Analyse af ikke-menneskelige primat bugspytkirtlen ø ilt forbrug
Summary
Denne protokol viser den nøjagtige og reproducerbare måling af iltforbrug i ikke-humane primat pancreas-Holme. Den ø-læsse teknik og belægning af mikropladen giver en ramme for effektiv måling af respiration i andre typer af kultiverede sfæroider.
Abstract
Målingen af iltforbrug i sfæide klynger af celler, såsom ex vivo pancreas-Holme, har historisk set været udfordrende. Vi demonstrerer målingen af ø-iltforbrug ved hjælp af en 96-brønd mikroplade designet til måling af iltforbrug i sfæroider. I denne analyse er sfæroide-mikropladerne belagt med en celle-og vævsklæber på dagen forud for analysen. Vi udnytter en lille mængde klæbemiddel løsning til at tilskynde Islet tilslutning til kun bunden af brønden. På dagen for analysen indlæses 15 Holme direkte i bunden af hver brønd ved hjælp af en teknik, der sikrer optimal positionering af Holme og nøjagtig måling af iltforbrug. Forskellige aspekter af mitokondrie respiration er probed farmakologisk i ikke-humane primat islets, herunder ATP-afhængige respiration, maksimal respiration, og proton lækage. Denne metode giver mulighed for ensartede, reproducerbare resultater ved hjælp af kun et lille antal Holme per brønd. Det kan teoretisk set anvendes på alle kultiverede sfæroider af samme størrelse.
Introduction
For at opretholde normale blodsukkerniveauer, bugspytkirtlen β celle skal fornemme stigninger i glucose og udskiller insulin i overensstemmelse hermed. Koblingen af insulinsekretion med glukose niveauer er direkte forbundet med glukose metabolisme og produktion af ATP gennem mitokondrie oxidativ fosforylering. Således, mitokondrier spiller en afgørende rolle i stimulus-sekretion kobling1. Vurdering af β-celle mitokondrie funktion kan afsløre defekter, der fører til nedsat insulinsekretion. Sekretionen af Glucagon af pancreas α celler er også tæt knyttet til mitokondrie funktion2. Selv om udødeliggjort Islet cellelinjer har vist sig nyttige for nogle typer af assays, fysiologi af disse celler ikke præcist rekapitulere hele ø-funktion, som illustreret ved potensering af insulinsekretion ved Glucagon3,4 og hæmning af Glucagon sekretion af insulin/somatostatin5,6 i intakt Holme. Dette viser behovet for at måle iltforbrug ved brug af hele, intakte Holme.
Teknikker til måling af ø-celle respirometri har udviklet sig over tid, fra brugen af ilt-følsomme fluorescerende farvestoffer7 til solid-state sensorer, der direkte måler iltforbrug8. Oprindeligt designet til monolayer, vedsiddende celler, almindeligt anvendte cellekultur plade systemer har vist sig at være ineffektiv for bugspytkirtlen Holme. Da Holme ikke naturligt holder sig til brøndene, er de tilbøjelige til at blive skubbet til periferien af kulturen godt resulterer i unøjagtige måling af iltforbrug9. For at bekæmpe dette problem, specialiserede 24-brønd plader med en central depression, der kunne indeholde Holme blev udviklet9. 24-brøndens plade system var dog begrænset af det store antal Holme, der kræves (50-80 pr. brønd), og antallet af betingelser, der kan testes samtidigt10. Den seneste udvikling af 96-brønd mikroplader designet specielt til ekstracellulær flux analyse i sfæroider har overvundet disse barrierer, gør det muligt at måle ø-respirometri med 20 eller færre Holme pr godt10.
Her viser vi brugen af dette system til at måle iltforbrug i Holme fra den japanske makak (Macaca fuscata), en dyremodel med lignende ø-biologi til mennesker11,12. I denne protokol analyseres 15 makaque Holme pr. brønd. I vores hænder, 15 Holme pr brønd produceret højere baseline ilt forbrug end færre Holme, med robust aktivering og undertrykkelse af respiration som reaktion på farmakologisk manipulation. Vi fremhæver trinene for at forberede analysen, en effektiv metode til konsekvent lastning af Holme i midten af hver brønd, og fælles udfordringer, når du udfører denne analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af ø-iltforbrug har tidligere været hæmmet af den sfæriske form af Holme, deres manglende overholdelse af kultur overflader og antallet af Holme, der kræves pr. brønd. I denne protokol fremhæver vi effekten af 96-Well sfæroide-mikropladen til måling af ø-iltforbrug på et lille antal Holme og viser en teknik til håndtering og lastning af Holme, som er teknisk gennemførlig og giver ensartede Resultater.
For at Holme kan holde sig til bunden af mikropladen og være uperturere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Vanderbilt High gennemløb screening kerne for brugen af deres faciliteter, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) for ikke-menneskelig primat Islet isoleringer, og Eric Donahue (Vanderbilt University) for assistance med figur 1. J.M.E. blev støttet af NIGMS fra National Institutes of Health underpris nummer T32GM007347. M.G. blev støttet af NIH/NIDDK (R24DK090964-06) og Department of Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
