Summary
우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.
Abstract
혈관을 둘러싼 지방 조직의 과도 한 금액 (주위 지방 조직, 일컬어 PVAT) 심혈 관 질환의 높은 위험과 관련 된. 상이한 지방 조직에서 유래한 ADSC는 뚜렷한 특징을 나타내며, PVAT로부터의 특징은 잘 특성화되지 않았다. 최근 연구에서, 우리는 periaortic 아치 지방 조직에 있는 몇몇 ADSCs가 보고했습니다 (PAAT) 신경 문장 세포에서 내려 (NCC), ectoderm에서 유래하는 철새 세포의 일시적인 인구.
이 백서에서는 Wnt-1 Cre+/-PAAT로부터 적색 형광 단백질(RFP)으로 표지된 NCC를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. Rosa26RFP/+ 마우스 및 시험관내에서 그들의 지방분화 분화를 유도한다. 간략하게, 기질 혈관 분획(SVF)은 PAAT로부터 효소적으로 해리되고,RFP+ 신경 문장 유래 ADSCs(NCADSCs)는 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리된다. NCADSCs는 갈색과 흰색 지방 세포로 분화하고, 저온 보존 될 수 있으며 , ~ 3-5 구절에 대한 지경 잠재력을 유지합니다. 우리의 프로토콜은 시험관 내 PVAT 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 PVAT로부터 풍부한 ADSC를 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 NCADSCs는 PVAT 분화에 관여하는 분자 스위치를 연구하기 위한 귀중한 시스템을 제공할 수 있다.
Introduction
비만의 보급은 심장 혈관 질병 및 당뇨병을 포함하여 관련 만성 질병의 리스크를 증가시키는 세계전반 증가하고 있습니다1. PVAT는 혈관을 포위하고 혈관 기능에서 관련시킨 내분비 및 paracrine 요인의 중요한 근원입니다. 임상 연구에 따르면 높은 PVAT 함량은 심혈관 질환2,3의독립적인 위험 인자이며, 그 병리학적 기능은 성분 지방 유래 줄기 세포(ADSCs)의 표현형에 따라 달라집니다 4.
뮤린 3T3-L1, 3T3-F442A 및 OP9과 같은 ADSC 세포주들은 지질발생 또는 지방발생을 연구하는 데 유용한 세포 모델이지만5,지질발생에 대한 조절 기전은 세포주와 1차 세포 간에 차이가 있다. 지체 성 혈관 세포 분획(SVF)에서 ADSCs는 지방 조직에서 직접 분리되고 지방세포로 분화하도록 유도되어 생체 내 지방형성 및 지방발생에서 가장 가능성이 높은 회생을유도한다 6. 그러나, 연약함, 부력 및 ADSCs의 크기 및 면역 표현형의 변화는 그들의 직접적인 격리를 어렵게 만듭니다. 또한, 상이한 절연 절차는 또한 이들세포의표현형 및 지방생성 전위 능력에 유의하여, 따라서 ADSC 무결성을 유지하는 프로토콜의 필요성을 강조할 수 있다.
지방 조직은 전형적으로 형태학적으로 및 기능적으로 구별되는 백색 지방 조직(WAT) 또는 갈색 지방 조직(BAT)8로분류되며, 이는 뚜렷한 ADSCs9를수용한다. 반면 아식스는 회항나달 및 인멸피하로부터 분리된 ADSC는 이전 연구에서특징이 있었지만9,10,11,12,BAT13으로주로 구성되는 PVAT로부터의 ADSCs에 대해서는 덜 알려져 있다.
최근 연구에서, 우리는 주경 아치 지방 조직 (PAAT)에 있는 RESIDENT ADSCs의 일부가 신경 문장 세포 (NCC)에서 파생된다는 것을 것을을 발견했습니다, ectoderm14,15에서유래하는 철새 전구 세포의 일시적인 인구. Wnt1-Cre 형질전환 마우스는 신경 문장 세포 개발16,17을추적하는 데 사용되었다. 우리는 Wnt-1 Cre+/- Wnt-1 Cre+/-생성Rosa26RFP/+ 마우스와 Wnt1-Cre + 마우스를 교차; Rosa26RFP/+ 마우스는 NCC와 그 후손이 적색 형광 단백질(RFP)으로 표시되어 생체 내 및 시험관 내15에서쉽게 추적됩니다. 여기서, 우리는 마우스 PAAT로부터 신경 문장 유래 ADSCs(NC-유래 ADSCs, 또는 NCADSCs)를 분리하는 방법을 설명하고 NCADSCs를 백색 지방세포 또는 갈색 지방세포로 분화하도록 유도한다.
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Protocol
동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학의 동물 관리 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. Wnt-1 Cre+/-세대; 로사26RFP/+ 마우스
- 크로스 Wnt-1 Cre+/- 마우스16 Rosa26RFP/+ 마우스18 Wnt-1 Cre+/-생성; Rosa26RFP/+ 마우스. 25°C에서 병원균이 없는 시설에서 12시간 의 빛/암흑 주기하에 마우스를 4-8주까지 습도가 높다.
2. PAAT의 해부
참고: 그림 1을참조하십시오.
- 모든 수술 도구(예: 수술 용 가위, 표준 집게, 미세 수술 가위 및 집게)를 121 °C에서 30 분 동안 오토클레이브하여 살균하십시오.
- 소화 배지(고당포도 덜베코의 변형 된 독수리 배지 [HDMEM]를 2 mg/mL 콜라게나제 타입 I을 함유합니다. 배양 배지(10% 태아 소 혈청 [FBS] 및 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신[PS]를 함유하는 HDMEM)을 준비한다. 사용하기 전에 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 살균하십시오.
- UV, 에탄올, 여과 또는 증기를 사용하여 세포 배양 시약을 적절히 살균하십시오.
- 행크스의 균형 잡힌 식염수 용액(HBSS)과 10 mL의 HBSS가 있는 15mL 원추형 튜브로 페트리 접시를 준비하세요. 얼음에 모두 보관하십시오.
- 자궁 경부 탈구에 의한 이소플루란및 희생으로 마우스15를 마취시. 75% 알코올(200 mL)으로 채워진 비커에 몸을 5분 동안 담그고 피부 표면을 살균합니다.
- 복부의 피부를 잘라내고 골반에서 목까지 복부 중간선을 따라 자른다. 복부를 열고 간을 움직여 횡격막19에노출시다.
- 다이어프램과 갈비뼈를 중간선의 양쪽에 잘라 갈비뼈를 벗겨 심장과 폐를 노출.
- 폐와 흉선제거하고 대강과 심장과 함께 PAAT를 추출합니다.
- 대동맥 뿌리에서 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다. 대동맥 아치와 내림차순 대동맥 사이의 절단을 확인하고 구조와 왼쪽 및 오른쪽 일반적인 경동맥을 후방 흉벽에서 둘러싼 지방 조직을 조심스럽게 분리합니다. 페트리 접시에 얼음 차가운 HBSS 버퍼로 조직을 전송합니다.
- 멸균 집게를 사용하여 혈관 구조 (예 : 대동맥, 일반적인 경동맥 및 기타 작은 혈관)와 근막을 가능한 한 많이 제거하고 지방 조직을 2 mL Eppendorf 튜브로 옮기면 얼음에 0.5 mL 얼음 차가운 HBS S 버퍼가 포함되어 있습니다.
3. SVF의 격리
5-6 마우스의 PAAT를 1 mL의 미세원원원지 튜브로 모아 1 mL 신선하게 제조된 소화 배지를 함유하고 실온(RT)에서 Eppendorf 튜브에 외과용 가위를 사용하여 조직을 다듬는다.
- 혼합물을 소화 배지의 9 mL을 포함하는 50 mL 튜브로 옮김. 1 mL 파이펫 10x로 위아래로 파이펫팅하여 조직을 균질화합니다.
- 튜브를 37°C에서 30-45분 동안 100 rpm에서 지속적으로 흔들어 놓고 5-10분마다 확인하여 과다 소화를 방지합니다. 이것은 세포 생존력과 수율을 향상시키는 데 중요합니다.
참고 : 좋은 조직 소화는 튜브를 부드럽게 소용돌이치면 육안으로 볼 수있는 균일하고 밝은 노란색 지방 조직을 초래할 것입니다. - RT에서 10% FBS와 1% v/v PS를 함유한 HDMEM 5mL를 추가하여 소화를 멈추고 파이펫팅을 통해 잘 섞어보십시오.
- RT에서 5분 동안 500 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다. SVF는 갈색 펠릿으로 표시됩니다. 조심스럽게 부동 지방세포를 흡인하고 SVF를 방해하지 않고 나머지 상급을 decant. SVF 펠릿을 배양 배지의 10 mL에 용해시키고 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.
- 세포 현탁액을 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상복부를 제거하고, RT에서 10분 동안 15 mL 원엽 튜브에서 적혈구 용해 완충액 5 mL에서 펠릿을 부드럽게 재중단시켰다.
- 1% FBS를 포함하는 1x PBS의 10 mL를 추가하여 반응을 중단합니다. 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 세포 현탁액을 원심분리하고, 상체를 제거하고, 1% FBS를 함유하는 1x PBS의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단한다.
- 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 다시 세포를 원심 분리합니다. 상류를 제거하고 4°C에서 15 mL 원엽 튜브에서 배양 배지의 5 mL에서 펠릿을 다시 중단시켰다.
- 원심 분리의 최종 라운드 후 (500 x g 에 대 한 5 분 4 °C에서), FACS 버퍼의 5 mL에 펠 릿 세포를 다시 일시 중단 (PBS 포함 10% FBS, 100 단위/mL DNA I, 그리고 1% v/v PS) 얼음에, 그리고 hemocytometer로 세포를 계산.
4. FACS에 의한 NCADSCs의 격리
- 사용 설명서에 따라 셀 선별기를 설정하고 최적화합니다. 100 μm 노즐을 선택하고, 수집 튜브를 살균하고, 필요한 수집 장치를 설치하고, 측면스트림(20)을설정한다.
- RFP+ 셀을 분류하는 데 는 561 nm 노란색/녹색 레이저 및 광학 필터 579/16이 권장됩니다. 음의 대조군 및 단일 염색 된 양성 대조군을 사용하여 보상을 수행합니다. 게이팅 방식에 대한 그림 2A를 참조하십시오.
- 40 μm 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고, 5분 동안 500 x g에서 원심분리기를 하고, 0.5-1 x 107/mL의 밀도로 FACS 버퍼의 2 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 셀을 명확하게 라벨이 붙은 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 선별기로 로드합니다.
- 실험용 샘플 튜브를 4°C에서 실행하고 편향 플레이트를 켜고 1% FBS 및 1% v/v PS를 포함하는 RPMI로 미리 코팅된 15mL 원추형 튜브로 분류합니다.
참고: RFP 담금질을 최소화하기 위해 강한 빛으로부터 시료를 보호하십시오.
5. NCADSCs의 문화
- 12웰 배양판에서 5,000개의세포/cm2의 밀도로 정렬된 세포를 완전한 배양 배지에서 플레이트하고 20-24시간 동안 5%CO2로 습한 분위기에서 37°C에서 배양한다.
- 배양 배지를 제거하고, 미리 따뜻해진(37°C) PBS로 세포를 세척하여 세포 찌꺼기를 제거하고 신선한 배양 배지를 첨가한다.
- 일단 세포가 80-90% 수렴되면, 3-5분 동안 인큐베이터에서 37°C에서 0.25% 트립신 EDTA 용액을 사용하여 단층을 소화하고, 배양 배지의 2 mL로 중화한다.
- RT에서 250 x g에서 15 분 동안 수확 된 세포를 원심 분리하고 상체를 제거하고 배양 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다. 혈세포계로 세포를 계산합니다.
- 5,000 세포 /cm2의밀도에서 12 웰 배양 플레이트에서 세포를 종자.
- 10% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 나머지 세포를 재중단하고, 동결시키고, 액체 질소에 저장한다.
6. NCADSCs의 지광 유도
- 80-90% 동률 및 표준 배양 조건21에서NCADSCs의 지광 분화를 유도한다.
- 갈색 지방 흡입의 경우 먼저 배양 된 세포를 갈색 지방 흡입 매체 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 0.5 mM / L IBMX, 0.1 μM / L 덱사메타 손, 1 μM / L 로시글리타존, 10 nmol / L triiodothyronine, 10 nmol / L triiodothyronine, 10 nmol / L triiodothyronines. PBS 2x로 세포를 세척하고 신선한 매체로 대체하십시오 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 1 μM / L 로시글리타존, 10 nmol / L 트리오도티로닌, 1 μg / mL 인슐린). 이 매체를 2일마다 총 3-5배씩 변경합니다.
- 백색 지방 흡입의 경우, 먼저 백색 지방 흡입 매체 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 0.5 mM / L IBMX, 0.1 μM / L 덱사메타손 및 1 μg / mL 인슐린)로 세포를 2 일 동안 치료하십시오. PBS 2x로 세포를 세척하고 신선한 매체로 대체하십시오 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS 및 1 μg / mL 인슐린). 이 매체를 2일마다 총 3-5배씩 변경합니다.
- 적절 한 지방 세포를 분석.
참고: PBS로 셀을 세척할 때는 부드럽게 하십시오. 차별화 된 지방 세포는 쉽게 씻을 수 있습니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 5-6 Wnt-1 Cre+/-에서~ 0.5-1.0 x 106 ADSC를 얻었습니다. Rosa26RFP/+ 마우스 (48 주 오래 된, 남성 또는 여성).
마우스에서 PAAT 컬렉션의 흐름도는 그림 1에표시됩니다. NCADSCs의 형태는 다른 마우스 지방 조직으로부터의 ADSC와 유사하였다. 배양된 NCADSCs는 7-8일 의 배양 후 80-90%의 동률에 도달했으며, NCADSCs는 섬유아세포와 유사한 형태를 확장하였다(그림2B,C).
NCADSCs가 지멸 잠재력을 가지고 있음을 추가로 확인하기 위해, NCADSCs를 백색 또는 갈색 지방세포로 분화시키는 것이 유도되었다. 오일 적색 염색은 성숙한 지방세포를 검출하기 위해사용되었다(도 2). NCADSCs는 유도 후 백색 및 갈색 지방 세포 모두에 대한 강력한 지중 잠재력이 나타났습니다. 성숙한 지방세포는 백색 또는 갈색 지방흡입 유도의 8일 후에 관찰되었고, 엔씨ADSCs의 60% 이상이 지방분화를나타냈다(도 2D, F,H). 지방 흡입 시간을 연장하는 것은 성숙한 지방 세포의 수확 속도를 향상시켰습니다 (데이터가 표시되지 않음). NCADSCs는 통과 후 지광 잠재력을 크게 감소시켰습니다(그림 2E, G, H).
면역블롯및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR 참조) (사용된 프라이머에 대한 보충 파일 1 참조) 지방세포 특이적 상대 단백질 및 유전자(Perilipin, PPARγ, Cebp/α)의 발현 수준이 8일 후 백색 지방분화 유도(그림3)의8일 후에 유의하게 증가하였다. qRT-PCR 결과는 지방세포 특이적 유전자(페리리핀, PPARγ, Cebp/α) 및 갈색 지방세포 특이적 유전자(Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16)의 유도가 NCADSCs의 갈색 지광유발 유도 8일 만에 유의하게 증가한다는 것을보여주었다(그림3,C.C.)
그림 1: 마우스에서 PAAT 컬렉션의 흐름 도표. (A)Wnt-1 Cre+/-마취 및 희생; Rosa26RFP/+ 마우스및 마우스의 세로 해부를 수행하여 심장 및 폐를 노출시키고; (b)폐와 흉선 제거; (C)PAAT, 대공 아치 및 심장을 노출; (D)PVAT, 대불, 심장을 미리 냉각된 HBSS 버퍼로 제거합니다. (E)PAAT를 수확하고 미리 냉각된 HBSS 버퍼로 옮김. H = 심장; AA = 오르타 아치; T = 흉선; L = 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PAAT로부터 분리된 NCADSCs의 인디포제닉 분화. (A)NCADSCs(RFP) 모집단을 특성화하고 분류하기 위한 일반 게이팅 방식. (B)형광 현미경 이미지는 NCADSCs가 12웰 배양 판상에 96h 파종 후 부착 및 팽창함을 보여준다. (C-G) 대표적인 이미지는 유정적 O가 지광 유도 후 PAAT로부터 NCADSCs를 염색한 것을 보여주는. (C)제어 (유도 없음). (D)백색 지방 흡입 의 10 일 후에 10 x 통과 된 NCADSCs 및(E)1 차 NCADSCs. (F)1차 NCADSCs 및(G)3x-통로 NCADSCs 는 10일 후 갈색 지광 유도를 하였다. (H)8일간의 지방 흡입 후 PAAT로부터 1차 및 3배 의 유류 적색 염색 부위의 통계적 결과. n = 6. 값은 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현됩니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NCADSCs의 백색 및 갈색 지방 흡입의 특성화. (a)백색 지방분화 NCADSCs에서 지방세포 특이적 단백질(페리리핀, PPARγ, Cebp/α)의 발현 수준을 나타내는 면역블롯. (B)qRT-PCR 결과는 백색 및 갈색 지방분화 NCADSCs에서 지방세포 특이적 유전자, Cebp/α, PPARγ, 페리핀, Fabp4의 유도를 나타낸 결과이다. (C)qRT-PCR 결과는 백색 및 갈색 지방분화 NCADSCs에서 갈색 지방세포 특이적 유전자, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16의 유도를 나타낸 결과이다. 발현 수준은 HPRT에 대해 정규화되었고 Ct(́Ct) 방법으로 측정하였다. n = 3개의 독립적인 실험의 대표적인 결과. 값은 평균 ±SD로 표현됩니다. 페어링되지 않은 2-꼬리 학생 t-시험은 두 그룹 간의 비교를 위해 사용되었다. * P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 Wnt-1 Cre+/-PVAT에서 추출된 NCADSCs의 격리, 배양 및 지방 흡입에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. RfP +ADSC를 생산하도록 설계된 Rosa26RFP/+ 형질전환 마우스. 이전 보고서에 따르면 NCADSCs 및 비 NCADSCs22에서일반적인 다능성 중간엽 줄기 세포(MSCs) 마커의 발현에 유의한 차이가 없음을 보여주고, NCADSCs는 시험관 내 지방세포로 분화할 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있음을15,22,23. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 NCADSCs는 대부분의 ADSC 연구에 적합해야 한다.
본 방법의 장점은 형질전환 NCADSCs에 내재된 형광 리포터가 항체 또는 프로브 계 FACS, 또는 자기 활성화 세포선별(24)을필요로 하지 않고 격리 공정을 간단하고 경제적으로 만든다는 점이다. 또한, RFP의 형광 강도는 FITC보다 강하여 FACS의 효율을 더욱 향상시킵니다.
이 프로토콜의 핵심은 젊은 쥐의 활용입니다. 더 오래되고 더 큰 마우스는 지방 조직의 더 많은 양을 산출할 수 있더라도, NCC가 주로 PAAT15의초기 발달에 기여하기 때문에 PAAT에 있는 NC 유래 지방세포의 비율은 나이와 함께 감소합니다. 따라서, 이 세포의 지광 잠재력은 나이로 감소합니다. 우리의 실험에 기초하여, 마우스에 있는 NCADSC 격리를 위한 최적 시간 창은 4-8 주입니다.
우리의 방법은 간단하고 실용적이며 생체 외에서 PVAT 지질 생성 또는 지방 형성에 대한 연구를 위해 풍부한 ADSC를 생성할 수 있으며 비만 및 심혈관 질환에 대한 새로운 약물을 테스트 할 수 있습니다. 또한, Wnt-1 Cre+/-의 NCADSCs; Rosa26RFP/+ 마우스는 또한 다른 연구 분야에 효과적인 시험관 내 시스템이 될 수 있습니다. 그러나, 몇몇 주의사항은 남아 있습니다: 첫째, 이 세포는 불멸의 지방세포 선 보다는 더 민감하고 연약합니다. 둘째, 그들의 높은 증식 속도 및 지방 분화는 최대 5 개의 구절 후에 지방 흡입 잠재력을 잃는 경향이 있다는 사실에 의해 상쇄됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1312504), 중국 국립자연과학재단(81970378, 81670360, 81870293), 상하이시 과학기술위원회(17411971000, 1714090202) 기금 제공 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
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