Summary

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

Published: February 03, 2020
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Abstract

O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.

Introduction

Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas1. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da resposta imune. Assim, os efetivadores estão sujeitos a diversas pressões seletivas, levando à diversificação de processos ou repertórios entre as linhagens patógenas2. Nos últimos anos, os agentes putativos de patógenos vegetais têm mostrado interromper a imunidade inata da planta, impedindo processos celulares hospedeiros para beneficiar os micróbios de várias maneiras, incluindo a disregulação de caminhos de sinalização, transcrição, transporte intracelular, estabilidade do citoesqueleto, tráfico de vesículos e silenciamento de RNA3,4,5. No entanto, a grande maioria dos patógenos, particularmente os de patógenos filamentous, permaneceram enigmáticos.

O silenciamento de RNA é uma máquina de inativação genética mediada por homologia que é conservada entre eupedia. O processo é desencadeado por longoR de dupla cadeia (dsRNA) e tem como alvo o RNA homônimo de uma única cadeia (ssRNA) de forma específica de sequência, e manipula uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a defesa antiviral6. Para superar as respostas imunes inatas do hospedeiro, alguns vírus evoluíram para compensar o silenciamento de RNA, incluindo a capacidade de se replicar dentro de compartimentos intracelulares ou escapar do sinal reorganizado silenciante. No entanto, a estratégia mais geral pela qual os vírus protegem seus genomas contra a perda dependente de RNA da função genética é codificar proteínas específicas que suprimem o RNA silenciando7,8. Várias abordagens mecanicamente diferentes foram estabelecidas para tela e caracterizam supressores virais de silenciamento de RNA (VSRs), incluindo a co-infiltração de culturas de tumefaciens Agrobacterium, plantas transgênicas expressando supressores putativos, enxerto e cultura celular9,10,11,12,13.

Cada um desses ensaios tem vantagens e desvantagens, e identifica VSRs de sua maneira distinta. Uma das abordagens mais comuns baseia-se na co-infiltração de culturas individuais a. tmuefaciens que abrigam a proteína viral potencial e um gene repórter (tipicamente proteína fluorescente verde [GFP]) nas plantas nicotiana benthamiana 16c constitutivamente expressando GFP o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor. Na ausência de um supressor viral ativo, o GFP é identificado como exógeno pelas células hospedeiras e é silenciado dentro de 3 dias após a infiltração (dpi). Em contrapartida, se a proteína viral possui atividade de supressão, o nível de expressão do GFP permanece estável além de 3-9 dpi9. Este ensaio de co-infiltração é simples e rápido; no entanto, não é altamente estável nem sensível. No entanto, o ensaio identificou inúmeros VSRs com diversas sequências e estruturas proteicas em muitos vírus RNA7,8.

Recentemente, várias proteínas effectoras que podem inibir a atividade de silenciamento de RNA celular foram caracterizadas a partir de patógenos vegetais bacterianos, oomycete e fúngicos14,15,16. Esses achados implicam que a silenciamento de RNA é uma estratégia comum para facilitar a infecção que é usada por patógenos na maioria dos reinos. Em teoria, muitos, se não todos, dos efetivadores podem codificar supressores de rna silenciando (RSSs); até o momento, porém, apenas alguns foram identificados, principalmente devido à escassez da estratégia de triagem confiável e geral. Além disso, supressores de silenciamento de RNA não foram investigados na grande maioria dos patógenos vegetais17.

Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado e geral para identificar os efeitos de patógenos vegetais que podem suprimir o silenciamento de RNA local e sistêmico usando o ensaio de agroinfiltração. O principal objetivo deste estudo foi enfatizar os aspectos-chave do protocolo e descrever as etapas detalhadas, fornecendo assim um ensaio de triagem adequado para quase todos os efeitos dos patógenos vegetais.

Protocol

NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR). ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar. 1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a in…

Representative Results

Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da h…

Discussion

O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss10.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios do “Programa Shuguang” da Fundação de Desenvolvimento educacional de Xangai e da Comissão Municipal de Educação de Xangai, do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da Chave Nacional da China ( 2018YFD0201500), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31571696 e 31660510), o Programa Mil Talentos para Jovens Profissionais da China e a Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (18DZ2260500).

Materials

2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) Biofroxx 1086GR500 Buffer
2xTaq Master Mix Vazyme Biotech P112-AA PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Amresco 0264C507-1KG MOPS Buffer
Acetosyringone (AS) Sigma-Aldrich D134406-5G Induction of Agrobacterium
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG LB medium
Agarose Biofroxx 1110GR100 Electrophoresis
Amersham Hybond -N+ GE Healthcare RPN303 B Nothern blot
Amersham Imager GE Healthcare Amersham Imager 600 Image
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 LB medium
Bacto Yeast Extraction BD Biosciences 212750 LB medium
Camera Nikon D5100 Photography
ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits Thermo Fisher Scientific 89880 Luminescence detection
Chloramphenicol Amresco 0230-100G Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit Vazyme Biotech C112-01 Ligation
DIG Easy Hyb Sigma-Aldrich 11603558001 Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit TransGen Biotech EM101-02 Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit TransGen Biotech EG101-02 Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate Amresco/VWR 0105-1KG MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply LiuYi DYY6D Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV Thermo Fisher Scientific FD0304 Vector digestion
Gel Image System Tanon Tanon3500 Image
Gentamycin Amresco 0304-5G Antibiotics
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich K1914 Antibiotics
LR Clonase II enzyme Invitrogen 11791020 LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um GE Healthcare 10600002 Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit Thermo Fisher Scientific 17075 Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers Bio-Rad T100 PCR
Peat moss PINDSTRUP Dark Gold + clay Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer ICE Peter Professional 20-20-20 Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme Biotech P505-d1 Enzyme
Rifampicin MP Biomedicals 219549005 Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X) Thermo Fisher Scientific R0641 RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate Amresco/VWR 0530-1KG MOPS Buffer
Sodium Chloride Amresco 0241-10KG LB medium
Tri-Sodium citrate Amresco 0101-1KG SSC Buffer
Trizol Reagent Invitrogen 15596018 RNA isolation reagent
UV lamp Analytik Jena UVP B-100AP Observation
UVP Hybrilinker Oven Analytik Jena OV2000 Northern

References

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).

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Cite This Article
Shi, J., Jia, Y., Fang, D., He, S., Zhang, P., Guo, Y., Qiao, Y. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (156), e60697, doi:10.3791/60697 (2020).

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