Her præsenterer vi en modificeret screeningsmetode, der i vid udstrækning kan bruges til hurtigt at screene RNA-lyddæmpningsundertrykkere i plantepatogener.
RNA-lyddæmpning er en evolutionært bevaret, sekvensspecifik genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har udviklet proteiner med evnen til at hæmme værtsplanten RNA-lyddæmpningsvejen. I modsætning til virus effektor proteiner, kun flere udskilles effektor proteiner har vist evnen til at undertrykke RNA lyddæmpning i bakterielle, oomycete, og svampepatogener, og de molekylære funktioner i de fleste effektorer forbliver stort set ukendt. Her beskriver vi i detaljer en let modificeret version af co-infiltration assay, der kunne tjene som en generel metode til at observere RNA lyddæmpning og til karakterisering effektor proteiner udskilles af plantepatogener. De vigtigste trin i tilgangen er at vælge de sunde og fuldt udviklede blade, justere bakteriekulturen til den relevante optiske tæthed (OD) ved 600 nm, og observere grønne fluorescerende protein (GFP) fluorescens på det optimale tidspunkt på den infiltrerede for at undgå at udelade effektorer med svag undertrykkelsesaktivitet. Denne forbedrede protokol vil bidrage til hurtig, præcis og omfattende screening af RNA-lyddæmpningsundertrykkere og tjene som et glimrende udgangspunkt for at undersøge disse proteiners molekylære funktioner.
I løbet af de sidste to årtier har acceleration i genomsekventering af mikroorganismer, der forårsager plantesygdomme, ført til en stadig stigende videnkløft mellem sekvensinformation og de biologiske funktioner i kodede proteiner1. Blandt de molekyler, der afsløres ved sekventering projekter er effector molekyler, der undertrykker medfødte immunitet og lette vært kolonisering; disse faktorer udskilles af destruktive plantepatogener, herunder bakterier, nematoder og filamentousmikrober. For at reagere på disse trusler, værtsplanter har udviklet nye receptorer, der genkender disse effektorer, muliggør restaurering af immunrespons. Derfor er effektorer udsat for forskellige selektive pres, hvilket fører til diversificering af effektor repertoirer blandt patogen slægter2. I de seneste år har formodede virkningsfaktorer fra plantepatogener vist sig at forstyrre plantemedfødte immunitet ved at hindre værtscelleprocesser til gavn for mikrober på en række forskellige måder, herunder dysregulering af signalveje, transskription, intracellulær transport, cytoskeletstabilitet, vesikelhandel og RNA-lyddæmpning3,4,5. Langt de fleste patogeneffektorer, især dem fra filamentouspatogener, er dog forblevet gådefulde.
RNA-lyddæmpning er en homologimedieret geninaktiveringsmaskiner, der bevares blandt eukaryoter. Processen udløses af lange dobbeltstrengede RNA (dsRNA) og er rettet mod det homologe enstrengede RNA (ssRNA) på en sekvensspecifik måde, og den manipulerer en bred vifte af biologiske processer, herunder antiviralt forsvar6. For at overvinde værtens medfødte immunrespons har nogle vira udviklet sig til at kompensere for RNA-lyddæmpning, herunder evnen til at replikere inde i intracellulære rum eller flygte fra det dæmpende reorganiserede signal. Ikke desto mindre er den mest generelle strategi, hvorved virus beskytter deres genomer mod RNA-hæmningsafhængig tab af genfunktion, at kode specifikke proteiner, der undertrykker RNA-hæmning7,8. Flere mekanistisk forskellige tilgange er blevet etableret for at screene og karakterisere virale suppressorer af RNA-lyddæmpning (VSRs), herunder co-infiltration af Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter udtrykker formodede suppressorer, podning og cellekultur9,10,11,12,13.
Hver af disse analyser har fordele og ulemper, og identificerer VSRs på sin egen særskilte måde. En af de mest almindelige tilgange er baseret på co-infiltration af individuelle A. tmuefaciens kulturer huser den potentielle virale protein og en reporter gen (typisk grøn fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c planter konstituerende udtrykke GFP under kontrol af blomkål mosaik virus 35S promotor. I mangel af en aktiv viral lyddæmpningssuppressor identificeres GFP som udefrakommende af værtscellerne og lukkes inden for 3 dage efter infiltration (dpi). Hvis det virale protein derimod har undertrykkelsesaktivitet, forbliver ekspressionsniveauet for GFP stabilt ud over 3−9 dpi9. Denne co-infiltration assay er enkel og hurtig; Den er dog hverken meget stabil eller følsom. Ikke desto mindre har analysen identificeret mange VSRs med forskellige proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-vira7,8.
For nylig, flere effektor proteiner, der kan hæmme cellulære RNA lyddæmpning aktivitet er blevet karakteriseret ved bakterielle, oomycete, og svampeplante patogener14,15,16. Disse resultater indebærer, at RNA-undertrykkelse af lyddæmpning er en fælles strategi for at lette infektion, der bruges af patogener i de fleste kongeriger. I teorien kan mange, hvis ikke alle, af effektorerne indkode RNA-lyddæmpere (RSS); til dato er kun nogle få imidlertid blevet identificeret, hovedsagelig på grund af manglen på den pålidelige og generelle screeningsstrategi. Desuden er undertrykkere af RNA-hæmning ikke blevet undersøgt i langt de fleste plantepatogener17.
I denne rapport præsenterer vi en optimeret og generel protokol til identifikation af plantepatogeneffektorer, der kan undertrykke lokale og systemiske RNA-lyddæmpning ved hjælp af agroinfiltrationsanalysen. Hovedformålet med denne undersøgelse var at understrege de centrale aspekter af protokollen og beskrive trinene i detaljer, hvorved der gives en screeningsanalyse, der er egnet til næsten alle effektorer af plantepatogener.
RNA-hæmning er en vigtig forsvarsmekanisme, der anvendes af planter til bekæmpelse af virale, bakterielle, oomycete og svampepatogener. Til gengæld har disse mikrober udviklet lyddæmpning suppressor proteiner til at modvirke antiviral hæmning, og disse RSS’er forstyrre forskellige trin i RNA lyddæmpning vej22,23. Flere screening assays er blevet udviklet til at identificere RSSs10.
Her beskriver vi en forb…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra “Shuguang Program” af Shanghai Education Development Foundation og Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program i China National Key R & U Program of China ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 og 31660510), Thousand Talents Program for Young Professionals of China og Science and Technology Commission of Shanghai Kommune (18DZ2260500).
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
Camera | Nikon | D5100 | Photography |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |