पौधे रोगजनकों के स्रावित प्रभावकों से आरएनए को बंद करने वाले दमनकर्ताओं की स्क्रीनिंग और पहचान
Summary
यहां, हम एक संशोधित स्क्रीनिंग विधि पेश करते हैं जिसका उपयोग पौधे रोगजनकों में दबाने वालों को जल्दी से स्क्रीन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया जा सकता है।
Abstract
आरएनए चुप्पी एक विकासवादी संरक्षित, अनुक्रम विशिष्ट जीन विनियमन तंत्र है। कई पौधे रोगजनकों ने मेजबान संयंत्र आरएनए को रोकने के मार्ग को बाधित करने की क्षमता के साथ प्रोटीन विकसित किया है। वायरस प्रभावक प्रोटीन के विपरीत, केवल कई स्रावित प्रभावक प्रोटीन ने बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल रोगजनकों में आरएनए को दबाने की क्षमता दिखाई है, और अधिकांश प्रभावकों के आणविक कार्य काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। यहां, हम विस्तार से सह घुसपैठ परख का एक थोड़ा संशोधित संस्करण का वर्णन है कि आरएनए चुप्पी देख और संयंत्र रोगजनकों द्वारा स्रावित प्रभावक प्रोटीन की विशेषता के लिए एक सामांय विधि के रूप में काम कर सकता है । दृष्टिकोण के प्रमुख कदम स्वस्थ और पूरी तरह से विकसित पत्तियों का चयन कर रहे हैं, ६०० एनएम पर उचित ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के लिए बैक्टीरिया संस्कृति का समायोजन, और घुसपैठ पर इष्टतम समय पर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फ्लोरेसेंस देख कमजोर दमन गतिविधि के साथ प्रभावकों को छोड़ने से बचने के लिए छोड़ देता है। यह बेहतर प्रोटोकॉल आरएनए के दमन को बंद करने में तेजी से, सटीक और व्यापक स्क्रीनिंग में योगदान देगा और इन प्रोटीनों के आणविक कार्यों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करेगा।
Introduction
पिछले दो दशकों में, पौधों की बीमारियों का कारण बनने वाले सूक्ष्मजीवों के जीनोम अनुक्रमण में त्वरण के कारण अनुक्रम की जानकारी और एन्कोडेड प्रोटीन के जैविक कार्यों के बीच लगातार बढ़ते ज्ञान का अंतर पैदा हुआ है। अनुक्रमण परियोजनाओं द्वारा प्रकट अणुओं में प्रभावक अणु हैं जो सहज प्रतिरक्षा को दबाते हैं और मेजबान उपनिवेशीकरण की सुविधा प्रदान करते हैं; इन कारकों को विनाशकारी पौधे रोगजनकों द्वारा स्रावित किया जाता है, जिसमें बैक्टीरिया, सूत्रकृमि और तंतु रोगाणु शामिल हैं। इन खतरों का जवाब देने के लिए, मेजबान पौधों ने उपन्यास रिसेप्टर्स विकसित किए हैं जो इन प्रभावकों को पहचानते हैं, जिससे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की बहाली को सक्षम किया जा सके। इसलिए, प्रभावक विभिन्न चयनात्मक दबावों के अधीन होते हैं, जिससे रोगजनक वंश 2 के बीच प्रभावक प्रदर्शनों का विविधीकरणहोताहै। हाल के वर्षों में, पौधे रोगजनकों के ख्यात प्रभावकों को विभिन्न तरीकों से रोगाणुओं को लाभ पहुंचाने के लिए मेजबान सेलुलर प्रक्रियाओं को बाधित करके पौधों की सहज प्रतिरक्षा को बाधित करने केलिए दिखाया गया है, जिसमें सिग्नलिंग पाथवे, ट्रांसक्रिप्शन, इंट्रासेलुलर परिवहन, साइटोस्केलेटन स्थिरता, वेसिकल ट्रैफिकिंग और आरएनए को3,4,5का डिस्रेगुलेशन शामिल है । हालांकि, रोगजनक प्रभावकों के विशाल बहुमत, विशेष रूप से तंतुओं रोगजनकों से उन, रहस्यपूर्ण बने हुए हैं ।
आरएनए साइलेनिंग एक होमोलॉजी-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता मशीनरी है जिसे यूकेरियोट्स के बीच संरक्षित किया जाता है। यह प्रक्रिया लंबे समय से डबल-फंसे आरएनए (dsRNA) से शुरू होती है और एक अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से एक प्रकार का शब्दका हुआ आरएनए (ssRNA) को लक्षित करती है, और यह एंटीवायरल रक्षा6सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में हेरफेर करती है। मेजबान की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पार करने के लिए, कुछ वायरस आरएनए साइलेंटिंग को ऑफसेट करने के लिए विकसित हुए हैं, जिसमें इंट्रासेलर डिब्बों के अंदर दोहराने या मुंह में पुनर्गठित संकेत से बचने की क्षमता शामिल है। फिर भी, सबसे सामान्य रणनीति जिसके द्वारा वायरस जीन फ़ंक्शन के आरएनए के खिलाफ अपने जीनोम की रक्षा करते हैं, वह विशिष्ट प्रोटीन को एन्कोड करना है जो आरएनए को7,8को दबादेता है। आरएनए सिलेक्टिंग (वीआरएस) के वायरल दमनकों को स्क्रीन और विशेषता देने के लिए कई मशीनी रूप से अलग-अलग दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं, जिनमें एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैक्यूप्स संस्कृतियों की सह-घुसपैठ, परिवर्तनीय दमनक, ग्राफ्टिंग और सेल संस्कृति9,10,11,12, 13को व्यक्त करना शामिल है।
इन परखों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान हैं, और अपने अलग तरीके से वीआरएस की पहचान करता है। सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक व्यक्तिगत ए tmuefaciens संस्कृतियों के सह घुसपैठ पर आधारित है संभावित वायरल प्रोटीन और एक रिपोर्टर जीन (आम तौर पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]) निकोतियाना बेंथमियाना 16c पौधों पर संविलियन फूलगोभी पच्चीकारी वायरस 35S प्रमोटर के नियंत्रण में GFP व्यक्त । एक सक्रिय वायरल मुंह दबाने के अभाव में, GFP मेजबान कोशिकाओं द्वारा बहिर्जात के रूप में पहचानकी जाती है और घुसपैठ के बाद (डीपीआई) 3 दिनों के भीतर खामोश है। इसके विपरीत, यदि वायरल प्रोटीन दमन गतिविधि के पास है, तो जीएफपी का अभिव्यक्ति स्तर 3−9 डीपीआई9से परे स्थिर रहता है। यह सह घुसपैठ परख सरल और तेजी से है; हालांकि, यह न तो अत्यधिक स्थिर है और न ही संवेदनशील है। फिर भी, परख कई आरएनए वायरस7,8में विविध प्रोटीन दृश्यों और संरचनाओं के साथ कई VSRs की पहचान की है ।
हाल ही में, कई प्रभावक प्रोटीन जो सेलुलर आरएनए को बाधित कर सकते हैं, बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल प्लांटरोगजनक14,15,16से विशेषता है। इन निष्कर्षों का मतलब है कि आरएनए को दमन करना संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक आम रणनीति है जिसका उपयोग अधिकांश राज्यों में रोगजनकों द्वारा किया जाता है। सिद्धांत रूप में, कई, यदि सभी नहीं हैं, तो प्रभावकआरएनए को दबाने वालों (आरएसएसएस) को एन्कोड कर सकते हैं; आज तक, हालांकि, केवल कुछ की पहचान की गई है, मुख्य रूप से विश्वसनीय और सामान्य स्क्रीनिंग रणनीति की कमी के कारण। इसके अलावा, आरएनए के दमन की जांच17पौधे रोगजनकों के विशाल बहुमत में नहीं की गई है।
इस रिपोर्ट में, हम संयंत्र रोगजनक प्रभावकों की पहचान करने के लिए एक अनुकूलित और सामान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो कृषि घुसपैठ परख का उपयोग करके स्थानीय और प्रणालीगत आरएनए को दबा सकता है। इस अध्ययन का सबसे महत्वपूर्ण उद्देश्य प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलुओं पर जोर देना और चरणों का विस्तार से वर्णन करना था, जिससे एक स्क्रीनिंग परख प्रदान करना था जो पौधे रोगजनकों के लगभग सभी प्रभावकों के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए मुंह एक प्रमुख रक्षा पौधों द्वारा नियोजित तंत्र है जो वायरल, बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए है। बदले में, ये रोगाणु एंटीवायरल मुंह का प्रतिकार करने के लिए दमनकारी प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को शंघाई शिक्षा विकास फाउंडेशन और शंघाई म्यूनिसिपल एजुकेशन कमिशन के “शुगुआंग कार्यक्रम” से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम ( 2018YFD0201500), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31571696 और 31660510), चीन के युवा पेशेवरों के लिए हजार प्रतिभा कार्यक्रम, और शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (18DZ2260500) ।
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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