Summary
כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.
Abstract
רנ א השתקה הוא שימור אבולוציונית, רצף ספציפי מנגנון רגולציה הגנים ב eukaryotes. פתוגנים צמחים מספר התפתחו חלבונים עם היכולת לעכב את המפעל מארח RNA השתקה המסלול. שלא כמו חלבונים אפקטור וירוס, רק מספר חלבונים אפקטור מופרש הראו את היכולת לדכא RNA השתקה בקטריאלי, o, ופטריות ופתוגנים, ואת הפונקציות המולקולריות של רוב העריקים להישאר ידועים ברובו. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט גרסה שונה מעט של השינוי החדירה שיתוף שיכול לשמש כשיטה כללית להתבוננות RNA השתקה ולאפיון חלבונים אפקטור מופרש על ידי פתוגנים צמחים. השלבים העיקריים של הגישה הם בחירת העלים בריאים ומפותחים באופן מלא, התאמת התרבות חיידקים לדחיסות אופטית המתאימה (OD) ב 600 ננומטר, והתבוננות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) זריחה בזמן האופטימלי על החדר המתאים העלים על מנת למנוע השמטת עריקים בפעילות דיכוי חלשה. פרוטוקול משופר זה יתרום מהירה, מדויקת, הקרנה נרחבת של RNA השתקה דכאי ולשמש נקודת התחלה מצוינת לחקירת פונקציות מולקולריות של חלבונים אלה.
Introduction
במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד1. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים2. בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש הצמח חסינות מולדים על ידי הפרעה תהליכים סלולריים מארח לטובת חיידקים במגוון דרכים, כולל דיסרגולציה של איתות מסלולים, תמלול, הובלה תאיים, יציבות השלד, שלפוחית הסחר, ו RNA השתקה3,4,5. עם זאת, הרוב המכריע של העריקים הפתוגן, במיוחד אלה של פתוגנים filamentous, נותרו מחוחימים.
רנ א השתקה היא הומולוגיה-בתיווך גן מכונות ההפעלה כי הוא שימור בין eukaryotes. התהליך מופעל על ידי ארוך כפול תקועים RNA (dsRNA) ומטרות RNA הומוולוגי יחיד תקוע (ssRNA) באופן ספציפי רצף, והיא מפעילה מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל הגנה אנטי ויראליות6. כדי להתגבר על התגובות החיסונית הטבועה של המארח, וירוסים מסוימים התפתחו לקזז RNA השתקה, כולל היכולת לשכפל בתוך התאים תאיים או לברוח מהאות מאורגן מראש. אף על פי כן, האסטרטגיה הכללית ביותר שבה וירוסים להגן על גנום שלהם נגד rna השתקה תלוי אובדן של הפונקציה gene היא לקודד חלבונים ספציפיים לדכא rna השתקה7,8. מספר גישות שונות של מכניזיות הוקמו על המסך ואיפיון דכאי ויראלי של RNA השתקה (vsrs), כולל הסתננות של agrobacterium התרבויות tumefaciens , צמחים טרנסגניים להביע דכאי, השתלה ותרבות התא9,10,11,12,13.
לכל אחד מאותם מספר יש יתרונות וחסרונות, ומזהה VSRs באופן ייחודי משלו. אחת הגישות הנפוצות ביותר מבוססת על חדירה משותפת של הפרט A. tמואfaciens תרבויות מחסה את החלבון הנגיפי הפוטנציאלי גן עיתונאי (בדרך כלל חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) על טבק benthamiana 16c צמחים ביטוי המבטא gfp תחת השליטה של וירוס פסיפס כרובית של מקדם 35. בהעדר משתיק קול ויראלי פעיל, GFP מזוהה כאקסוגני על ידי התאים המארחים והוא מושתק בתוך 3 ימים לאחר הסתננות (dpi). לעומת זאת, אם החלבון הנגיפי מחזיק בפעילות הדיכוי, רמת הביטוי של GFP נותרת יציבה מעבר ל -3 עד 9 dpi9. שיתוף החדירה המשותף הזה הוא פשוט ומהיר; עם זאת, הוא לא יציב מאוד ולא רגיש. עם זאת, את השיטת זיהה vsrs רבים עם רצפי חלבון מגוונים ומבנים רבים RNA וירוסים7,8.
לאחרונה, כמה חלבונים אפקטור שיכולים לעכב את הפעילות התאית השתקה הסלולר כבר מאופיין חיידקי, o, ופטריות צמח פתוגנים14,15,16. ממצאים אלה משתמע כי רנ א השתקה הדיכוי היא אסטרטגיה נפוצה להקלה על זיהום המשמש פתוגנים ברוב הממלכות. בתאוריה, רבים, אם לא כולם, של העריקים עשויים לקודד RNA השתקה דכאי (RSSs); עד כה, לעומת זאת, רק מעטים זוהו, בעיקר בשל המחסור באסטרטגיית ההקרנה האמינה והכללית. יתר על כן, דכאי של RNA השתקה לא נחקרו ברוב המכריע של פתוגנים צמחים17.
בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב וכללי לזיהוי הפתוגן הגורם למחלה שיכול לדכא RNA מקומי ומערכתי השתקה באמצעות שיטת החדירה אגרו. המטרה הראשונה של מחקר זה הייתה להדגיש את ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול ולתאר את השלבים בפרוטרוט, ובכך לספק מבחן הקרנה המתאים לכמעט כל העריקים של פתוגנים צמחיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: יש לנהל את כל השלבים של ההליך בטמפרטורת החדר (RT).
התראה: הפקדת כל המדיה המכילה חיידקים פתוגניים, כמו גם את הצמחים ורקמת הצמח המשמשים בתוך המנה, אל מיכלי הפסולת המתאימים והחיטוי לפני השלכת.
1. הכנת מבני פלמנא המכילים מפעריקים
- בחר מפרשים מופרשים שמבטאים במידה רבה במהלך ההדבקה, כפי שנקבע על-ידי רצפי RNA (RNA-Seq), ועוד בטכניקת ה-PCR (רביעיית-PCR) בזמן אמת כמותי.
- לקבוע את אתר המחשוף פפטיד האות של כל אפקטור באמצעות כלי תוכנה כגון סיאלפ18.
- עיצוב התחל ולבצע PCR כדי להגביר את הקידוד של הסקרנות הריבית באמצעות דנ א בנאמנות גבוהה פולימראז. בצע ביצוע אלקטרופורזה ג'ל כדי לבדוק את מוצר ה-PCR, לאחר מכן לשכפל את אמפליקון לתוך הכניסה וקטור השער pQBV3 באמצעות ערכת השכפול ללא הארכה (טבלה של חומרים), ולאחר מכן לתוך ביטוי היעד וקטור pEG100 באמצעות התגובה של LR שילוב חוזר19.
- המרה 3-5 μL של תערובת התגובה LR לתוך 100 μL של תאים המוסמכת של E. coli (למשל, TOP10, DH5α), להפיץ את התאים החיידקיים שהפכו על לוריא-ברטני (LB) אגר בינוני עם 50 Μg/mL kanamycin, ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 16 על 20 h.
הערה: ניתן לזהות transformants חיובית על-ידי המושבה ה-PCR20 ולאחר מכן נותחו על-ידי מיני-ביניים ורצף. - הציגו 50 למעלה מ-100 מרקומביננטי פלמידים שנושאים חלבון לתוך 100 μL של תאים כימיים המוסמכים בתאי tumefaciens (למשל , GV3101 או C58C1), לערבב בעדינות, ולאחר מכן להקפיא בחנקן נוזלי עבור 1 דקות. הפשרת התאים באמבט מים בגודל 37 ° c עבור 5 דקות.
- הוסף 500 μL של ציר ליברות ו-דגירה ב 30 ° צ' עבור 4 לל6 h עם טלטול עדין, ולאחר מכן להעביר ולהפיץ את כל התאים agrobacteria על LB אגר בינוני עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין ב 30 ° צ' עבור 2 ימים.
הערה: ניתן לאמת שכפולים חיוביים על-ידי המושבה PCR. - השתמש מושבה אחת השתנה לניסויים אגרו-הסתננות אלא אם כן ביים אחרת.
הערה: במחקר הנוכחי, אף אחד מהגנים שנבדקו לא הכיל introns חזוי; כל אחד הגנים הוגדל ישירות מ-DNA גנומית של Phytophthora sojae בודד. וקטור ביטוי של צמח שער ללא תג מומלץ, אך לא נחוץ.
2. הכנת המפעלים של N. benthamiana 16c
- הכנת תערובות קרקע השתילה המורכב (על ידי נפח) 50% כבול איזוב, 30% perlite, ו 20% ורמיקוליט, ו החיטוי ב 120 ° c עבור 20 דקות.
- לטבול תערובות קרקע אוטומטית עם פתרון דשן הצמח (1 g/L) ו-sub-חבילה אותם לסירים קטנים יותר (80 מ"מ x 80 mm x 75 מ"מ) מאוחסן מגש גדול יותר (540 mm x 285 mm x 60 מ"מ).
- זרוע זרעי אחד או שניים של N. benthamiana 16c על פני הקרקע של כל סיר. לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק ולאפשר זרעים כדי לנבוט.
- מניחים את המגש מתחת לתאי הצמיחה בשליטה קלה ובטמפרטורה בטמפרטורה של 23 עד 25 ° c, 50 לחות יחסית של 60%, ו-photoperiod ליום ארוך (14 שעות אור/10 שחור כהה, עם תאורה ב 130-150 μE · m-2s-1).
- הניחו את הכיפה הפלסטית לאחר הזרעים לנבוט (3-4 ימים) ולאפשר לשתילים לצמוח תחת אותם התנאים ששימשו לשלב הנביטה.
- להוסיף כמות מתאימה של מים, שמירה על הקרקע לחות אך לא לטבילה, כל 2-3 ימים; להוסיף דשן כל 10 ימים כדי לקדם צמיחה נוספת. שמור על N. benthamiana 16c צמחים בתנאים נורמליים עד שהם מוכנים לשימוש; בשלב זה המפעל צריך להיות לפחות חמישה עלים אמיתיים מפותחים לחלוטין לא נראה בבית השחי או ניצנים הפרח, ואת העלים צריך מראה ירוק בריא).
- השימוש 3 לשבוע 4 עלים של N. benthamiana 16c עבור רנ א המקומי השתקה מספר, וצעירים N. benthamiana 16c צמחים (10 למשך 14 ימים) עבור RNA מערכתית השתקה האומר.
הערה: תנאי הצמיחה והמתקנים של הצמח משתנים באמצעות מעבדות; לבחור בריא, מפותח ומורחב לחלוטין עלים לחדירה.
3. הכנת תרבות אגרובאכטריום לחדירה
- בחר מושבה חיובית מן הצלחת ליברות ולאחר התאים לתוך שפופרת זכוכית המכילה 5 מ ל של LB בינונית בתוספת עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין. הגדל את התאים במהירות 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 24 עד 48 שעות.
- העברת 100 μL של התרבות לתוך 5 מ ל של ליברות בינונית בתוספת אנטיביוטיקה זהה, 10 מ"מ 2-(N-גווראולנו) חומצה ethanesulfonic (MES; pH 5.6) ו 20 μM acetosyringone (AS). גידול חיידקים ב 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 16 לל20 h.
- בתאי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות. יוצקים את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 2 מ מ של 10 מ"מ MgCl2 מאגר.
- חזור על שלב 3.3 כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה.
- לקבוע את הצפיפות של התרבות Agrobacterium על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600). התאם ל-OD600 של 1.5-2.0 עם מאגר 10 מ"מ MgCl2 .
- הוסף 10 מ"מ MES (pH 5.6) ו 150 μM באשר לתרבויות ההשעיה הסופית והוא דגירה את התאים ב-RT עבור לפחות 3 שעות מבלי לרעוד.
הערה: אל תשאירו את התרבות ההשעיה הסופית בלילה.
4. שיתוף הסתננות N. benthamiana עוזב
- מערבבים כמויות שוות של תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-gfp עם תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-מלפפון פסיפס וירוס משתיק קול 2b (CMV2b), וקטור, או ריק (EV).
- בזהירות ובאיטיות לחדור את השרגיום מעורב השעיות על הצדדים הדו של N. benthamiana 16c העלים באמצעות מזרק אחד שזקוק ל-mL.
- הסר את הבולם החיידקי הנותרים מן העלים עם מנקי רקמות רך להקיף את השוליים של טלאים חדרו עם עט maker.
- השאירו את הצמחים החדרו בחדר הצמיחה באותו תנאי גדילה.
הערה: למטרות בטיחות ובריאות, משקפי העין המגן ומסכה יש לענוד במהלך הסתננות. כדי למנוע זיהום, כפפות יש לשנות או לעקר עם אתנול בין חדירות. בדרך כלל לפחות 1 מ ל של agrobacterium שתלים לעלה נדרש הסתננות. עבור השתקה מערכתית, לפחות שני עלים יידרשו לחדירה.
5. ניתוח הדמיה של GFP
- באופן חזותי לזהות הזריחה GFP בעלים החדשים של צמחים שלמים 2 שבועות לאחר הסתננות (עבור RNA מערכתית השתקה) או כתמי החדרו של עלים 3 על 4 dpi באמצעות אולטרה סגול גל (UV) מנורה ללא העלים אוסף.
- צילום הצמחים שנאספו ו/או מנותקת עלים עם מצלמה דיגיטלית מצויד הן UV ומסננים צהובים.
הערה: לצורך השתקה של דיכוי ההשתקה המקומי, יש לחקור כתמים שחדרו לתוך העלים של N. benthamiana 16c, ואילו עבור פעילות לדיכוי מערכתית, לחקור עלים חדשים שגדלו. הפעילות הדחקה של רנ א עשויה להשתנות בהתאם לעריקים בודדים. לכן, התבונן במדבקות או בעלים במשך מספר ימים החל מ-3 dpi. השתמש ב-CMV2b ו-EV כפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.
6. בדיקת כתמי הצפון של רמות הטיפול
- בידוד של RNA כולל מרקמת עלה באמצעות מגיב בידוד RNA (טבלת חומרים)
- לאסוף רקמות עלים מתוך N. benthamiana 16c טלאים על 4 לפחות 7 dpi, לרסק בחנקן נוזלי לאבקה משובחת, ולהעביר את האבקה לצינור סטרילי 2 מ ל.
- הוסף את מגיב בידוד RNA (1 mL/100 מ ג רקמת) מיד לצינור שנדגמו במכסה המנוע, לנער במרץ כדי הומואכל, ו דגירה ב RT עבור 5 דקות.
- הוספת כלורופורם (200 μL/1 מ"ל בידוד RNA) לכל צינור במכסה המנוע, לנער במרץ עבור 15 s, ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. צנטריפוגה את המגון ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
- להעביר את supernatant לתוך צינור חדש RNase-חינם ולמחוק את הגלולה. הוסף 0.7 נפח של איזופנול ל-supernatant, להפוך בעדינות מספר פעמים, ו דגירה את התערובת ב-RT עבור 10 דקות.
- מזרז את הגלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
- להיפטר supernatant, לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול, ולייבש את הגלולה במכסה המנוע. לפזר את ה-RNA ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים שטופלו על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 10-20 דקות.
- בדיקת כתמי הצפון של רמת הקרקע של GFP בעלי החדרו
- להכין 1.2% פורמלדהיד הפעלת ג'ל ב-1x מגבים פועל מאגר.
- מערבבים RNA 1:1 עם צבע העמסה של RNA והד, באמצעות הדגירה של 65 ° צ' במשך 10 דקות, מיד לצנן את דגימות denat, על הקרח 1 דקות.
- טען את הדגימות על ג'ל ואלקטרופורמית ב 100 V עבור 50 דקות עד RNA הוא מופרד היטב.
- לשטוף את הג ב-20x מלוחים-נתרן ציטראט מאגר להסיר פורמלדהיד ולהעביר את ג'ל קרום ניילון על ידי העברת קפילר ב 20x מאגר המטה לילה. להשרות את הקרום ב-2x מהאס. בי. או לתקן את ה-RNA לקרום ידי חשיפת קרום רטוב כדי הקישור לחצות UV.
- הוסף את הכמות המתאימה של מאגר הכלאה (10 מ"ל לכל 100 ס מ2 קרום; רשימת חומרים) בצינור הכלאה ומתפרעים ב-60 ° c בתנור הכלאה.
- הכניסו את הקרום לתוך צינור היברידיזציה ו הדגירה עבור 60 דקות ב 60 ° c. לדלל בדיקה 5 ' לחפור בתווית DNA (הריכוז הסופי, 50 ng/mL) לתוך פתרון הכלאה המכיל מאגר הכלאה מראש.
- מחק את המאגר הטרום-הכלאה והחלף מיד עם פתרון הכלאה מראש המכיל את הגשוש בעל תווית החפירה. מיכל האבן החשופה עם לווין ב-60 ° c בלילה, עם עצבנות עדינה.
- לאחר הכלאה, רוחצים את הקרום פעמיים במאגרים של הגברת החריפות ב-60 ° c עבור 20 דקות כל אחד. בעדינות לנגב את הקרום כדי להסיר מאגר כביסה נוספת ולהוסיף ריאגנטים כפי שהוצע הכלאה היבריריזציה ואת ערכת האיתור (טבלת חומרים).
- לזהות אותות הוכלא על ידי תגובת כימושימינטאת בשילוב עם מערכת הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לעיל, אנו מתארים את ההליך צעד אחר צעד עבור שיטת הקרנה משופרת להערכת פעילות ה-RSS של P. sojae rxlr מעריקים. בסך הכל, הניסוי נמשך 5-6 שבועות. לאחר מכן, הRSSs המזוהה על-ידי הבחינה יכולה להיות מאופיינת עוד יותר במונחים של פונקציה ומנגנון מולקולרי. כדוגמה לגישה שלנו, השתמשנו P. sojae rxlr השפעות משתיק PHYTOPHTHORA של RNA השתקה 1 (PSR1), אשר מופרש ונמסר לתוך תאים מארחים דרך האוגוריה במהלך הזיהום.
כדי לאשר כי PSR1 יש פעילות RSS ולכן מתאים לשיטה זו, כל מאמץ שהפך agrobacterium היה מעורבב עם זן מחסה 35 s-GFP והוא הסתנן לתוך עלים של N. benthamiana 16c. EV ו CMV2b שימשו פקדים חיוביים שליליים, בהתאמה (איור 1). ביטוי GFP הגיע לרמה הגבוהה ביותר בעלים החדרו לכל התערובות ב-2 ל -3 dpi. עוצמת הקרינה הירוקה נותרה חזקה בכתמים שחדרו עם 35S-GFP פלוס CMV2b במהלך 6-9-יום תקופה של התבוננות21. שיתוף הסתננות של GFP עם PSR1 גם הביא את הזריחה GFP חזק יותר במהלך התקופה של 3.5-4.5 יום של תצפיות, כפי שניתן להדגים על ידי זריחה מוגבה תיקוני מסתנן. עם זאת, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בכתמים חדרו עם 35 s-GFP ו-EV נחלש ב 3 dpi. בשעה 4-5 dpi, הקרינה הפלואורסצנטית GFP בקושי היתה לזיהוי (איור 1).
כתם צפוני גילה כי GFP mRNA נצבר גבוה יותר בעלים המבטא 35 s-GFP פלוס 35S-CMV2b או 35 s-GFP פלוס 35 s-PSR1 מאשר העלים המבטא 35 s-GFP פלוס EV (איור 2). כך, ביטוי הPSR1 של ה, כמו גם CMV2b תרם ייצוב של GFP mRNA, אשר הביא זריחה GFP מוגבה.
בנוסף, השתמשנו בערך החדירה החקלאית כדי להעריך את התפשטות האות ההשתקה בעלים של שתילים בעלי 2 שבועות משנת N. benthamiana 16c. למטרה זו, בדרך כלל בחרנו 3 למעלה 4 עלים גדולים עבור הזרקת עלים שלמים. ב 14 dpi, יותר מ 98% של EV הציגו לא אותות GFP בעלי מערכתית, ואילו הן PSR1 ו CMV2b ביעילות מעכבות את התפשטות מערכתית של האות השתקה על ידי התבוננות זריחה GFP ב כ 80% של צמחים שיתוף חדרו, ו 20% הנותרים של צמחים חדרו עם רק כמה ורידים אדומים הופיעו בעלים חדשים (איור 3
איור 1: Phytophthora sojae rxlr אפקטור PSR1 מדכאת RNA מקומי השתקה ב טבק benthamiana (N. benthamiana) 16c צמחים. מפותחת עלים של 3 עד 4 שבועות N. benthamiana 16c צמחים (הפאנל השמאלי) היו שותפים שחדרו בטלאים עם Agrobacterium תערובות הנושאות 35 s-gfp ואת המבנים המצוינים מעל כל תמונה. הזריחה GFP של האזור חדרו היה התמונה תחת אור טבעי (הלוח האמצעי) ואור UV גל (הפאנל הימני) ב 4 dpi. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. החיצים האדומים מייצגים. עלים שחדרו אליו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הצטברות של מבנה GFP בתוך N. benthamiana 16c עלים. CK ו EV מייצגים N. benthamiana 16c עלים לבד ו 16c עלים שחדרו עם 35 s-gfp פלוס EV. דגימות מ EV ו CMV2b שימשו פקדים חיוביים שליליים, בהתאמה. בנוסף, rRNA שימש כבקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: P. sojae rxlr אפקטור PSR1 מדכאת RNA מערכתית השתקה ב -N. benthamiana 16c צמחים. שלושה או ארבעה עלים של 2 שבועות N. benthamiana 16c שתילים (הפאנל השמאלי) היו באופן משותף לחדרו של Agrobacterium מחסה 35 s-gfp ו EV או וקטור להביע PSR1 או CMV2b מן המקדם של 35. זריחה GFP של עלים שגדלו לאחרונה היתה התמונה תחת אור טבעי (הפאנל העליון) ו-wave ארוך אור UV (פאנל תחתון) ב 14 dpi. ניסוי זה חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. חיצים אדומים. הצביעו על עלים שחדרו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רנ א השתקה הוא מנגנון הגנה מפתח המועסקים על ידי צמחים להילחם ויראלי, חיידקי, o, ופתוגנים פטרייתי. בתורו, החיידקים האלה התפתחו חלבונים מדכא השתקה כדי לנטרל נגיפים השתקה, ואת אלה RSSs להפריע לשלבים שונים של השביל השתקה RNA22,23. כמה הקרנת ההקרנה פותחו כדי לזהות RSSs10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר לסינון חלבונים אפקטור מופרש על ידי P. sojae לתוך התא המארח על היכולת שלהם לדכא RNA השתקה במארח. שיטת השינוי הזאת מבוססת על שיטת הסתננות ויראלית, אך שונה במספר דרכים חשובות. ראשית, הן חיידקים ו -N. צמחים בנת'אמיאנה 16c צריך להיות נמרץ ובריא; זה חשוב מאוד לביטוי יציב של העריקים מפני החיידקים והשימוש ב -N. benthamiana 16c מבטיח מענה ניסיוני ואמינות. אנו משתמשים לעתים קרובות רק שניים או שלושה עלים מפותחים מלא לכל צמח בשלב הצמיחה וגטטיבי, הישן והעלים החדשים אינם מתאימים. שנית, OD600 של התרבות החיידקית חייב להיות מותאם לערך אופטימלי, בדרך כלל 0.75-1.0 עבור Agrobacterium. OD נמוך600 (אפילו נמוך כמו 0.2) ניתן להשתמש כדי למסך vsrs אבל לא psrs24. שלישית, נקודת הזמן האידיאלית לחקירת זריחה ירוקה חייבת להיות ממוטבת עבור כל אפקטור. בנגיף, העלים מוזרק עם תרבויות שמכילות GFP בתוספת התצוגה VSRs מוצג עלייה מסומנת בזריחה ירוקה באזור החדר ב 3 dpi, והאות נשאר גבוה עד 9 dpi22, אבל זה הוצג רק ב 4 או 5 Dpi עבור psrs במחקר הנוכחי שלנו. לכן, חשוב גם לאשר עוד לאשר את הפעילות השתקה RNA ידי לכמת את הצטברות של GFP mRNA. לבסוף, חיוני להשתמש בשליטה המתאימה. VSRs הם לא תמיד שולט חיובי אידיאלי לזיהוי חלבונים אפקטור, כי חלבונים אלה יש פעילות מדכאים הרבה יותר חזק מ PSRs. זה יכול לגרום לכישלון לגלות דכאי חלש של RNA השתקה.
בדוח זה, אנו מדגימים את השימוש בדכאי המתוקן שלנו על המסך לצורך השתקה של RNA Phytophthora ו puccinia graminis . לפיכך, השיטה שלנו מייצגת כלי שימושי לאפיון מקודדים פוטנציאליים שקודד RSSs, אשר מקדמים את הרגישות למחלות על ידי עיכוב קטן RNA הצטברות15,16,17. לכן, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו ניתן להשתמש באופן כללי כדי המסך מופרש על ידי פתוגנים צמחים. העבודה העתידית יתמקד בזיהוי RSSs יותר בפתוגנים אחרים, ובהסבר לתפקיד ה-RNA השתקה בהגנה על הצמח מפני חיידקים פולשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים של "שואנג תוכנית" של קרן לפיתוח החינוך שנגחאי הנציבות העירונית של שנגחאי ועדת החינוך העירוני, מחקר המפתח הלאומי תוכנית פיתוח של סין המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין ( 2018YFD0201500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 31571696 ו 31660510), התוכנית אלף כשרונות עבור אנשי מקצוע צעירים של סין, ואת הנציבות המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
