Summary
यह प्रोटोकॉल गैर-मानव रहनुमा अग्नाशय आइलेट्स में ऑक्सीजन की खपत के सटीक और प्रजनन योग्य माप को दर्शाता है। आइलेट लोडिंग तकनीक और माइक्रोप्लेट का कोटिंग अन्य प्रकार के सुसंस्कृत स्फेरॉइड में श्वसन के कुशल माप के लिए एक ढांचा प्रदान करता है।
Abstract
पूर्व वीवो अग्नाशय आइलेट्स जैसे कोशिकाओं के स्फेरॉइड समूहों में ऑक्सीजन की खपत का माप ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। हम स्फेरॉइड में ऑक्सीजन की खपत के माप के लिए डिज़ाइन किए गए 96-अच्छी माइक्रोप्लेट का उपयोग करके आइलेट ऑक्सीजन की खपत की माप प्रदर्शित करते हैं। इस परख में, स्फेरॉइड माइक्रोप्लेटको परख से पहले दिन एक कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के साथ लेपित किया जाता है। हम केवल कुएं के नीचे आइलेट के पालन को प्रोत्साहित करने के लिए चिपकने वाले समाधान की एक छोटी मात्रा का उपयोग करते हैं। परख के दिन, 15 आइलेट्स को सीधे एक तकनीक का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के आधार में लोड किया जाता है जो आइलेट्स की इष्टतम स्थिति और ऑक्सीजन की खपत के सटीक माप को सुनिश्चित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विभिन्न पहलुओं की जांच गैर-मानव रहनुमा आइलेट्स में की जाती है, जिसमें एटीपी-निर्भर श्वसन, अधिकतम श्वसन और प्रोटोन रिसाव शामिल हैं। यह विधि केवल कम संख्या में आइलेट्स का उपयोग करके लगातार, प्रजनन योग्य परिणामों की अनुमति देती है। यह सैद्धांतिक रूप से इसी तरह के आकार के किसी भी सुसंस्कृत स्फेरॉइड पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
सामान्य रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने के लिए, अग्नाशय की कोशिका को ग्लूकोज में ऊंचाई को समझना चाहिए और तदनुसार इंसुलिन को स्रावित करना चाहिए। ग्लूकोज के स्तर के साथ इंसुलिन स्राव का युग्मन सीधे ग्लूकोज मेटाबोलिज्म और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एटीपी के उत्पादन से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया उत्तेजना-स्राव युग्मन1में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कोशिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने से उन दोषों को प्रकट किया जा सकता है जो इंसुलिन स्राव को बाधित करते हैं। अग्नाशय की α कोशिकाओं द्वारा ग्लूकागन का स्राव भी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन2से निकटता से बंधा हुआ है । हालांकि अमर आइलेट सेल लाइनों के कुछ प्रकार के रूपों के लिए उपयोगी साबित कर दिया है, इन कोशिकाओं के शरीर विज्ञान सही पूरे आइलेट समारोह संक्षिप्त नहीं है, के रूप में ग्लूकागन 3,4 द्वारा इंसुलिन स्राव के शक्तिशाली द्वारा सचित्र और इंसुलिन द्वारा ग्लूकागन स्राव के निषेध/ यह पूरे, बरकरार आइलेट्स का उपयोग कर ऑक्सीजन की खपत को मापने की आवश्यकता को दर्शाता है।
आइलेट सेल रेस्पिरोमेट्री की माप के लिए तकनीक समय के साथ विकसित हुई है, ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंटरंगों 7 के उपयोग से ठोस राज्य सेंसर ों तक जो सीधे ऑक्सीजन की खपत8को मापते हैं। शुरू में मोनोलेयर, अनुयायी कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किया गया है, आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल संस्कृति प्लेट सिस्टम अग्नाशय आइलेट्स के लिए अप्रभावी साबित हुए हैं। चूंकि आइलेट्स स्वाभाविक रूप से कुओं का पालन नहीं करते हैं, इसलिए उन्हें संस्कृति की परिधि में धकेल दिए जाने का खतरा होता है जिसके परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत9का गलत माप होता है। इस समस्या का मुकाबला करने के लिए, एक केंद्रीय अवसाद के साथ विशेष 24-अच्छी तरह से प्लेटें जो आइलेट्स को शामिल कर सकतीथीं, 9विकसित की गई थीं। हालांकि, 24-अच्छी प्लेट प्रणाली बड़ी संख्या में आवश्यक आइलेट्स (50-80 प्रति अच्छी तरह से) और शर्तों की संख्या से सीमित थी जिसका परीक्षण एक साथ10किया जा सकता था। स्फेरॉइड में एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स विश्लेषण के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए 96-वेल माइक्रोप्लेट्स के हालिया विकास ने इन बाधाओं को दूर किया है, जिससे आइलेट रेस्पिरोमेट्री की माप को 20 या उससे कम आइलेट्स प्रति अच्छी तरह से10कर दिया गया है।
यहां, हम जापानी मकाक(मकाका फ्यूस्काटा)से आइलेट्स में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, जो मनुष्यों के लिए समान आइलेट जीव विज्ञान के साथ एक पशु मॉडल11,12। इस प्रोटोकॉल में, प्रति अच्छी तरह से 15 मकाक आइलेट्स का विश्लेषण किया जाता है। हमारे हाथों में, फार्माकोलॉजिक हेरफेर के जवाब में मजबूत सक्रियण और श्वसन के दमन के साथ, कम आइलेट्स की तुलना में उच्च बेसलाइन ऑक्सीजन खपत का उत्पादन करने वाले 15 आइलेट्स। हम परख के लिए तैयार करने के लिए कदम पर प्रकाश डाला, प्रत्येक अच्छी तरह से के केंद्र में islets के लगातार लोडिंग के लिए एक प्रभावी विधि है, और आम चुनौतियों जब इस परख प्रदर्शन ।
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Protocol
1. परख चलाने से पहले दिन पर माइक्रोप्लेट और सेंसर कारतूस की तैयारी
आइलेट्स को तीन साल पुराने जापानी मकाक से अलग किया गया था जैसा कि पहले13वर्णित था । यह विधि बहुत ही है कि शव दाताओं से मानव आइलेट्स को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन चूहों से अलग है, जिसमें अग्नाशयना अक्सर कोलेजन समाधान के साथ फुलाया जाता है, जबकि जानवर sedation के तहत है और अंग हटाने से पहले । आइलेट रिट्रीवल ओरेगन नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर (ONPRC) और ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमिटी (आईएसीयूसी) के दिशा-निर्देशों के मुताबिक आयोजित किया गया था और इसे ऑनपीआरसी आईएसएसीयूसी द्वारा अनुमोदित किया गया था । ONPRC संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग (यूएसडीए) द्वारा लागू पशु कल्याण अधिनियम और विनियमों और मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति का पालन करता है, जो राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार है ।
- स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट की तैयारी
- सोडियम बाइकार्बोनेट के 0.1 M समाधान का 3 एमएल तैयार करें। फिल्टर समाधान बंध्याकरण। हमने 0.45 माइक्रोन फिल्टर(टेबल ऑफ मैटेरियल) काउपयोग किया।
- सेल कल्चर हुड में, 0.1 M सोडियम बाइकार्बोनेट के 2.8 मिलील में सेल और ऊतक चिपकने वाला(सामग्री की तालिका)के 200 माइक्रोन जोड़ें। फिर, 96-वेल स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट(टेबल ऑफ मैटेरियल)के प्रत्येक कुएं के नीचे इस समाधान के 20 माइक्रोन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि हवा के बुलबुले पिपेट टिप से हटा दिए जाते हैं और केवल प्लेट के नीचे कवर किया जाता है। माइक्रोप्लेट की कोटिंग आइलेट्स को कुओं के किनारों को ऊपर जाने से रोकती है जब दवाओं को जोड़ा जाता है और परख के दौरान कुएं में मिलाया जाता है।
नोट:परख चलाने पर आइलेट्स के लिए उपयोग किए जाने वाले कई कुओं को कोट करना केवल आवश्यक है। यदि केवल कुछ कुओं का उपयोग किया जाएगा, तो सेल चिपकने वाले समाधान को उचित रूप से कम किया जा सकता है। परख में इस्तेमाल किया सेल चिपकने वाला एक तैयार प्रोटीन समुद्री कौड़ी से निकाला समाधान है । वैकल्पिक रूप से, माइक्रोप्लेट कुओं को 100 μg/mL पॉली-डी-लाइसिन के 20 माइक्रोन के साथ लेपित किया जा सकता है। - प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- एक बाँझ वातावरण में, प्लेट से एस्पिरेट सेल चिपकने वाला समाधान। मल्टीचैनल पाइप्ट का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस बाँझ पानी के 400 माइक्रोन के साथ प्रत्येक कुएं को दो बार धोएं। सूखी हवा के लिए अनुमति दें।
- 30-40 मिनट के बाद प्लेट को ढककर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
- सेंसर कारतूस का हाइड्रेशन
- एक बाँझ वातावरण में, सेंसर कारतूस पैकेज(सामग्री की तालिका)खोलें और सामग्री को हटा दें। यूटिलिटी प्लेट के बगल में सेंसर कारतूस को उल्टा रखें।
- 200 μL बाँझ पानी के साथ उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें और सेंसर कारतूस को उपयोगिता प्लेट में वापस कम करें। एक 37 डिग्री सेल्सियस, गैर सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर संवेदक कारतूस और उपयोगिता प्लेट जगह।
- कैलिबेंट की तैयारी
- अलीकोट 25 मिलीएल कैलिबेंट(सामग्री की तालिका)50 मिलीआर शंकुई ट्यूब में। 37 डिग्री सेल्सियस, नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर ट्यूब रखें।
2. मीडिया की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल, Islets के Loading, और परख के दिन सेंसर कारतूस की लोडिंग
- मीडिया की तैयारी
- बेस मीडिया के 48.5 mL (न्यूनतम डीएमईएम, सामग्री की तालिकादेखें), 1 एमएम सोडियम पायरुवेट और 2 एमएम ग्लूटामाइन में से प्रत्येक में 500 माइक्रोन जोड़ें। इसके अतिरिक्त, २०० मिलीग्राम/मिलीलीटर ग्लूकोज के ४९६ μL जोड़ें (मीडिया में ग्लूकोज की अंतिम एकाग्रता ५.५ mM है) ।
नोट:इन प्रयोगों के लिए बेसलाइन ग्लूकोज एकाग्रता स्थिर रखी गई थी। हालांकि, ग्लूकोज का उपयोग ब्लो10वर्णित फार्माकोलॉजिक जोड़तोड़ के अलावा श्वसन को प्रोत्साहित करने के लिए भी किया जा सकता है। - पुष्टि करें कि पीएच 7.4 +/- 0.1 है, यदि आवश्यक हो तो समायोजन।
- बेस मीडिया के 48.5 mL (न्यूनतम डीएमईएम, सामग्री की तालिकादेखें), 1 एमएम सोडियम पायरुवेट और 2 एमएम ग्लूटामाइन में से प्रत्येक में 500 माइक्रोन जोड़ें। इसके अतिरिक्त, २०० मिलीग्राम/मिलीलीटर ग्लूकोज के ४९६ μL जोड़ें (मीडिया में ग्लूकोज की अंतिम एकाग्रता ५.५ mM है) ।
- सेंसर कारतूस की तैयारी
- इनक्यूबेटर से सेंसर कारतूस लें, सेंसर कारतूस ढक्कन हटा दें, और कुओं से पानी डंप करें। प्रत्येक कुएं में पूर्व-गर्म कैलिबेंट के 200 मिलील रखें और सेंसर कारतूस ढक्कन को बदलें।
- सेंसर कारतूस के बारे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस जगह (जब तक जरूरत है) ।
- माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख के लिए दवाओं की तैयारी
- स्ट्रेस टेस्ट किट(सामग्री की तालिका)खोलें और सामग्री को हटा दें। ओलिगोमाइसिन, कार्बोनिल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोरोमेथोक्सी) फिनाइलहाइड्रेज़ोन (एफसीसीपी), और रोटेनोन/एंटीमाइसिन ए (एए) के लिए स्टॉक और वर्किंग सॉल्यूशंस बनाएं ।
- ओलिगोमाइसिन: 100 माइक्रोन स्टॉक बनाने के लिए ट्यूब में इकट्ठे मीडिया के 630 माइक्रोन जोड़ें। फिर, पोर्ट एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया के साथ 45 माइक्रोन को पतला करें (इंजेक्शन के बाद अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता 4.5 माइक्रोन होगी)
- एफसीसीपी: 100 माइक्रोन स्टॉक बनाने के लिए ट्यूब में इकट्ठे मीडिया के 720 माइक्रोन जोड़ें। पोर्ट एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया के साथ 10 माइक्रोन को पतला करें (अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता 1 μM होगी)
नोट:बीएसए और/या एफबीएस को मीडिया में नहीं जोड़ा जाना चाहिए, क्योंकि इससे माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर्स14की कार्रवाई प्रभावित हो सकती है । - Rotenone/ए.: ट्यूब के लिए इकट्ठे मीडिया के ५४० μL जोड़ने के लिए ५० μM शेयर बनाते हैं । पोर्ट एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया के साथ 25 माइक्रोन को पतला करें (अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता 2.5 माइक्रोन होगी)
नोट:उपरोक्त सांद्रता ने हमारे हाथों में लगातार परिणाम पेश किए हैं। अतिरिक्त एफसीसीपी के कारण श्वसन में और वृद्धि नहीं हुई । हालांकि, आइलेट आकार के आधार पर दवा सांद्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, और विशेष रूप से विभिन्न प्रजातियों या गैर-आइलेट स्फेरॉइड से आइलेट्स के साथ। संदर्भ के लिए, एक गैर-मानव रहनुमा आइलेट का औसत व्यास लगभग 150 माइक्रोन15है।
- स्ट्रेस टेस्ट किट(सामग्री की तालिका)खोलें और सामग्री को हटा दें। ओलिगोमाइसिन, कार्बोनिल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोरोमेथोक्सी) फिनाइलहाइड्रेज़ोन (एफसीसीपी), और रोटेनोन/एंटीमाइसिन ए (एए) के लिए स्टॉक और वर्किंग सॉल्यूशंस बनाएं ।
- स्फेरॉइड प्लेट की तैयारी और आइलेट्स का स्थानांतरण
- हाथ से अग्नाशय आइलेट्स को 60 मिमी x 15 मिमी सेल कल्चर डिश में लेने के लिए इकट्ठा मीडिया जिसमें 100% शुद्धता प्राप्त करने के लिए इकट्ठा किया गया है।
नोट:आइलेट्स गोल दिखाई देना चाहिए, एक स्पष्ट रूप से परिभाषित परिधि के साथ, और एक्सोक्राइन ऊतक संदूषकों की तुलना में सघन दिखाई देते हैं। क्षतिग्रस्त या अस्तव्यस्त दिखाई देने वाले आइलेट्स से बचें। इस प्रयोग में, आइलेट आकार सीधे मापा नहीं गया था, हालांकि हमने प्रत्येक अच्छी तरह से और नमूने के लिए लगभग समकक्ष आकार के आइलेट्स लेने का प्रयास किया। - एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके इकट्ठे मीडिया के 175 माइक्रोन के साथ स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं को लोड करें।
- 15 μL के लिए सेट एक P20 पिपेट का उपयोग करना, सेल संस्कृति पकवान से aspirate 15 islets । आइलेटनग्न आंखों को पिपेट टिप में दिखाई देना चाहिए।
- आइलेट्स को स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करने के लिए, कुएं के नीचे निचले पिपेट टिप, मुश्किल से ऊपर उठाएं, और धीरे-धीरे एक बहुत छोटी मात्रा (~ 5 μL) को बाहर निकालें। पुष्टि करें कि सभी आइलेट ने पिपेट टिप छोड़ दी है। प्रत्येक कुएं को 15 आइलेट्स प्राप्त होने चाहिए। कभी-कभी माइक्रोस्कोप के नीचे स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट की जांच करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि आइलेट्स पक्षों में फंसने के बजाय प्रत्येक कुएं के नीचे हैं।
नोट:आइलेट्स के साथ कोने कुओं लोड करने से बचें। प्लास्टिक से बाहर ऑक्सीजन और पीएच प्रवाह परख के दौरान हो सकता है, और यह चार कोने कुओं में बढ़ा है । - एक बार सभी आइलेट्स को स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया है, तो नीचे दिए गए चरणों को पूरा करते समय माइक्रोप्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
- हाथ से अग्नाशय आइलेट्स को 60 मिमी x 15 मिमी सेल कल्चर डिश में लेने के लिए इकट्ठा मीडिया जिसमें 100% शुद्धता प्राप्त करने के लिए इकट्ठा किया गया है।
- सेंसर कारतूस लोड कर के चला रहा है परख
- इनक्यूबेटर से सेंसर कारतूस निकालें। प्रत्येक कुएं के लिए पोर्ट ए-सी या तो दवा या मीडिया के साथ लोड किया जाना चाहिए । आइलेट्स युक्त कुओं और चार कोने के कुओं को दवा से भरा जाना चाहिए। आइलेट्स के बिना गैर-कोने वाले कुओं को मीडिया से लोड किया जाना चाहिए। पोर्ट डी खाली छोड़ा जा सकता है। ओलिगोमाइसिन या मीडिया के 20 माइक्रोन के साथ लोड पोर्ट ए (प्रत्येक सेंसर का शीर्ष बाएं) लोड करें। एफसीसीपी या मीडिया के 22 माइक्रोन के साथ लोड पोर्ट बी (शीर्ष दाएं)। रोटेनोन/एए या मीडिया के 25 माइक्रोन के साथ लोड पोर्ट सी (नीचे बाएं) ।
- कार्यक्रम एक 30 मिनट बेसलाइन श्वसन अवधि के लिए एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक परख (3 मिनट मिश्रण के 5 चक्र, 3 मिनट उपाय), ४२ मिनट oligomycin माप अवधि (3 मिनट मिश्रण के 7 चक्र, 3 मिनट उपाय), 30 मिनट एफसीसीपी (3 मिनट मिश्रण के 5 चक्र, 3 मिनट के उपाय), और 30 मिनट Rotenone/एए (3 मिनट मिश्रण के 5 चक्र, 3 मिनट के उपाय) ।
- परख चलाएं और सेंसर को कैलिब्रेट करने और माइक्रोप्लेट डालने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें।
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Representative Results
आइलेट्स को माइक्रोप्लेट में लोड करने के लिए, 15 आइलेट्स को मीडिया के 15 माइक्रोन में एस्पिरेटेड किया जाना चाहिए, जैसा कि फिगर 1एमें दिखाया गया है। आइलेट्स स्वाभाविक रूप से कुछ सेकंड के भीतर पाइप टिप के नीचे की ओर बस जाएगा। फिर, पाइपटिप को कुएं के नीचे तक कम किया जाता है। टिप बहुत थोड़ा उठाया है, और एक छोटी मात्रा (लगभग 5 μL) आइलेट्स के साथ बाहर pipetted है । इस तकनीक के परिणामस्वरूप माइक्रोप्लेट के नीचे आइलेट का लगातार प्लेसमेंट होता है(चित्रा 1बी)सटीक ऑक्सीजन खपत मापन के लिए अनुमति देता है।
चित्रा 2 परख भर में ऑक्सीजन की खपत के लिए अच्छी तरह से व्यक्तिगत द्वारा प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है । यह विशेष प्रयोग दर्शाता है कि क्या हो सकता है जब कुओं खराब भरी हुई हैं, कई islets के साथ अच्छी तरह से के पक्षमें अटक के बजाय अच्छी तरह से नीचे । यह अच्छी तरह से बहुत अधिक मीडिया पाइपिंग के कारण हो सकता है के बाद islets पहले से ही टिप से बाहर pipetted किया गया है । अतिरिक्त मीडिया का प्रवाह आइलेट्स को कुएं के नीचे से बाहर धकेलता है । जब ऐसा होता है, ऑक्सीजन की खपत के आधारभूत स्तर बहुत कम हो जाएगा, और यह अच्छी तरह से एफसीसीपी के लिए कोई जवाब नहीं के लिए थोड़ा दिखाएगा । चित्रा 2 में बोल्ड लाइन इस घटना को दर्शाता है ।
चित्रा 3 एक अलग प्रयोग है जिसमें ज्यादातर कुओं महत्वपूर्ण बेसलाइन श्वसन और दवाओं के लिए प्रतिक्रिया दिखाने से पता चलता है । हालांकि, दो कुओं (बोल्ड लाइनों के साथ) rotenone/ए. ए. के लिए कोई जवाब नहीं दिखाया । इससे पता चलता है कि दवा को ठीक से कुएं में नहीं छोड़ा गया था । इस मामले में, जैसा कि बेसल ऑक्सीजन खपत के मामलों के साथ, इन कुओं को आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है।
चित्रा 4 एक सफल परख के परिणाम दिखाता है। यहां हम एक अलग प्रयोग से सारांश डेटा का एक उदाहरण दिखाते हैं जिसमें कुओं को ठीक से आइलेट्स से लोड किया गया था और सही ढंग से दवाओं के साथ इंजेक्शन दिया गया था। एटीपी पर निर्भर माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत को ओलिगोमाइसिन, मैक्सिमल श्वसन-अच्छी तरह से एफसीसीपी द्वारा प्रेरित किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन पूरी तरह से बंद कर दिया गया था-रोटेनोन/एए के साथ इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के अवरोध से ।
चित्रा 1: माइक्रोप्लेट में आइलेटलोड करने के लिए पाइपिंग तकनीक। (A)लगभग 15 आइलेट्स (लाल तीर) मीडिया के 15 μL के साथ pipetted । (ख)आइलेट्स स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट के नीचे केंद्रित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: आइलेट लोडिंग में अंतर के कारण अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता। कुओं अनुचित तरीके से भरी हुई (बोल्ड ब्लू लाइन) कोई बेसल ऑक्सीजन की खपत और सेल तनाव परीक्षण दवाओं के लिए ंयूनतम प्रतिक्रिया के लिए थोड़ा दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: दवा इंजेक्शन की विफलता। दो कुओं (बोल्ड नीली लाइनों) rotenone/ए. ए. के साथ इंजेक्शन नहीं थे और ऑक्सीजन की खपत में कोई महत्वपूर्ण कमी दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: खराब लोड या इंजेक्शन कुओं के बहिष्कार के बाद एक प्रयोग में सभी कुओं में औसत डेटा । 16 तकनीकी प्रतिकृति सहित एक अलग प्रयोग में सेल तनाव परीक्षण परख भर में औसत ऑक्सीजन की खपत । त्रुटि सलाखों n = 16 कुओं के लिए मानक विचलन दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
आइलेट ऑक्सीजन की खपत का अध्ययन पहले आइलेट्स के गोलाकार आकार, संस्कृति सतहों के पालन की उनकी कमी और प्रति अच्छी तरह से आवश्यक आइलेट्स की संख्या से बाधित हुआ है । इस प्रोटोकॉल में, हम आइलेट्स की एक छोटी संख्या पर आइलेट ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए 96-वेल स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट की प्रभावकारिता को उजागर करते हैं और आइलेट्स को संभालने और लोड करने के लिए एक तकनीक प्रदर्शित करते हैं जो तकनीकी रूप से व्यवहार्य है और लगातार उत्पादन करता है परिणाम.
आइलेट्स के लिए माइक्रोप्लेट के नीचे का पालन करने और परख भर में चरणों को मिलाने के दौरान बेफिक्र होने के लिए, 96-अच्छी तरह माइक्रोप्लेट को परख से एक दिन पहले एक सेल चिपकने वाले समाधान के साथ लेपित किया जाता है। हालांकि यह आम तौर पर फायदेमंद होता है, यदि आइलेट्स ठीक से लोड नहीं होते हैं तो वे नीचे के बजाय कुएं के किनारे से चिपके रहने के लिए उत्तरदायी होते हैं, इस प्रकार सटीक माप को प्रभावित या रोकना। इसका मुकाबला करने के लिए, हम चिपकने वाले समाधान की एक बहुत छोटी मात्रा के साथ कोटिंग कुओं की सलाह देते हैं-केवल 20 μL । इसके अतिरिक्त, पाइपिंग तकनीक हम यह सुनिश्चित करता है कि आइलेट्स अच्छी तरह से नीचे करने के लिए लोड कर रहे है और अतिरिक्त मीडिया के प्रवाह से पक्षों को धक्का नहीं .
९६-वेल स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट ने आइलेट ऑक्सीजन खपत को मापने की पिछली सीमाओं को दूर किया है, जिसमें आवश्यक आइलेट्स की उच्च संख्या और एक साथ परीक्षण की जा सकने वाली स्थितियों की संख्या शामिल है । दरअसल, हाल ही में एक अध्ययन10 अच्छी तरह से प्रति मानव आइलेट के साथ इस प्रणाली के उपयोग का प्रदर्शन किया । हालांकि, एकल आइलेट्स का उपयोग करके ऑक्सीजन की खपत की माप के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत बहुत कम बेसल माप हुई, जो केवल सबसे बड़े आइलेट्स (व्यास 290 माइक्रोन से ऊपर) में पृष्ठभूमि से काफी ऊपर थी। एनएचपी आइलेट्स मानव आइलेट्स की तुलना में छोटे होते हैं, जिसका औसत व्यास केवल 150 माइक्रोन15होता है। हमारे हाथों में, प्रति अच्छी तरह से 15 एनएचपी आइलेट्स ने कम आइलेट्स की तुलना में सेल तनाव परीक्षण के दौरान उच्च आधाररेखा और अधिक उत्तरदायी प्रोफ़ाइल दिखाई। हम भी अच्छी तरह से प्रति पांच और दस islets परीक्षण किया है, लेकिन पाया कि बेसल ऑक्सीजन की खपत और शोर करने के लिए संकेत काफी कम थे ।
प्रति अच्छी तरह से आइलेट्स की कम संख्या का उपयोग करने की क्षमता के अलावा, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट एक बार में कई अलग-अलग स्थितियों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है। यह उन मामलों में फायदेमंद है जहां आइलेट्स को विभिन्न यौगिकों या आनुवंशिक रूप से हेरफेर के साथ इलाज किया जाता है। हालांकि, मानव या गैर-मानव रहनुमा आइलेट्स के समूहों की तुलना करते समय जो विभिन्न स्रोतों (जैसे, मधुमेह बनाम गैर-मधुमेह आइलेट्स) से आते हैं, नमूने अक्सर विभिन्न दिनों में प्राप्त होते हैं। इस प्रकार, इन मामलों में इस प्रणाली का पूरा लाभ उठाना संभव नहीं है।
माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत के विभिन्न पहलुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने श्वसन फार्माकोलॉजिकल रूप से विभिन्न पहलुओं में हेरफेर किया। नशीली दवाओं की सांद्रता मानव आइलेट्स10में एक व्यापक अध्ययन पर आधारित थी । एफसीसीपी की खुराक को हमारे हाथों में अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को प्रेरित करने के लिए अनुकूलित किया गया था। विशेष रूप से, ओलिगोमाइसिन की एकाग्रता 4.5 माइक्रोन थी, एफसीसीपी 1 माइक्रोन था, और रोटेनोन/एए 2.5 माइक्रोन था। हालांकि, इन सांद्रता को इस प्रोटोकॉल के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए कैलिब्रेट किए जाने की आवश्यकता है।
उत्पादित डेटा या तो सीधे विश्लेषण किया जा सकता है या तरीकों की एक संख्या का उपयोग कर सामान्यीकृत । इस प्रयोग में, प्रत्येक नमूने के लिए समान आकारों के आइलेट्स की समान संख्या का उपयोग किया गया था, और डेटा को सेल नंबर या आइलेट आकार द्वारा सामान्य ीकृत नहीं किया गया था, जिसे सीधे मात्रा में मुश्किल हो सकती है। सामान्यीकरण की एक वैकल्पिक विधि कुल सेलुलर प्रोटीन द्वारा है, जिसमें परख के बाद कोशिकाओं को लाइसकरना और प्रोटीन के स्तर की मात्रा निर्धारित करना शामिल है। डेटा को बेसल श्वसन स्तर तक भी सामान्य किया जा सकता है। यह कुछ मामलों में जानकारीपूर्ण हो सकता है, जैसे कि बेसल स्तरों के प्रतिशत के रूप में आरक्षित क्षमता का परिमाणीकरण । हालांकि, इन सामान्यीकरण विधियों और अन्य लोगों के साथ, सामान्यीकरण के दौरान जानकारी खो सकती है जैसा कि पहलेवर्णित 16था।
यहां वर्णित प्रणाली आइलेट फिजियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करती है। दरअसल, आइलेट स्वास्थ्य में ऑक्सीजन की खपत के महत्व को इस अवलोकन से दर्शाया गया है कि आइलेट ऑक्सीजन की खपत दरआइलेट स्वास्थ्य और सफल आइलेट प्रत्यारोपण17की संभावना के साथ निकटता से बंधी हुई है। यह प्रणाली आइलेट ऑक्सीजन खपत के लगातार मात्राकरण के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करती है, जिसे सिद्धांत रूप में, किसी भी समान आकार के सुसंस्कृत स्फेरॉइड पर भी लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक अपनी सुविधाओं के उपयोग के लिए वैंडरबिल्ट हाई थ्रूपुट स्क्रीनिंग कोर को स्वीकार करना चाहते हैं, गैर-मानव रहनुमा आइलेट आइसोलेशन के लिए डॉ पॉल कीविट (ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी) और एरिक डोनाह्यू (वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय) चित्रा 1 के साथ सहायता के लिए। जेएमई को पुरस्कार संख्या T32GM007347 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के NIGMS द्वारा समर्थित किया गया था । एमजी NIH/NIDDK (R24DK090964-06) और दिग्गजों मामलों के विभाग (BX003744) द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
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