Summary

Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

Мы представляем протокол для изоляции, культуры и адипогенной индукции нервного гребня полученных жировые стволовые клетки (NCADSCs) из периаортной жировой ткани Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/’. NCADSCs может быть легко доступным источником ADSCs для моделирования адипогенеза или липогенеза в пробирке.

Abstract

Чрезмерное количество жировой ткани, окружающих кровеносные сосуды (периваскулярная жировая ткань, также известная как PVAT) связано с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний. ADSCs, полученные из различных жировые ткани показывают различные особенности, и те из PVAT не были хорошо охарактеризованы. В недавнем исследовании, мы сообщили, что некоторые ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) спуститься из нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток, происходящих из эктодерма.

В этой работе мы описываем протокол для изоляции красного флуоресцентного белка (RFP) с маркировкой NCCs от PAAT Wnt-1Cre Мышей Rosa26RFP/’ и индуцирование их адипогенной дифференциации in vitro. Вкратце, стромальная сосудистая фракция (SVF) ферментативно отделена от PAAT, а RFPи нервный гребень, полученный ADSCs (NCADSCs), изолированы флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS). NCADSCs дифференцировать в коричневые и белые адипоциты, могут быть криоконсервированы, и сохранить их адипогенный потенциал для 3-5 проходов. Наш протокол может генерировать обильные ADSCs из PVAT для моделирования PVAT адипогенез или липогенез в пробирке. Таким образом, эти NCADSCs могут обеспечить ценную систему для изучения молекулярных переключателей, участвующих в дифференциации PVAT.

Introduction

Распространенность ожирения растет во всем мире, что увеличивает риск связанных с ними хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания и диабет1. PVAT окружает кровеносные сосуды и является основным источником эндокринных и паракринных факторов, участвующих в функции сосудов. Клинические исследования показывают, что высокое содержание PVAT является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний2,3, и его патологическая функция зависит от фенотипа составных жирового стволовых клеток (ADSCs)4.

Хотя линии клеток ADSC, такие как murine 3T3-L1, 3T3-F442A и OP9, являются полезными клеточными моделями для изучения адипогенеза или липогенеза5, регулирующие механизмы адипогенеза различаются между клеточными линиями и первичными клетками. ADSCs в стромальной сосудистой клетки фракции (SVF) изолированы непосредственно из жировой ткани и индуцированных дифференцировать в адипоциты, скорее всего, резюмировать in vivo адипогенез и липогенез6. Тем не менее, хрупкость, плавучесть, и различия в размерах и иммунофенотипов ADSCs сделать их прямой изоляции сложной задачей. Кроме того, различные процедуры изоляции может также существенно повлиять на фенотип и адипогенной потенциальной способности этих клеток7, таким образом подчеркивая необходимость протокола, который поддерживает целостность ADSC.

Жировая ткань, как правило, классифицируется как либо морфологически и функционально различные белые жировой ткани (WAT), или коричневой жировой ткани (BAT)8, который гавани различных ADSCs9. В то время как ADSCs изолированы от perigonadal и паховой подкожной WATs были охарактеризованы в предыдущих исследованиях9,10,11,12, меньше известно в отношении ADSCs от PVAT, который в основном состоит из BAT13.

В недавнем исследовании, мы обнаружили, что часть резидентов ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) являются производными от нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток-прародителей, которые происходят из эктодерма14,15. Wnt1-Cre трансгенных мышей были использованы для отслеживания развития нервных гребня клеток16,17. Мы пересекли Wnt1-Creмышей с Rosa26RFP / мышей для создания Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/, в которых НКК и их потомки помечены красным флуоресцентным белком (RFP) и легко отслеживаются в vivo и in vitro15. Здесь мы описываем метод изоляции нервного гребня производных ADSCs (NC-производных ADSCs, или NCADSCs) от мыши PAAT и побудить NCADSCs дифференцировать в белые адипоциты или коричневые адипоциты.

Protocol

Протокол о животных был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными Шанхайского университета Цзяо Тонг. 1. Поколение Wnt-1Cre Rosa26RFP/’ Мыши Крест Wnt-1 CreNo /- мышей16 с Rosa26RFP / мышей 18 для создания Wnt-1Cre Мышей Rosa26R…

Representative Results

Используя описанный выше протокол, мы получили 0,5-1,0 х 106 ADSCs от 5-6 Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/) (48 недель, мужчины или женщины). Диаграмма потока сбора PAAT от мышей представлена на рисунке 1. Морфология NCADSCs была похожа на ADSC от других мышей жировой ткан…

Discussion

В этом исследовании мы представляем надежный метод изоляции, культуры и адипогенной индукции NCADSCs, извлеченных из PVAT Wnt-1Cre Трансгенные мыши Rosa26RFP/’, предназначенные для производства РППи ADSC. Предыдущие доклады показывают, что нет существенной разницы в выражении общих ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Национальная программа исследований и разбивки по естественным исследованиям Китая (2018YFC1312504), Национальный фонд естественных наук Китая (81970378, 81670360, 81870293) и Научно-техническое управление муниципалитета Шанхая (17411971000, 17140902402) предоставили средства для этого исследования .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

References

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).

Play Video

Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

View Video