כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח
במאמר זה
סיכום
תקציר
רנ א השתקה הוא שימור אבולוציונית, רצף ספציפי מנגנון רגולציה הגנים ב eukaryotes. פתוגנים צמחים מספר התפתחו חלבונים עם היכולת לעכב את המפעל מארח RNA השתקה המסלול. שלא כמו חלבונים אפקטור וירוס, רק מספר חלבונים אפקטור מופרש הראו את היכולת לדכא RNA השתקה בקטריאלי, o, ופטריות ופתוגנים, ואת הפונקציות המולקולריות של רוב העריקים להישאר ידועים ברובו. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט גרסה שונה מעט של השינוי החדירה שיתוף שיכול לשמש כשיטה כללית להתבוננות RNA השתקה ולאפיון חלבונים אפקטור מופרש על ידי פתוגנים צמחים. השלבים העיקריים של הגישה הם בחירת העלים בריאים ומפותחים באופן מלא, התאמת התרבות חיידקים לדחיסות אופטית המתאימה (OD) ב 600 ננומטר, והתבוננות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) זריחה בזמן האופטימלי על החדר המתאים העלים על מנת למנוע השמטת עריקים בפעילות דיכוי חלשה. פרוטוקול משופר זה יתרום מהירה, מדויקת, הקרנה נרחבת של RNA השתקה דכאי ולשמש נקודת התחלה מצוינת לחקירת פונקציות מולקולריות של חלבונים אלה.
מבוא
במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד1. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים2. בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: יש לנהל את כל השלבים של ההליך בטמפרטורת החדר (RT).
התראה: הפקדת כל המדיה המכילה חיידקים פתוגניים, כמו גם את הצמחים ורקמת הצמח המשמשים בתוך המנה, אל מיכלי הפסולת המתאימים והחיטוי לפני השלכת.
1. הכנת מבני פלמנא המכילים מפעריקים
- בחר מפרשים מופרשים שמבטאים במידה רבה במהלך ההדבקה, כפי שנקבע על-ידי רצפי RNA (RNA-Seq), ועוד בטכניקת ה-PCR (רביעיית-PCR) בזמן אמת כמותי.
- לקבוע את אתר המחשוף פפטיד האות של כל אפקטור באמצעות כלי תוכנה כגון סיאלפ18.
- עיצוב התחל ולבצע PCR כדי להגביר את הקידוד של הסקרנות הריבית באמצעות דנ א בנאמנות גבוהה פולימראז. בצע ביצוע אלקטרופורזה ג'....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לעיל, אנו מתארים את ההליך צעד אחר צעד עבור שיטת הקרנה משופרת להערכת פעילות ה-RSS של P. sojae rxlr מעריקים. בסך הכל, הניסוי נמשך 5-6 שבועות. לאחר מכן, הRSSs המזוהה על-ידי הבחינה יכולה להיות מאופיינת עוד יותר במונחים של פונקציה ומנגנון מולקולרי. כדוגמה לגישה שלנו, השתמשנו P. sojae rxlr השפעות משתיק PHYTOPHTHORA של RNA השתקה 1 (PSR1), אשר מופרש ונמסר לתוך תאים מארחים דרך האוגוריה במהלך הזיהום.
כדי לאשר כי PSR1 יש .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
רנ א השתקה הוא מנגנון הגנה מפתח המועסקים על ידי צמחים להילחם ויראלי, חיידקי, o, ופתוגנים פטרייתי. בתורו, החיידקים האלה התפתחו חלבונים מדכא השתקה כדי לנטרל נגיפים השתקה, ואת אלה RSSs להפריע לשלבים שונים של השביל השתקה RNA22,23. כמה הקרנת ההקרנה פותחו כדי לזהות RSSs10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר לסינון חלבונים אפקטור מופרש על ידי P. sojae לתוך התא המארח על היכולת שלהם לדכא RNA השתקה במארח. שיטת השינוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים של "שואנג תוכנית" של קרן לפיתוח החינוך שנגחאי הנציבות העירונית של שנגחאי ועדת החינוך העירוני, מחקר המפתח הלאומי תוכנית פיתוח של סין המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין ( 2018YFD0201500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 31571696 ו 31660510), התוכנית אלף כשרונות עבור אנשי מקצוע צעירים של סין, ואת הנציבות המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (18DZ2260500).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | אינדוקציה של אגרובקטריום |
| אגר | סיגמא-אולדריץ' | A1296-1KG | LB בינוני |
| אגרוז | ביופרוקס | 1110GR100 | אלקטרופורזה |
| אמרשם הייבונד -N + | GE Healthcare | RPN303 B | כתם צפוני |
| אמרשם אימג'ר | GE Healthcare | אמרשם אימג'ר 600 | תמונה |
| בקטו טריפטון | BD ביוסיינסס | 211705 | LB בינוני |
| מיצוי | שמרים בקטוBD Biosciences | 212750 | LB |
| מצלמה בינונית | Nikon | D5100 | צילום |
| ChemiDoc MP מערכת הדמיה | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent מודול זיהוי רכיב של ערכות דאפא | Thermo Fisher Scientific | 89880 | זיהוי זוהר |
| כלורמפניקול | אמרסקו | 0230-100G | אנטיביוטיקה |
| ClonExpress II ערכת שיבוט שלב אחד | Vazyme Biotech | C112-01 | קשירה |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | מאגר הכלאה |
| Easypure פלסמיד Miniprep TransGen | Biotech | EM101-02 | מיצוי פלסמיד |
| ערכת מיצוי ג'ל מהירה EasyPure TransGen | Biotech | EG101-02 | מיצוי ג'ל |
| EDTA דיסודיום מלח דיהידראט | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS מאגר |
| אלקטרופורזה ספק כוח | LiuYi | DYY6D | אלקטרופורזה של חומצות גרעין. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | מערכת תמונה ג'ל לעיכול וקטורי |
| Tanon | Tanon3500 | תמונה | |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | אנטיביוטיקה |
| קנמיצין סולפט | סיגמא-אולדריץ' | K1914 | אנטיביוטיקה |
| LR קלונאז II אנזים | Invitrogen | 11791020 | תגובת |
| LRקרום ספיגת ניטרוצלולוז 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south ביוטין ערכת תיוג DNA ראשונית אקראית | Thermo Fisher Scientific | 17075 | תיוג ביוטין |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| טחב כבול | PINDSTRUP | זהב כהה + צמחי חימר | |
| פיטרס דשן מסיס במים | ICE | פיטר מקצועי 20-20-20 | דשן |
| Phanta Max סופר-נאמנות DNA פולימראז | Vazyme Biotech | P505-d1 | אנזים |
| Rifampicin | MP ביו-רפואי | 219549005 | אנטיביוטיקה |
| RNA ג'ל טעינת צבע (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA ג'ל טעינת צבע |
| נתרן אצטט הידרט | Amresco / VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| נתרן כלוריד | אמרסקו | 0241-10KG | LB בינוני |
| תלת-נתרן ציטראט | אמרסקו | 0101-1KG | SSC מאגר |
| טריזול מגיב | Invitrogen | 15596018 | ריאגנט בידוד RNA |
| מנורת UV | Analytik Jena | UVP B-100AP | תצפית |
| UVP Hybrilinker תנור | Analytik Jena | OV2000 | צפון |
מקורות
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
