Summary
Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.
Abstract
RNA susturma ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş, diziye özgü gen düzenleme mekanizmasıdır. Çeşitli bitki patojenleri konak bitki RNA susturma yolu inhibe yeteneği ile proteinler gelişti. Virüs efektörü proteinlerinin aksine, sadece birkaç salgılanan efektör proteinbakteriyel, oomisel ve mantar patojenlerinde RNA susturma yeteneğini göstermiştir ve çoğu efektörmoleküler fonksiyonları büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, rna susturma gözlemlemek ve bitki patojenleri tarafından salgılanan efektör proteinleri karakterize etmek için genel bir yöntem olarak hizmet verebilecek ortak infiltrasyon tsay'ın biraz değiştirilmiş bir versiyonunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Yaklaşımın temel adımları sağlıklı ve tam olarak gelişmiş yaprakları seçmek, bakteri kültürünü 600 nm'de uygun optik yoğunluğa (OD) ayarlamak ve sızmış olan da optimum zamanda yeşil floresan proteini (GFP) floresanını gözlemlemektir. zayıf bastırma aktivitesi ile etkileri atlayarak önlemek için bırakır. Bu geliştirilmiş protokol, RNA susturucu baskılayıcıların hızlı, doğru ve kapsamlı taranmasına katkıda bulunacak ve bu proteinlerin moleküler işlevlerini araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet verecektir.
Introduction
Son yirmi yılda, bitki hastalıklarına neden olan mikroorganizmaların genom dizilimindeki ivme, dizi bilgileri ile kodlanmış proteinlerin biyolojik işlevleri arasında giderek artan bir bilgi boşluğuna yol açmıştır1. Sıralama projelerinin ortaya çıkardığı moleküller arasında doğuştan gelen bağışıklığı baskılayan ve konak kolonizasyonunu kolaylaştıran efektör moleküller; bu faktörler bakteriler, nematodlar ve ipliksi mikroplar da dahil olmak üzere yıkıcı bitki patojenleri tarafından salgılanır. Bu tehditlere yanıt vermek için, konak bitkiler bu efektörleri tanıyan yeni reseptörler gelişti, bağışıklık yanıtının restorasyonu sağlayan. Bu nedenle, efektörler çeşitli seçici baskılara tabidir, patojen soyları arasında efektör repertoireçeşitlenmesine yol açan2. Son yıllarda, bitki patojenleri putatif etkileri sinyal yollarının disregülasyonu da dahil olmak üzere çeşitli şekillerde mikroplar yararına konak hücresel süreçleri engelleyerek bitki doğuştan bağışıklık bozmak için gösterilmiştir, transkripsiyon, hücre içi ulaşım, sitoiskelet istikrar, vezikül ticareti, vezikül ticareti, ve RNA silele3,4,5. Ancak, patojen efektörlerin büyük çoğunluğu, özellikle filamentöz patojenler olanlar, esrarengiz kalmıştır.
RNA susturma ökaryotlar arasında korunan homoloji aracılı gen inaktivasyon makinalarıdır. Süreç uzun çift telli RNA (dsRNA) tarafından tetiklenir ve homolog tek iplikçikli RNA (ssRNA) bir dizi özgü bir şekilde hedefler ve antiviralsavunma6 dahil biyolojik süreçlerin geniş bir yelpazede manipüle. Konakçının doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini aşmak için, bazı virüsler RNA'nın susturulmasını dengelemek için evrimleşmiştir, hücre içi bölmelerde çoğalma veya susturma yeniden organize edilmiş sinyalden kaçma yeteneği de dahil olmak üzere. Bununla birlikte, virüslerin genomlarını RNA susturma bağımlı gen fonksiyonu kaybına karşı korumaları en genel strateji, RNA'yı susturan spesifik proteinleri kodlamaktır7,8. Çeşitli mekanistik farklı yaklaşımlar ekran ve RNA susturucu viral bastırıcılar karakterize kurulmuştur (VSR), Agrobacterium tumefaciens kültürlerin co-infiltrasyon dahil, putatif bastırıcılar ifade transgenik bitkiler, aşılama ve hücre kültürü9,10,11,12,13.
Bu tahlillerin her biri avantajları ve dezavantajları vardır ve VsR'ları kendi farklı bir şekilde tanımlar. En yaygın yaklaşımlardan biri, Nicotiana benthamiana 16c bitkileri üzerinde potansiyel viral protein ve muhabir gen (genellikle yeşil floresan protein [GFP]) barındıran bireysel A. tmuefaciens kültürlerin eş-infiltrasyon dayanmaktadır eş selabahar mozaik virüs 35S organizatörü kontrolü altında GFP ifade. Aktif bir viral susturucu baskılayıcı yokluğunda, GFP konak hücreleri tarafından eksojen olarak tanımlanır ve 3 gün post-infiltrasyon (dpi) içinde susturulur. Buna karşılık, viral protein bastırma aktivitesi varsa, GFP ifade düzeyi 3−9 dpi9ötesinde sabit kalır. Bu ortak infiltrasyon tsay basit ve hızlı; ancak, ne son derece kararlı ne de hassas. Yine de, titreyen birçok RNA virüsleri çeşitli protein dizileri ve yapıları ile çok sayıda VSR tespit etmiştir7,8.
Son zamanlarda, hücresel RNA susturma aktivitesiinin inhibe edebilirsiniz çeşitli efektör proteinler bakteriyel karakterize edilmiştir, oomisin, ve mantar bitkisi patojenler14,15,16. Bu bulgular, RNA susturma bastırma çoğu krallıkta patojenler tarafından kullanılan enfeksiyonu kolaylaştırmak için ortak bir strateji olduğunu ima eder. Teoride, birçok, hepsi değilse de, efektörlerr rna susturucular (RSSs) kodlamak olabilir; ancak bugüne kadar, özellikle güvenilir ve genel tarama stratejisinin yetersizliği nedeniyle sadece birkaç ı tespit edilmiştir. Ayrıca, Bitki patojenlerinin büyük çoğunluğunda RNA susturucuları araştırılmamıştır17.
Bu raporda, tarımsal infiltrasyon testini kullanarak lokal ve sistemik RNA susturmalarını bastırabilen bitki patojen efektörlerini belirlemek için optimize edilmiş ve genel bir protokol sunacağız. Bu çalışmanın en önemli amacı protokolün temel yönlerini vurgulamak ve adımları ayrıntılı olarak açıklamak, böylece bitki patojenlerinin hemen hemen tüm etkileri için uygun bir tarama testsağlamaktı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Prosedürün tüm adımları oda sıcaklığında (RT) yapılmalıdır.
DİkKAT: Patojen mikroplar içeren tüm ortamların yanı sıra, tetkikte kullanılan bitki ve bitki dokusunu, atmadan önce uygun atık kaplarına ve otoklava yatırın.
1. Putatif efektörler içeren plazmid yapılarının hazırlanması
- RNA dizilimi (RNA-Seq) tarafından ve daha nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tekniği ile belirlendiği gibi, enfeksiyon sırasında yüksek oranda ifade edilen putatif salgılanan efektörleri seçin.
- SignalP18gibi bir yazılım aracı kullanarak her efektörün sinyal peptid dekolte alanını belirleyin.
- Yüksek sadakatLI DNA polimeraz kullanarak ilgi nin efektörünün kodlayıcısını kodlayan geni yükseltmek için astar tasarla ve PCR gerçekleştirin. PCR ürün kontrol etmek için agarose jel elektroforez gerçekleştirin, sonra ligasyon içermeyen klonlama kiti kullanarak Ağ Geçidi giriş vektörpQBV3 içine amplicon klonlamak(Malzeme Tablosu), ve daha sonra hedef ifade vektör pEG100 içine LR rekombinasyon reaksiyonu kullanarak19.
- 3−5 μL LR reaksiyon karışımını 100 μL yetkin E. coli hücresine dönüştürün (örneğin, TOP10, DH5α), luria-Bertani (LB) agar ortamına 50 μg/mL kanamisin ile takviye edilmiş dönüştürülmüş bakteri hücrelerini yayıtıp 37 °C'de 16−20 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Pozitif transformatörler koloni PCR20 ile tespit edilebilir ve plazmid miniprep ve sıralama ile daha fazla analiz edilebilir. - 50−100 ng rekombinant plazmidi kimyasal olarak yetkin A. tumefaciens hücrelerinin 100 μL içine efektör protein taşıyan tanıtın, yavaşça karıştırın ve sonra sıvı nitrojen içinde 1 dakika boyunca dondurma.
- 500 μL LB suyu ekleyin ve inkübat30 °C'de 4−6 saat boyunca hafif çetrenleme ile ve 50 g/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin ile desteklenen LB agar ortamındaki tüm tarım bakterihücrelerini 2 gün boyunca 30 °C'de aktarın ve yayın.
NOT: Pozitif klonlar koloni PCR ile doğrulanabilir. - Aksi belirtilmedikçe, tarımsal sızma deneyleri için tek bir dönüştürülmüş koloni kullanın.
NOT: Bu araştırmada, test edilen efektör genlerin hiçbiri tahmin edilen intronlar içermesin; genlerin her biri doğrudan bir Phytophthora sojae izole genomik DNA'dan güçlendirilmiş oldu. Etiketsiz bir Ağ Geçidi bitkisi ifade vektörü önerilir, ancak gerekli değildir.
2. N. benthamiana 16c bitkilerin hazırlanması
- 20 dk boyunca 120 °C'de %50 turba yosunu, %30 perlit ve %20 vermikülitten oluşan çömlekçilik toprak karışımları hazırlayın.
- Otoklavlı toprak karışımlarını bitki gübresi çözeltisi (1 g/L) ile ıslatın ve daha büyük bir tepside (540 mm x 285 mm x 60 mm) saklanan daha küçük tencerelere (80 mm x 80 mm x 75 mm) yerleştirin.
- Her potun toprak yüzeyine N. benthamiana 16c bir veya iki tohum ekin. Plastik bir kubbe ile tepsi kapağı ve tohumlar çimlenmesağlar.
- Tepsiyi 23−25 °C sıcaklık, %50−60 bağıl nem ve uzun gün fotoperamı (14 saat açık/10 h karanlık, aydınlatma 130−150 μE·m-2s-1sıcaklıkile hafif ve sıcaklık kontrollü büyüme odalarının altına yerleştirin.
- Tohumlar çimlandıktan sonra (3−4 gün) plastik kubbeyi çıkarın ve fidelerin çimlenme adımında kullanılan koşullarda büyümesini bekleyin.
- Her 2−3 günde bir, toprağı nemli ama ıslatmayan uygun miktarda su ekleyin; daha fazla büyüme teşvik etmek için her 10 günde gübre ekleyin. N. benthamiana 16c tesislerini kullanıma hazır olana kadar normal şartlaraltında koruyun; Bu aşamada bitki en az beş tam olarak geliştirilmiş gerçek yaprakları ve görünür aksilla veya çiçek tomurcukları olmalıdır, ve yaprakları sağlıklı bir yeşil görünüme sahip olmalıdır).
- Yerel RNA susturma tahlilleri için N. benthamiana 16c'nin 3−4 haftalık yapraklarını ve sistemik RNA susturma tahlilleri için genç N. benthamiana 16c bitkilerini (10−14 günlük) kullanın.
NOT: Bitki büyüme koşulları ve tesisleri laboratuvarlar arasında farklılık gösterir; sızma için sağlıklı, iyi gelişmiş ve tamamen genişletilmiş yaprakları seçin.
3. Sızma için Agrobacterium kültürünün hazırlanması
- LB plakasından pozitif bir koloni seçin ve hücreleri 50 g/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin ile takviye edilmiş 5 mL LB orta içeren cam tüpe dönüştürün. Hücreleri 30 °C'de 24−48 saat boyunca 200 rpm'de sallayarak büyütün.
- Aynı antibiyotikler, 10 mM 2-(N-morfolino) etanesulfonik asit (MES; pH 5.6) ve 20 μM asetonipone (AS) ile birlikte 5 mL'lik LB ortamına 100 μL kültür aktarımı. 16−20 saat boyunca 200 rpm sallayarak 30 °C'de bakteri yetiştirin.
- 10 dk için 4.000 x g santrifüj hücreleri supernatant dökün ve 10 mMMgCl 2 tampon 2 mL pelet resuspend.
- Antibiyotiklerin tam olarak çıkarılmasını sağlamak için adım 3.3 tekrarlayın.
- 600 nm (OD600)optik yoğunluğu ölçerek Agrobacterium kültürünün yoğunluğunu belirleyin. 10 mM MgCl2 tamponile 1,5−2.0'lık Bir OD600'e ayarlayın.
- Son süspansiyon kültürlerine 10 mM MES (pH 5.6) ve 150 μM AS ekleyin ve hücreleri en az 3 saat sallayarak RT'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Son süspansiyon kültürlerini bir gecede bırakmayın.
4. Co-infiltrasyon N. benthamiana yaprakları
- 35S-GFP içeren bir Agrobacterium kültürünün eşit hacimli lerini 35S- salatalık mozaik virüs bastırıcı 2b (CMV2b), putatif efektör veya boş vektör (EV) içeren bir Agrobacterium kültürüyle karıştırın.
- N. benthamiana 16c yapraklarının abaxial taraflarında 1 mL iğnesiz şırınga kullanarak karışık agrobacterium süspansiyonlara dikkatlice ve yavaşça sızın.
- Yumuşak doku silecekleri ile yapraklarıkalan bakteriyel süspansiyon çıkarın ve bir yapıcı kalem ile sızmış yamalar marjları daire.
- Aynı büyüme koşulları altında büyüme odasında sızmış bitkiler bırakın.
NOT: Güvenlik ve sağlık nedenlerinden dolayı, sızma sırasında koruyucu göz gözlükleri ve maske takılmalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için eldivenler infiltrasyonlar arasında etanol ile değiştirilmeli veya sterilize edilmelidir. Normalde sızma için yaprak başına en az 1 mL agrobacterium süspansiyongereklidir. Sistemik susturma için, en az iki yaprak infiltrasyon için gerekli olacaktır.
5. GFP görüntüleme analizi
- Görme tüm bitkilerin yeni yetiştirilen yapraklarında GFP floresantespit 2 hafta post-infiltrasyon (sistemik RNA susturma için) veya yaprak toplama olmadan uzun dalga ultraviyole (UV) lamba kullanarak yaprakları 3−4 dpi sızmış yamalar.
- Uv ve sarı filtrelerle donatılmış bir dijital kamera ile toplanan bitkileri ve/veya müstakil yaprakların fotoğrafını çekin.
NOT: Yerel susturma bastırma tahlilleri için, N. benthamiana 16c yaprakların sızmış yamaları araştırmak, sistemik susturma bastırma etkinliği için ise, yeni yetiştirilen yaprakları araştırmak. RNA susturma bastırma etkinliği bireysel efektörler arasında değişebilir. Bu nedenle, 3 dpi başlayan birkaç gün içinde yamalar veya yaprakları gözlemleyin. CMV2b ve EV'i sırasıyla pozitif ve negatif denetimler olarak kullanın.
6. Sızmış yapraklarda GFP mRNA düzeylerinin kuzey leke analizi
- RNA izolasyon reaktifi kullanılarak yaprak dokusundan toplam RNA izolasyonu (Malzeme Tablosu)
- 4−7 dpi'de sızmış N. benthamiana 16c yamaları yaprak dokuları toplamak, ince bir toz sıvı azot pulverize, ve steril bir 2 mL tüp için toz aktarın.
- RNA izolasyon reaktifini (1 mL/100 mg doku) kaputtaki örneklenmiş tüpe hemen ekleyin, homojenate için şiddetle sallayın ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Bir kaputtaki her tüpe kloroform (200 μL/1 mL RNA izolasyon reaktifi) ekleyin, 15 s'lik bir kuvvetle sallayın ve RT'de 5 dk. 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g homojenin inkübünü ekleyin.
- Supernatant'ı yeni bir RNase-free tüpüne aktarın ve peleti atın. Supernatant için 0,7 hacimli isopropanol ekleyin, nazikçe birkaç kez ters ve 10 dakika boyunca RT karışımı kuluçka.
- RNA peletini 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj ile çökeltin.
- Supernatant atın,% 70 etanol ile pelet yıkayın ve bir başlık pelet hava-kuru. RNA'yı 65 °C'lik bir su banyosunda 10−20 dakika kuluçkaya yatarak diethyl pyrocarbonate (DEPC) ile işlenmiş suda çözün.
- Sızmış yapraklarda GFP mRNA seviyesinin kuzey leke analizi
- 1x MOPS çalışan tampon bir% 1.2 formaldehit denaturing agarose jel hazırlayın.
- RNA 1:1'i RNA yükleme boyası ile karıştırın ve kuluçka ile denatüre 10 dakika boyunca 65 °C'de, denatüre edilmiş numuneleri 1 dakika boyunca buz üzerinde hemen soğutun.
- RNA iyi ayrılana kadar 50 dakika için 100 V jel ve elektroforse örnekleri yükleyin.
- Formaldehit kaldırmak ve 20x SSC tampon gecede kılcal transfer ile naylon membran jel transfer 20x tuzlu sodyum sitrat (SSC) tampon jel durulamak. Membranı 2x SSC'de ıslatın ve ıslak membranı UV çapraz bağlamaya maruz bırakarak RNA'yı membrana sabitle.
- Uygun miktarda hibridizasyon tamponu ekleyin (100 cm2 membranbaşına 10 mL; Malzeme Tablosu) bir hibridizasyon tüpü nde ve 60 °C'de bir melezleme fırınında çalkalayın.
- Membranı hibridizasyon tüpüne koyun ve 60 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın. Önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu içeren hibridizasyon çözeltisine 5'DIG etiketli DNA probu (son konsantrasyon, 50 ng/mL) seyreltin.
- Prehibridizasyon arabelleği atın ve hemen DIG etiketli prob içeren önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin. Lekeyi bir gecede 60 °C'de prob ile hafif bir ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
- Hibridizasyondan sonra membranı her biri 20 dakika boyunca 60 °C'de artan sıkılık tamponlarında iki kez yıkayın. Ekstra yıkama tamponunu çıkarmak için membranı hafifçe silin ve kemilüminesan hibridizasyon ve algılama kitinde önerildiği gibi reaktifler ekleyin(Malzeme Tablosu).
- Görüntüleme sistemi ile birlikte kemilüminesans reaksiyonu ile hibrid sinyalleri tespit edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda, P. sojae RxLR efektörlerinin RSS aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiş bir tarama tetkik için adım adım prosedürü açıklıyoruz. Deney toplamda 5−6 hafta sürer. Daha sonra, tetkik ile tanımlanan RSSs daha fonksiyon ve moleküler mekanizma açısından karakterize edilebilir. Yaklaşımımıza örnek olarak, enfeksiyon sırasında haustoria yoluyla salgılanan ve konak hücrelere teslim edilen RNA susturucu 1 'in (PSR1) P. sojae RxLR effecto Phytophthora bastırıcısını kullandık.
PSR1'in RSS aktivitesi olduğunu ve bu nedenle bu yöntem için uygun olduğunu doğrulamak için, dönüştürülmüş her agrobacterium türü 35S-GFP barındıran bir zorlanma ile karıştırıldı ve N. benthamiana 16c yapraklarına sızdı. EV ve CMV2b sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır (Şekil 1). GFP ekspresyonu 2−3 dpi'de tüm karışımlarla sızmış yapraklarda en yüksek seviyeye ulaştı. Yeşil floresan yoğunluğu gözlem216−9 günlük bir süre boyunca 35S-GFP artı CMV2b ile birlikte sızmış yamalar güçlü kaldı. GFP'nin PSR1 ile birlikte sızması, sızmış yamalardaki yüksek floresan ile gösterildiği gibi, 3,5−4,5 günlük gözlem süresi boyunca daha güçlü GFP floresanlarıyla sonuçlandı. Ancak 35S-GFP ve EV ile sızan yamalardaki floresan yoğunluğu 3 dpi'de zayıfladı. 4−5 dpi'de GFP floresansı zor saptanabildi (Şekil 1).
Kuzey leke gfp mRNA 35S-GFP artı 35S-CMV2b veya 35S-GFP artı 35S-PSR1 ifade yapraklarında 35S-GFP artı EV ifade daha yüksek birikmiş olduğunu ortaya koymuştur(Şekil 2). Böylece, PSR1'in transkripsiyonel ekspresyonu ve CMV2b GFP mRNA'nın stabilizasyonuna katkıda bulunmuş ve bu da GFP floresansının yükselmesine neden olmuştur.
Ayrıca 2 haftalık N. benthamiana 16c fidelerinin yapraklarındaki susturma sinyalinin yayılmasını değerlendirmek için tarımsal infiltrasyon analizini kullandık. Bu amaçla, biz genellikle bütün yaprak enjeksiyonu için 3−4 büyük yaprakları seçti. 14 dpi'de, EV'in %98'den fazlası sistemik yapraklarda GFP sinyali göstermezken, hem PSR1 hem de CMV2b, eş infiltratlanmış bitkilerin yaklaşık %80'inde GFP floresanını gözlemleyerek susturma sinyalinin sistemik yayılmasını etkin bir şekilde inhibe etti ve geri kalan %20'sinde ise yeni ortaya çıkan yapraklarda sadece birkaç kırmızı damar ortaya çıktı(Şekil 3).
Şekil 1: Phytophthora sojae RxLR efektörü PSR1 Nicotiana benthamiana yerel RNA susturma bastırır (N. benthamiana) 16c bitkiler. 3−4 haftalık N. benthamiana 16c bitkilerinin (sol panel) tam olarak geliştirilmiş yaprakları, 35S-GFP taşıyan Agrobacterium karışımları ve her görüntünün üzerinde belirtilen yapılarla birlikte sızdı. Sızmış alanın GFP floresansı doğal ışık altında (orta panel) ve uzun dalga UV ışığı (sağ panel) 4 dpi'de görüntülenmiştir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. Kırmızı oklar sızmış yaprakları temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sızmış N. benthamiana 16c yapraklarında GFP mRNA birikimi. CK ve EV n. benthamiana 16c yalnız yaprakları temsil ve 16c 35S-GFP artı EV ile birlikte sızmış yaprakları. EV ve CMV2b'den alınan örnekler sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak kullanıldı. Buna ek olarak, rRNA yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: P. sojae RxLR efektörü PSR1 N. benthamiana 16c bitkilerde sistemik RNA susturma bastırır. 2 haftalık N. benthamiana 16c fidelerinin (sol panel) üç ya da dört yaprağı, 35S-GFP barındıran Agrobacterium ve 35S organizatöründen PSR1 veya CMV2b'yi ifade eden EV veya vektör tarafından geçici olarak sızdı. Yeni yetiştirilen yaprakların GFP floresansı doğal ışık altında (üst panel) ve uzun dalga UV ışığı (alt panel) 14 dpi'de görüntülendi. Bu deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. Kırmızı oklar sızmış yaprakları gösteriyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA susturma viral, bakteriyel, oomycete ve mantar patojenleri ile mücadele için bitkiler tarafından kullanılan önemli bir savunma mekanizmasıdır. Buna karşılık, bu mikroplar antiviral susturma karşı susturucu proteinleri susturma evrimleşmiş, ve bu RSSs RNA susturma yolu farklı adımları ile müdahale22,23. RSSS10'utanımlamak için çeşitli tarama denemeleri geliştirilmiştir.
Burada, P. sojae tarafından salgılanan ve konakta RNA susturma yeteneğini bastırmak için enfeksiyon üzerine konak hücreye salgılanan etkileyici proteinlerin taranması için geliştirilmiş bir protokol uyguluyoruz. Bu değiştirilmiş test viral co-infiltrasyon tsay dayanmaktadır ama birkaç önemli şekillerde farklıdır. İlk olarak, hem bakteri ve N.benthamiana 16c bitkiler güçlü ve sağlıklı olmalıdır; bu bakterilerden gelen efektörlerin kararlı ekspresyonu için çok önemlidir ve tam gelişmiş N.benthamiana 16c kullanımı deneysel tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik sağlar. Biz genellikle bitkisel büyüme aşamasında bitki başına sadece iki veya üç tam gelişmiş yaprakları kullanmak, eski ve yeni ortaya çıkan yaprakları uygun değildir. İkinci olarak, bakteri kültürünün OD600 optimal değerine ayarlanmalıdır, genellikle 0.75−1.0 Agrobacteriumiçin . Daha düşük bir OD600 (0,2 kadar düşük bile) VSR'ları taramak için kullanılabilir, ancak PSR24'üdeğil. Üçüncü olarak, yeşil floresan araştırmak için ideal bir zaman noktası her efektör için optimize edilmelidir. Virüs, gfp artı putatif VSR içeren kültürler ile birlikte enjekte yaprakları 3 dpi infiltrasyon alanında yeşil floresan belirgin bir artış sergiler, ve sinyal kadar yüksek kalır 9 dpi22, ama sadece sergilendi 4 veya 5 psrs için mevcut çalışmada dpI. Bu nedenle, GFP mRNA birikimini ölçerek RNA susturma etkinliğini daha da onaylamak da önemlidir. Son olarak, uygun denetimi kullanmak esastır. VsR'ler her zaman efektör proteinlerini tanımlamak için ideal pozitif kontroller değildir, çünkü bu proteinler PsR'lerden çok daha güçlü bastırıcı aktiviteye sahiptir. Bu, RNA susturma zayıf bastırıcıları tespit başarısızlığa neden olabilir.
Bu raporda, Fitophthora ve Puccinia graminis patojenlerinde RNA susturucularının baskılayıcılarını taramak için modifiye edilmiş analizimizin kullanımını gösteriyoruz. Böylece, bizim yöntem rsss kodlayan potansiyel efektörleri karakterize etmek için yararlı bir araç temsil eder, hangi küçük RNA birikimiin inhibe ederek hastalık yatkınlık teşvik15,16,17. Bu nedenle, protokolümüzün bitki patojenleri tarafından salgılanan efektörleri taramak için geniş ölçüde kullanılabileceğine inanıyoruz. Gelecekteki çalışmalar, diğer patojenlerde daha fazla RSSs belirlenmesi ve işgalci mikroplara karşı bitki savunma sında RNA susturma rolünü nnetilmesi üzerinde durulacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Şangay Eğitim Geliştirme Vakfı ve Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı "Shuguang Programı" hibe tarafından desteklenmiştir ( 2018YFD0201500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 31571696 ve 31660510), Çin Genç Profesyoneller için Bin Yetenek Programı ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
