Her presenterer vi en modifisert screeningmetode som kan brukes mye til raskt å screene RNA-deaktiveringssuppressorer i plantepatogener.
RNA-deaktivering er en evolusjonært bevart, sekvensspesifikk genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har utviklet proteiner med evnen til å hemme vertsanlegget RNA-deaktiveringsveien. I motsetning til viruseffektorproteiner har bare flere utskillede effektorproteiner vist evnen til å undertrykke RNA-deaktivering i bakteriell, oomycete og sopppatogener, og de molekylære funksjonene til de fleste effektorer forblir i stor grad ukjente. Her beskriver vi i detalj en litt modifisert versjon av koinfiltrasjonsanalysen som kan tjene som en generell metode for å observere RNA-deaktivering og for karakterisering av effektorproteiner utskilt av plantepatogener. De viktigste trinnene i tilnærmingen er å velge de sunne og fullt utviklede bladene, justere bakteriekulturen til riktig optisk tetthet (OD) ved 600 nm, og observere grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens på optimal tid på infiltrert forlater for å unngå å utelate effektorer med svak undertrykkelse aktivitet. Denne forbedrede protokollen vil bidra til rask, nøyaktig og omfattende screening av RNA-deaktiveringssuppressorer og tjene som et utmerket utgangspunkt for å undersøke de molekylære funksjonene til disse proteinene.
I løpet av de siste to tiårene har akselerasjon i genomsekvensering av mikroorganismer som forårsaker plantesykdommer ført til et stadig økende kunnskapsgap mellom sekvensinformasjon og de biologiske funksjonene til kodede proteiner1. Blant molekylene som avsløres av sekvenseringsprosjekter er effektormolekyler som undertrykker medfødt immunitet og letter vertskolonisering; Disse faktorene utskilles av destruktive plantepatogener, inkludert bakterier, nematoder og filamentous mikrober. For å svare på disse truslene har vertsplanter utviklet nye reseptorer som gjenkjenner disse effektene, noe som muliggjør restaurering av immunresponsen. Derfor er effektorer gjenstand for ulike selektive trykk, noe som fører til diversifisering av effekteller repertoarer blant patogene linjer2. I de senere årene har antatte effektorer fra plantepatogener vist seg å forstyrre plantemedfødt immunitet ved å hindre vertscellulære prosesser til fordel for mikrobene på en rekke måter, inkludert dysregulering av signalveier, transkripsjon, intracellulær transport, cytoskjelettstabilitet, vesicle trafficking og RNA silencing3,4,5. Men de aller fleste patogene effektorer, spesielt de fra filamentous patogener, har vært gåtefulle.
RNA-deaktivering er et homologimediert geninaktiveringsmaskiner som bevares blant eukaryoter. Prosessen utløses av lang dobbelt-strandet RNA (dsRNA) og retter seg mot homologen en-strandet RNA (ssRNA) på en sekvens-spesifikk måte, og det manipulerer et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert antiviral forsvar6. For å overgå medfødte immunresponser fra verten, har noen virus utviklet seg til å oppveie RNA-deaktivering, inkludert evnen til å replikere inne i intracellulære rom eller flykte fra det omorganiserte signalet. Likevel er den mest generelle strategien der virus beskytter sine genomer mot RNA-deaktiveringsavhengig tap av genfunksjon å kode spesifikke proteiner som undertrykker RNA-deaktivering7,8. Flere mekanistisk forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å screene og karakterisere viralsuppressorer av RNA-deaktivering (VSRs), inkludert samtidig infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter som uttrykker putative suppressors, pode og cellekultur9,10,11,12,13.
Hver av disse analyser har fordeler og ulemper, og identifiserer VSRs på sin egen distinkte måte. En av de vanligste tilnærmingene er basert på samtidig infiltrasjon av individuelle A. tmuefaciens kulturer som skjuler det potensielle virale proteinet og et reportergen (typisk grønt fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c-planter som utgjør gfp under kontroll av blomkålmosaikkviruset 35S-arrangøren. I fravær av en aktiv viral deaktivering suppressor, er GFP identifisert som eksogene av vertscellene og er dempet innen 3 dager etter infiltrasjon (dpi). Derimot, hvis virusproteinet har undertrykkelsesaktivitet, forblir uttrykksnivået til GFP stabilt utover 3−9 dpi9. Denne koinfiltrasjonsanalysen er enkel og rask; Det er imidlertid verken svært stabilt eller følsomt. Likevel har analysen identifisert mange VSRs med ulike proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-virus7,8.
Nylig har flere effektorproteiner som kan hemme den cellulære RNA-deaktiveringsaktiviteten blitt karakterisert fra bakteriell, oomycete og soppplantepatogener14,15,16. Disse funnene innebærer at RNA-deaktivering av undertrykkelse er en vanlig strategi for å legge til rette for infeksjon som brukes av patogener i de fleste riker. I teorien kan mange, om ikke alle, av effektorene kode RNA-deaktiveringssuppressorer (RSSs); Hittil har imidlertid bare noen få blitt identifisert, hovedsakelig på grunn av mangel på den pålitelige og generelle screeningstrategien. Videre har suppressors av RNA deaktivering ikke blitt undersøkt i de aller fleste plante patogener17.
I denne rapporten presenterer vi en optimalisert og generell protokoll for å identifisere plantepatogeneeffektorer som kan undertrykke lokale og systemiske RNA-deaktivering ved hjelp av agro-infiltrasjonsanalysen. Målet med denne studien var å understreke de viktigste aspektene ved protokollen og beskrive trinnene i detalj, og dermed gi en screeninganalyse som passer for nesten alle effektorer av plantepatogener.
RNA-deaktivering er en viktig forsvarsmekanisme som brukes av planter for å bekjempe virale, bakterielle, oomycete og sopppatogener. I sin tur har disse mikrobene utviklet deaktivering suppressor proteiner for å motvirke antiviral deaktivering, og disse RSSs forstyrre ulike trinn av RNA deaktivering sti22,23. Flere screening analyser er utviklet for å identifisere RSSs10.
Her beskriver vi en forbedret protoko…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra “Shuguang Program” av Shanghai Education Development Foundation og Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 og 31660510), Thousand Talents Program for Young Professionals of China, og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
Camera | Nikon | D5100 | Photography |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |