Summary
在这里，我们提出了一种经过改良的筛选方法，该方法可广泛用于快速筛选植物病原体中的RNA沉默抑制剂。
Abstract
RNA沉默是真核生物中一种进化保存的序列特异性基因调控机制。几种植物病原体已经进化出蛋白质，能够抑制宿主植物RNA沉默途径。与病毒效应蛋白不同，只有几种分泌效应蛋白显示出抑制细菌、卵母细胞和真菌病原体中RNA沉默的能力，大多数效应器的分子功能在很大程度上仍不得而知。在这里，我们详细介绍了共渗透测定的稍作修改版本，可作为观察RNA沉默和描述植物病原体分泌的效应蛋白的通用方法。该方法的关键步骤是选择健康且完全发育的叶子，在 600 nm 处将细菌培养值调整为适当的光学密度 （OD），并在渗透的最佳时间观察绿色荧光蛋白 （GFP） 荧光叶，以避免省略抑制活性较弱的效应器。这种改进的修饰方案将有助于快速、准确和广泛的RNA沉默抑制剂的筛选，并作为研究这些蛋白质的分子功能的一个极好的起点。
Introduction
在过去的二十年里，导致植物疾病的微生物基因组测序的加速导致了序列信息与编码蛋白1的生物功能之间的知识差距越来越大。在测序项目揭示的分子中，有抑制先天免疫和促进宿主殖民化的效应分子;这些因素由破坏性的植物病原体分泌，包括细菌、线虫和丝状微生物。为了应对这些威胁，宿主植物已经进化出新的受体来识别这些效应者，从而恢复免疫反应。因此，效应器受到各种选择性压力，导致病原体谱系中的效应器谱系多样化。近年来，植物病原体的假定效应器已被证明会破坏植物先天免疫，阻碍宿主细胞过程，使微生物以各种方式受益，包括信号通路调节失调、转录、细胞内迁移、细胞骨架稳定性、囊泡贩运和RNA沉默3、4、5。然而，绝大多数病原体效应者，特别是来自丝状病原体的病原体，仍然神秘莫测。
RNA沉默是一种同源介导的基因失活机制，在真核生物中保存。这个过程由长双链RNA（dsRNA）触发，以序列特异性的方式瞄准同源单链RNA（ssRNA），并操纵广泛的生物过程，包括抗病毒防御6。为了克服宿主的先天免疫反应，一些病毒已经进化，以抵消RNA沉默，包括能够在细胞内腔内复制或从沉默重组信号中逃脱的能力。然而，病毒保护其基因组免受RNA沉默依赖基因功能丧失的最普遍策略是编码抑制RNA沉默的特异性蛋白质。已经建立了几种机械不同的方法来筛选和表征RNA沉默（VSRs）的病毒抑制剂，包括共同渗透的农业细菌，表达假定抑制剂的转基因植物，移植和细胞培养9，10，11，12，13。
每种检测都有优缺点，并且以自己独特的方式识别 VSR。最常见的方法之一是基于个体A.tmuefaes培养物的共同渗透，这种培养物蕴藏着潜在的病毒蛋白和报告基因（通常是绿色荧光蛋白[GFP]）在尼科蒂亚纳本查米亚纳16c植物的构成下在花椰菜马赛克病毒35S启动子的控制下表达GFP。在没有活性病毒沉默抑制器的情况下，GFP被宿主细胞识别为外源性，并在渗透后3天内沉默（dpi）。相比之下，如果病毒蛋白具有抑制活性，GFP的表达水平稳定在3~9 dpi9以上。这种共渗透测定简单快捷;然而，它既不高度稳定，也不敏感。尽管如此，该测定已经鉴定出许多VSR具有不同的蛋白质序列和结构在许多RNA病毒7，8。
最近，几种能抑制细胞RNA沉默活性的效应蛋白已被细菌、卵母细胞和真菌植物病原体14、15、16所制成。这些发现表明，RNA沉默抑制是大多数王国的病原体使用的常见策略，促进感染。从理论上讲，许多（如果不是全部）效应器可能编码RNA沉默抑制器（RSS）;然而，迄今为止，只确定了少数，主要原因是缺乏可靠和一般性的筛查战略。此外，在绝大多数植物病原体中，尚未对RNA沉默抑制器进行研究。
在本报告中，我们提出了一个优化的一般方案，用于识别植物病原体效应器，该效应器可以使用农业渗透测定抑制局部和系统性RNA沉默。本研究的首要目标是强调协议的关键方面，并详细描述步骤，从而提供适合几乎所有植物病原体效应物的筛选测定。
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Protocol
注：程序的所有步骤应在室温 （RT） 下执行。
注意：在丢弃之前，将所有含有致病微生物的介质以及测定中使用的植物和植物组织放入适当的废物容器和高压灭菌器中。
1. 制备含有假定效应器的质粒结构
- 选择在感染过程中高度表达的假定分泌效应器，由RNA测序（RNA-Seq）确定，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）技术进一步测定。
- 使用信号P18等软件工具确定每个效应器的信号肽裂解位点。
- 设计引物并执行PCR，以利用高保真DNA聚合酶放大编码感兴趣的效应器的基因。执行抗胶胶电泳检查PCR产物，然后使用无结扎克隆试剂盒（材料表）将阿马基龙克隆到网关进入载体pQBV3中，然后使用LR重组反应19将目标表达载体pEG100克隆。
- 将3⁄5μL的LR反应混合物转化为100μL的合格大肠杆菌细胞（例如TOP10，DH5+），将转化后的细菌细胞在Luria-Bertani（LB）琼脂基培养物上传播，辅以50μg/mL卡那霉素，并在37°C孵育16⁄20小时。
注：正转化剂可以通过菌群PCR20进行识别，并通过质粒小制备和测序进一步分析。 - 将携带效应蛋白的重组质粒引入100 μL的化学能力A.肿瘤细胞（例如，GV3101或C58C1），轻轻混合，然后在液氮中冷冻1分钟。在37°C水浴中将细胞解冻5分钟。
- 加入500μL的LB肉汤，在30°C下孵育4~6小时，轻轻摇动，然后在LB琼脂介质上转移和传播所有农业细菌细胞，辅以50微克/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素，在30°C下进行2天。
注：阳性克隆可以通过菌群PCR进行验证。 - 除非另有指示，否则使用单个转化菌落进行农业渗透实验。
注：在本研究中，没有一个测试效应基因包含预测中子;每个基因都直接从植物性脑素分离物的基因组DNA中扩增。建议使用不带任何标记的网关植物表达式矢量，但不是必需的。
2. 制备N.本查米亚纳16c植物
- 准备灌注土壤混合物，包括（体积）50%泥炭苔、30%珀利特和20%萤石，并在120°C下进行高压灭菌20分钟。
- 将浸灭的土壤与植物肥料溶液（1 g/L）混合，然后将它们分装成小锅（80 毫米 x 80 毫米 x 75 毫米），储存在较大的托盘中（540 mm x 285 mm x 60 mm）。
- 将一两粒N.本查米亚纳16c种子播种到每个锅的土壤表面。用塑料圆顶盖住托盘，让种子发芽。
- 将托盘置于温度为 23~25 °C、相对湿度为 50–60% 且光周期长（14 小时光/10 小时为暗，照明为 130*150 μEμm-2s-1） 的光线和温度控制生长室下。
- 种子发芽后（3⁄4天）取下塑料圆顶，让幼苗在用于发芽步骤的相同条件下生长。
- 每2~3天加入适量的水，保持土壤湿润但不浸泡;每10天加一次肥料，以促进进一步的生长。在正常条件下保持N.本查米亚纳16c植物，直到它们准备好使用;在这个阶段，植物应该有至少五个完全发育的真叶，没有可见的阿丝兰或花蕾，叶子应该有一个健康的绿色外观）。
- 使用3⁄4周老叶N.本查米亚纳16c局部RNA沉默测定，和年轻的N.本特哈米亚纳16c植物（10-14天大）进行全身RNA沉默测定测定。
注：工厂生长条件和设施因实验室而异;选择健康、发育良好和完全膨胀的叶子进行渗透。
3. 培养用于渗透的农业细菌培养
- 从LB板中挑选一个正位团，将细胞接种到含有5 mLLB介质的玻璃管中，辅以50微克/mL卡那霉素和50μg/mL利夫霉素。在 30°C 下生长细胞，在 200 rpm 下摇动 24-48 小时。
- 将100μL培养物转移到5 mL的LB培养基中，辅以相同的抗生素、10 mM 2-（N-变形）乙酸（MES;pH 5.6）和20μM醋酸（AS）。在 30°C 下生长细菌，在 200 rpm 下摇动 16~20 小时。
- 在4，000 x g下将离心机细胞排出10分钟，将上清液倒入，并在2 mL的10 mM MgCl2缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 重复步骤3.3，以确保完全去除抗生素。
- 通过测量 600 nm （OD600） 的光学密度来确定农业细菌培养物的密度。使用 10 mM MgCl2缓冲液调节到 1.5×2.0 的 OD600。
- 在最终悬浮培养物中加入10 mM MES（pH 5.6）和150 μM AS，并在RT下孵育细胞至少3小时而不颤抖。
注：请勿在一夜之间离开最终的悬挂培养物。
4. 共同渗透N. 本查米亚纳叶
- 将含有 35S-GFP的农业细菌培养物与含有 35S-黄瓜马赛克病毒抑制器 2b （CMV2b）、假定效应器或空载体 （EV）的农业细菌培养物混合。
- 使用1mL无针注射器小心而缓慢地渗透到N.benthamiana 16c叶的轴侧的混合农用细菌悬浮液。
- 用软组织雨刷器从叶子上取出剩余的细菌悬浮液，并用制造商笔圈入渗透斑块的边缘。
- 在相同的生长条件下，将渗透的植物留在生长室中。
注意：出于安全和健康原因，在渗透过程中应佩戴防护护目镜和口罩。为了防止交叉污染，在渗透之间应更换手套或用乙醇消毒手套。通常渗透需要每叶至少1mL的农业细菌悬浮液。对于系统沉默，渗透至少需要两片叶子。
5. GFP成像分析
- 使用无叶收集的长波紫外线 （UV） 灯，在渗透后 2 周（用于全身RNA 沉默）或渗透的叶子斑块 3⁄4 dpi 中目视检测整个植物新生长的叶子中的 GFP 荧光。
- 使用装有紫外线和黄色滤光片的数码相机拍摄收集的植物和/或分离的叶子。
注：对于局部沉默抑制的检测，调查渗透的N.benthamiana 16c叶的渗透斑块，而对于系统沉默抑制活动，调查新生长的叶子。RNA沉默抑制活性可能因单个效应器而异。因此，观察补丁或离开在几天内从3 dpi开始。分别使用 CMV2b 和 EV 作为正负控制。
6. 渗透叶中GFP mRNA水平的北方污点分析
- 使用RNA分离试剂从叶组织分离总RNA （材料表）
- 以4⁄7 dpi从渗入的N.benthamiana 16c片中收集叶组织，用液氮粉碎成细粉，并将粉末转移到无菌的2 mL管中。
- 立即将RNA分离试剂（1 mL/100mg组织）加入抽油烟机的取样管中，大力摇动以均质化，并在RT孵育5分钟。
- 将氯仿（200 μL/1 mL RNA分离试剂）加入罩内每个管中，大力摇动15秒，并在RT下孵育5分钟。 在4°C下，在12，000 x g下将均质电离15分钟。
- 将上清液转移到新的无RNase管中，并丢弃颗粒。将0.7体积异丙醇加入上清液，轻轻反转几次，并在RT处孵育混合物10分钟。
- 在4°C下，在12，000 x g下通过离心沉淀RNA颗粒15分钟。
- 丢弃上清液，用 70% 乙醇清洗颗粒，并在罩中空气干燥颗粒。在65°C水浴中孵育10~20分钟，将RNA溶解在二乙酰热碳酸酯（DEPC）处理水中。
- 渗透叶中GFP mRNA水平的北方污点分析
- 在1x MOPS运行缓冲液中制备1.2%甲醛变性胶。
- 将RNA 1：1与RNA加载染料混合，在65°C孵育10分钟，立即在冰上冷却变性样品1分钟。
- 将样品以100 V加载在凝胶和电液上50分钟，直到RNA分离良好。
- 在 20x 盐碱-柠檬酸钠 （SSC） 缓冲液中冲洗凝胶，以去除甲醛，并通过毛细管在 20x SSC 缓冲液中转移凝胶到尼龙膜过夜。将膜浸泡在 2x SSC 中，通过将湿膜暴露在紫外线交联中，将RNA固定在膜上。
- 加入适量的杂交缓冲液（每100厘米2膜10 mL;材料表）在杂交管中，在60°C的杂交炉中搅拌。
- 将膜放入杂交管中，在60°C下孵育60分钟。将5'DIG标记的DNA探针（最终浓度，50纳克/mL）稀释到含有预热杂交缓冲液的杂交溶液中。
- 放弃预混合缓冲液，立即替换为包含 DIG 标记探头的预预热杂交溶液。在60°C的温度下孵育了10°C的斑点，具有温和的搅拌。
- 杂交后，在60°C的缓冲液中洗涤膜两次，每次20分钟。轻轻擦拭膜以去除额外的洗涤缓冲液，并添加试剂，如化学发光杂交和检测试剂盒（材料表）中的建议。
- 通过化学发光反应与成像系统相结合，检测杂交信号。
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Representative Results
在上面，我们描述了用于改进筛选检测的分步程序，以评估P. sojae RxLR 效应器的 RSS 活性。实验总共需要5到6周。随后，测定所识别的RSS可以在功能和分子机制方面进一步描述。作为我们方法的一个示例，我们使用RNA沉默1（PSR1）的P.sojae RxLR效应抑制剂，在感染期间通过haustoria分泌并输送到宿主细胞中。
为了确认PSR1具有RSS活性，因此适合这种方法，每个转化的农业细菌菌株与含有35S-GFP的菌株混合，并渗透到N.benthamiana 16c的叶子中。EV和CMV2b分别用作负控制或正控制（图1）。GFP表达达到最高水平的叶子渗透与所有混合物在2×3 dpi。在观察21日的6~9天期间，绿色荧光强度在与35S-GFP加CMV2b共同渗透的片块中保持强劲。在3.5-4.5天的观察期间，GFP与PSR1的共渗透也导致更强的GFP荧光，渗透斑块中的荧光升高就证明了这一点。然而，在35S-GFP和EV渗透的斑块中的荧光强度在3 dpi减弱。在 4⁄5 dpi 时，GFP 荧光几乎无法检测到 （图 1）。
北方斑点显示，GFP mRNA在表达35S-GFP加上35S-CMV2b或35S-GFP加35S-PSR1的叶子中累积的高于表达35S-GFP加EV的叶子（图2）。因此，PSR1和CMV2b的转录表达有助于GFP mRNA的稳定，导致GFP荧光升高。
我们还使用农业渗透测定来评估2周大N.benthamiana 16c幼苗的叶子中沉默信号的传播情况。为此，我们通常选择3⁄4较大的叶子进行全叶注射。在14 dpi，超过98%的EV在系统性叶子中表现出明显无GFP信号，而PSR1和CMV2b通过观察约80%的共渗透植物的GFP荧光，有效地抑制了沉默信号的系统性传播，其余20%的渗透植物中只有很少红脉出现在新叶片中（图3）。
图1：植物性磷酸酶RxLR效应器PSR1抑制尼科蒂亚纳本塔米亚纳（N.本特哈米亚纳）16c植物的局部RNA沉默。完全发育的3⁄4周老的N.benthamiana 16c植物（左面板）的完全发育的叶子与携带35S-GFP的农用细菌混合物和每个图像上面所示的结构一起渗透。渗透区域的GFP荧光在4 dpi的自然光（中面板）和长波紫外光（右面板）下成像。实验重复两次，结果相似。红色箭头代表渗入的叶子。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在渗透的N.本查米亚纳16c叶中积累GFP mRNA。CK 和 EV 代表N. benthamiana 16c 叶单独和 16c 叶共同渗透与 35S-GFP 加上 EV。EV和CMV2b的样品分别用作负对照和正对照。此外，rRNA被用作载荷控制。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：P.sojae RxLR效应器PSR1抑制N.benthamiana16c植物的系统性RNA沉默。三或四片2周长的N.benthamiana 16c幼苗（左面板）被来自35S-GFP的农业细菌和来自35S启动子的EV或向量表达PSR1或CMV2b暂时地共同渗透。新生长的叶子的GFP荧光在自然光（上面板）和长波紫外光（下面板）下成像，为14 dpi。这个实验重复了两次，结果相似。红色箭头表示渗入的叶子。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
RNA沉默是植物对抗病毒、细菌、卵母和真菌病原体的关键防御机制。反过来，这些微生物已经进化了沉默抑制蛋白，以抵消抗病毒沉默，这些RSS干扰RNA沉默途径22，23的不同步骤。已经开发了几种筛选检测，以识别RSS10。
在这里，我们描述了一种改进的协议，用于筛选P.sojae在感染时分泌到宿主细胞中的有效蛋白，因为它们能够抑制宿主中的RNA沉默。这种修饰的测定基于病毒共渗透测定，但在几个重要方面有所不同。首先，细菌和N.benthamiana16c植物应充满活力和健康;这对细菌中效应器的稳定表达非常重要，使用完全开发的N.benthamiana 16c可确保实验的可重复性和可靠性。我们经常在植物生长阶段只使用每株完全发育的叶子两到三片，旧的和新生的叶子是不适宜的。其次，细菌培养物的OD600必须调整到最佳值，通常为农业细菌的0.75±1.0。较低的 OD600（即使低至 0.2）可用于筛选 VSR，但不能用于筛选 PSR24。第三，必须针对每个效应器优化研究绿色荧光的理想时间点。在病毒中，与含有GFP加假定VSR的培养物共注射的叶子在3 dpi的渗透区域表现出绿色荧光的明显增加，信号一直持续到9 dpi22，但在我们目前的研究中，PSR只在4或5 dpi上表现出。因此，通过量化GFP mRNA的积累，进一步确认RNA沉默活性也很重要。最后，使用适当的控件至关重要。VSR 并不总是识别效应蛋白的理想阳性控制，因为这些蛋白质的抑制活性比 PSR 强得多。这可能导致检测出RNA沉默的弱抑制器。
在本报告中，我们演示了使用我们的改进测定来筛选抑制植物磷酸和普契尼亚克宁病病原体中的RNA沉默。因此，我们的方法代表了一个有用的工具，用于描述编码RSS的潜在效应器，通过抑制小RNA积累15、16、17来促进疾病易感性。因此，我们相信我们的协议可以广泛用于筛选植物病原体分泌的效应器。今后的工作将侧重于识别其他病原体中的更多RSS，并阐明RNA沉默在植物防御入侵微生物中的作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了上海市教育发展基金会"曙光计划"和上海市教委、国家重点研发项目国家重点研发项目的资助。2018YFD0201500），国家自然科学基金（第31571696号，31660510号），中国青年专业人才千人计划，上海市科委（18DZ2260500）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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