脂肪细胞特异性基因（佩里利平、PPARé、Cebp/α）和棕色腺细胞特异性基因（Pgc1+、UCP-1、PPARé、PRDM16）的诱导显著增加（图3B，C，D）。
图1：从小鼠收集PAAT的流程图。（A） 麻醉和牺牲的 Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+小鼠，对小鼠进行纵向解剖，以暴露心脏和肺部;（B） 切除肺和胸腺;（C） 暴露 PAAT、大塔拱门和心脏;（D） 将 PVAT、母塔和心脏取出至预冷却的 HBSS 缓冲液中;（E） 收获PAAT并转移到预冷却的HBSS缓冲液中。H = 心脏;AA = 大塔拱门;T = 胸腺;L = 肺。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：与PAAT分离的NCADSCs的分化。(A) General gating scheme for characterizing and sorting NCADSCs (RFP) populations.（B） 荧光显微镜图像显示，在12孔培养板上播种96小时后，NCADSC会粘附并扩大。（C+G）代表性图像显示，油红色O染色从PAAT后，副生诱导的NCADSCs。（C） 控制（无感应）。（D） 初级NCADSCs和（E） 3x通过NCADSC后10天的白色腺诱导。（F） 初级 NCADSCs 和 （G） 3x 通过 NCADSC 后 10 天的棕色腺诱导.（H） 在8天腺诱导后，PAAT中初级和3倍通过NCADSC的油红染色面积的统计结果。n = 6。值表示为均值 = 标准差 （SD）。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：NcADSCs的白色和棕色腺诱导特性。（A） 在白蛋白基质分化的NCADSC中，免疫蛋白显示蛋白特定蛋白（佩里利平、PPARé®、Cebp/β）的表达水平。（B） qRT-PCR结果显示，在白色和棕色的基质分化的NCADSCs中，诱导了脂肪细胞特异性基因，Cebp/α，PPAR®，Perilipin，Fabp4。（C） qRT-PCR结果显示，在白色和棕色的异化NCADSCs中，棕色腺细胞特异性基因、Pgc1+、UCP-1、PPAR®、PRDM16的诱导。表达水平根据 HPRT 归一化，并通过 Ct （_Ct） 方法进行测量。n = 3 个独立实验的代表性结果。值表示为均值 = SD。未配对的 2 尾学生 t 检验用于两组之间的比较。*P < 0.05.请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件 1.请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
在这项研究中，我们提出了一种可靠的方法，用于从Wnt-1 Cre+/-的PVAT中提取的NCADSCs的分离、培养和异位诱导;Rosa26RFP/+转基因小鼠，旨在生产RFP+ADSC。以前的报告显示，在NCADSCs和非NCADSCs22中，一般多能性等位干细胞（MSCs）标记的表达没有显著差异，而且NCADSCs具有很强的在体外15、22、23体细胞中分化成腺细胞的潜力。因此，与该协议隔离的NCADSCs应适用于大多数ADSC研究。
该方法的优点是，转基因NCADSCs中固有的荧光检测器使分离过程简单和经济，无需抗体或基于探针的FACS，或磁性活化细胞分拣24。此外，RFP的荧光强度强于FITC，进一步提高了FACS的效率。
该协议的关键是利用幼鼠。虽然较老和较大的小鼠可以产生更多的脂肪组织，NC衍生的脂肪细胞在PAAT中的比例随着年龄的增长而减少，因为NCC主要有助于PAAT15的早期发育。因此，这些细胞的抗性潜能会随着年龄的增长而下降。根据我们的实验，在小鼠中进行NCADSC分离的最佳时间窗口为4-8周。
该方法简单实用，能产生丰富的ADSCs，用于研究PVAT腺体成因或体外脂肪发生，并测试抗肥胖症和心血管疾病的新药。此外，Nt-1 Cre+/-的NADSC;Rosa26RFP/+小鼠也可以成为其他研究领域的有效体外系统。然而，仍然存在几点注意事项：首先，这些细胞比永生的脂肪细胞线更敏感和脆弱。其次，它们的高增殖率和增殖分化被以下事实所抵消：它们往往在最多五个通道后失去其增殖潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
国家重点研发项目（2018YFC1312504），国家自然科学基金（81970378、81670360、81870293）和上海市科委（17411971000，17140902402）为本研究提供资金.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
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