植物病原菌分泌效应子中RNA沉默抑制子的筛选与鉴定

摘要

本文介绍了一种改进的筛选方法，可广泛用于快速筛选植物病原体中的RNA沉默抑制因子。

摘要

RNA沉默是真核生物中一种在进化上保守的、具有序列特异性的基因调控机制。一些植物病原体已进化出能够抑制寄主植物RNA沉默通路的蛋白质。与病毒效应蛋白不同，目前仅有少数细菌、卵菌和真菌病原体分泌的效应蛋白被证实具有抑制RNA沉默的能力，且大多数效应蛋白的分子功能仍不清楚。本文详细描述了一种经过轻微改进的共浸润实验方法，该方法可作为观察RNA沉默现象以及鉴定植物病原体分泌效应蛋白的通用手段。该方法的关键步骤包括：选择健康且充分展开的叶片，将细菌培养物调整至600 nm处的适当光密度（OD），并在浸润后的叶片上于最佳时间点观察绿色荧光蛋白（GFP）荧光，以避免遗漏具有较弱抑制活性的效应蛋白。这一优化后的实验方案将有助于快速、准确且广泛地筛选RNA沉默抑制因子，并为深入研究这些蛋白的分子功能提供一个优良的起点。

引言

在过去的二十年中，对引起植物病害的微生物进行基因组测序的速度不断加快，导致基因序列信息与编码蛋白的生物学功能之间的知识差距日益扩大¹。测序项目揭示出的一类分子是效应分子，这类分子可抑制植物的先天免疫并促进病原菌在宿主中的定殖；这些因子由具有破坏性的植物病原体（包括细菌、线虫和丝状微生物）分泌。为应对这些威胁，宿主植物进化出了能够识别这些效应分子的新型受体，从而恢复免疫反应。因此，效应分子受到多种选择压力，导致不同病原体谱系间的效应分子库发生多样化²。近年来研究表明，来自植物病原体的候选效应分子可通过干扰宿主细胞的多种生理过程，以多种方式促进微生物的侵染，包括破坏信号通路、转录调控、细胞内运输、细胞骨架稳定性、囊泡运输以及RNA沉默等过程^3,4,5。然而，大多数病原体效应分子，尤其是来自丝状病原体的效应分子，其功能仍不明确。

RNA沉默是一种在真核生物中保守的、基于序列同源性的基因失活机制。该过程由长双链RNA（dsRNA）触发，以序列特异性方式靶向同源的单链RNA（ssRNA），并调控多种生物学过程，包括抗病毒防御⁶。为了克服宿主的天然免疫反应，一些....

方案

注意：该实验步骤的所有操作均应在室温（RT）下进行。

警告：将含有致病微生物的所有培养基，以及实验中使用过的植物和植物组织，均需放入适当的废弃物容器中，并在丢弃前进行高压灭菌处理。

1. 含假定效应因子的质粒构建物的制备

1. 根据RNA测序（RNA-Seq）结果，并结合定量实时PCR（qRT-PCR）技术，筛选在感染过程中高表达的候选分泌效应子。
2. 使用SignalP¹⁸等软件工具确定每个效应子的信号肽切割位点。
3. 设计引物，利用高保真DNA聚合酶通过PCR扩增目标效应子基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，随后使用无缝克隆试剂盒（材料表）将扩增产物克隆至Gateway入门载体pQBV3中，再通过LR重组反应¹⁹转入目的表达载体pEG100。
4. 将3−5 µL的LR反应混合物转化至100 µL的感受态E. coli细胞（如TOP10、DH5α）中，将转化后的细菌涂布于添加50 µg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上，于37 °C培养16−20 h。
   注：阳性转化子可通过菌落PCR²⁰鉴定，并进一步通过质粒小提和测....

结果

上述内容中，我们描述了一种用于评估RSS活性的改进筛选实验的逐步操作流程 P. sojae RxLR 效应子。整个实验耗时5−6周。随后，可通过该检测鉴定出的RSSs可在功能和分子机制方面进行进一步表征。作为我们方法的一个示例，我们使用了 P. sojae Phytophthora 中的 RxLR 效应子 RNA 沉默抑制因子 1（PSR1），在侵染过程中通过吸器分泌并递送至寄主细胞内。

为验证PSR1具有RSS活性，因而适用于本方法，将每种转化的农杆菌菌株与携带35S-GFP的菌株混合，并共同浸润到本氏烟16c（N. benthamiana 16c）叶片中。EV和CMV2b分别作为阴性与阳性对照（图1）。在浸润后2−3天，所有混合组的叶片中GFP表达均达到最高水平。在6−9天的观察期内，35S-GFP与CMV2b共浸润区域的绿色荧光强度保.......

讨论

RNA沉默是植物抵御病毒、细菌、卵菌和真菌病原体的关键防御机制。相应地，这些微生物进化出了沉默抑制蛋白以对抗抗病毒沉默，这些RSSs会干扰RNA沉默通路中的不同步骤^22,23。已有多种筛选实验被开发用于鉴定RSSs¹⁰。

在此，我们介绍一种改进的效应蛋白分泌筛选方案，该蛋白由 P. sojae 感染时进入宿主细胞，以检测其抑制宿主RNA沉默的能力。该改良检测方法基于病毒共浸润实验，但在多个关键方面有所不同。首先，细菌和 N. benthamiana 16株植物应生长健壮且健康；这对于细菌效应子的稳定表达以及利用完全发育的植株至关重要 N. benthamiana 16c 可确保实验的可重复性和可靠性。我们通常仅在营养生长期选取每株植物的两到三片完全展开的叶片，而过老或新长出的叶片均不适用。其次，OD₆₀₀ 细菌培养物的浓度必须调整至最佳值，通常.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-吗啉乙磺酸 (MES)	Biofroxx	1086GR500	缓冲液
2xTaq 预混液	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS 缓冲液
乙酰丁香酮 (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	农杆菌诱导剂
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB 培养基
琼脂糖	Biofroxx	1110GR100	电泳
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Northern 印迹
Amersham 成像仪	GE Healthcare	Amersham Imager 600	成像
胰蛋白胨	BD Biosciences	211705	LB 培养基
酵母提取物	BD Biosciences	212750	LB 培养基
相机	Nikon	D5100	摄影
ChemiDoc MP 成像系统	Bio-Rad
dafa 试剂盒化学发光检测模块组分	Thermo Fisher Scientific	89880	化学发光检测
氯霉素	Amresco	0230-100G	抗生素
ClonExpress II 一步克隆试剂盒	Vazyme Biotech	C112-01	连接
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	杂交缓冲液
Easypure 质粒小提试剂盒	TransGen Biotech	EM101-02	质粒提取
EasyPure 快速凝胶回收试剂盒	TransGen Biotech	EG101-02	凝胶回收
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS 缓冲液
电泳电源	六一	DYY6D	核酸电泳
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	载体酶切
凝胶成像系统	Tanon	Tanon3500	成像
庆大霉素	Amresco	0304-5G	抗生素
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	K1914	抗生素
LR Clonase II 酶	Invitrogen	11791020	LR 反应
硝酸纤维素印迹膜 0.45 μm	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south 生物素随机引物 DNA 标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	17075	生物素标记
PCR 扩增仪	Bio-Rad	T100	PCR
泥炭藓	PINDSTRUP	Dark Gold + 黏土	植物
Peters 水溶性肥料	ICE	Peter Professional 20-20-20	肥料
Phanta Max 超高保真 DNA 聚合酶	Vazyme Biotech	P505-d1	酶
利福平	MP Biomedicals	219549005	抗生素
RNA 凝胶上样缓冲液 (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA 凝胶上样缓冲液
乙酸钠水合物	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS 缓冲液
氯化钠	Amresco	0241-10KG	LB 培养基
柠檬酸三钠	Amresco	0101-1KG	SSC 缓冲液
Trizol 试剂	Invitrogen	15596018	RNA 提取试剂
紫外灯	Analytik Jena	UVP B-100AP	观察
UVP 杂交炉	Analytik Jena	OV2000	Northern