Este protocolo demonstra a medida precisa e reproduzível do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos. As técnicas de carregamento de ilhotas e revestimento da microplaca fornecem uma estrutura para a medição eficiente da respiração em outros tipos de esferóides cultivados.
A medição do consumo de oxigênio em aglomerados esferóides de células, como ilhotas pancreáticas ex vivo, tem sido historicamente desafiadora. Demonstramos a medição do consumo de oxigênio de ilhota usando uma microplaca de 96 poços projetada para a medição do consumo de oxigênio em esferóides. Neste ensaio, as microplacas esferóides são revestidas com um adesivo de células e tecidos no dia anterior ao ensaio. Utilizamos um pequeno volume de solução adesiva para incentivar a adesão ao ilhota apenas ao fundo do poço. No dia do ensaio, 15 ilhotas são carregadas diretamente na base de cada poço usando uma técnica que garante o posicionamento ideal das ilhotas e a medição precisa do consumo de oxigênio. Vários aspectos da respiração mitocondrial são sondados farmacologicamente em ilhotas de primatas não humanos, incluindo respiração dependente de ATP, respiração máxima e vazamento de prótons. Este método permite resultados consistentes e reproduzíveis usando apenas um pequeno número de ilhotas por poço. Teoricamente, pode ser aplicado a quaisquer esferóides cultivados de tamanho semelhante.
A fim de manter os níveis normais de glicose no sangue, a célula β pancreática deve sentir elevações na glicose e secretar insulina em conformidade. O acoplamento da secreção de insulina com os níveis de glicose está diretamente ligado ao metabolismo da glicose e à produção de ATP através da fosforia oxidativa mitocondrial. Assim, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no acoplamento de estímulo-secreção1. Avaliar a função mitocondrial das células β pode revelar defeitos que levam à secreção de insulina prejudicada. A secreção de glucagon por células α pancreáticas também está intimamente ligada à função mitocondrial2. Embora as linhas imortalizadas da pilha da ilhota tenham provado úteis para alguns tipos de ensaios, a fisiologia destas pilhas não recapitula résível a função inteira da ilhota, como ilustrado pela potentiação do secretion do insulin pelo glucagon3,4 e pela inibição do secretion do glucagon pelo insulin/somatostatin5,6 em ilhotas intatas. Isso demonstra a necessidade de medir o consumo de oxigênio usando ilhotas inteiras e intactas.
Técnicas para a medição da respirometria de células ilhotas evoluíram ao longo do tempo, desde o uso de corantes fluorescentes sensíveis ao oxigênio7 a sensores de estado sólido que medem diretamente o consumo de oxigênio8. Inicialmente projetado para monocamada, células aderentes, sistemas de placa de cultura celular comumente usados provaram ser ineficazes para ilhotas pancreáticas. Como as ilhotas não aderem naturalmente aos poços, eles são propensos a serem empurrados para a periferia da cultura, resultando em medição imprecisa do consumo de oxigênio9. Para combater esse problema, placas especializadas de 24 poços com uma depressão central que poderia conter ilhotas foram desenvolvidas9. No entanto, o sistema de placas de 24 poços foi limitado pelo grande número de ilhotas necessárias (50-80 por poço) e pelo número de condições que poderiam ser testadas simultaneamente10. O recente desenvolvimento de microplacas de 96 poços projetadas especificamente para análise de fluxo extracelular em esferóides superou essas barreiras, permitindo a medição da respirometria de ilhotas com 20 ou menos ilhotas por poço10.
Aqui, demonstramos o uso deste sistema para medir o consumo de oxigênio em ilhotas do macaco japonês (Macaca fuscata), um modelo animal com biologia de ilhotas semelhante aos seres humanos11,12. Neste protocolo, 15 ilhotas de macacosão são analisadas por poço. Em nossas mãos, 15 ilhotas por poço produziram maior consumo de oxigênio de base do que menos ilhotas, com ativação robusta e repressão da respiração em resposta à manipulação farmacológica. Destacamos os passos para se preparar para o ensaio, um método eficaz para o carregamento consistente de ilhotas no centro de cada poço, e desafios comuns ao realizar este ensaio.
O estudo do consumo de oxigênio de ilhotas já foi dificultado pela forma esférica das ilhotas, sua falta de adesão às superfícies culturais e o número de ilhotas exigidas por poço. Neste protocolo, destacamos a eficácia da microplaca esferóide de 96 poços para medir o consumo de oxigênio de ilhotas em um pequeno número de ilhotas e demonstramos uma técnica de manuseio e carregamento de ilhotas que é tecnicamente viável e produz consistente Resultados.
Para que as ilhotas aderem…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer o Vanderbilt High Throughput Screening Core para o uso de suas instalações, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) para isolamentos de ilhotas de primatas não humanos, e Eric Donahue (Vanderbilt University) para assistência com a Figura 1. J.M.E. foi apoiado pela NIGMS dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmios T32GM0007347. M.G. foi apoiado pelo NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e pelo Departamento de Assuntos de Veteranos (BX003744).
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |