Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi
Summary
Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.
Abstract
Bir proteom içindeki her yerde bulunan zincir topolojilerinin küresel profilinin değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için ilgi çekicidir. Burada özetlenen protokol, bir zincire dahil edilen ubiquitin’in triptik sindirimi sonrasında kalan di-glisin (-GG) değişikliğinden yararlanır. Bu topoloji karakteristik peptitleri ölçerek her bir ubiquitin zincir topolojisinin göreceli bolluğu belirlenebilir. Bu peptitleri paralel reaksiyon izleme deneyi ile ölçmek için gereken adımlar, ubiquitin zincirlerinin stabilizasyonu dikkate alınarak bildirilmektedir. Ağır kontrollerin hazırlanması, hücre lizisi ve sindirim, uygun kütle spektrometresi kurulumu ve veri analizi iş akışı ile birlikte açıklanmaktadır. Protokolün en iyi duruma getirilmesi sonuçların nasıl etkileyebileceğine ilişkin örnekler eşliğinde, ubiquitin topolojisinde pertürbasyonlarla bir örnek veri kümesi sunulmaktadır. Bir kullanıcı, özetlenen adımları izleyerek, biyolojik bağlamı içinde her yerde bulunan topoloji manzarasının küresel bir değerlendirmesini gerçekleştirebilecektir.
Introduction
Biyolojinin fenotipik kontrolünün başlıca iticileri oldukları için protein fonksiyonu ve stabilitesinin yakın düzenlenmesi son derece önemlidir. Bir proteinin işlevi iki bileşenden oluşturulur: içsel polipeptid dizisi ve herhangi bir posttranslational modifikasyon (PTM). Glikosilasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon1dahil olmak üzere çeşitli kimyasal PTM’ler tanımlanmıştır. 1975’te Goldstein ve ark.2 küçük bir protein tanımladı ve her yerde bulunan doğası nedeniyle her yerde olarak adlandırdı. Ubiquitin protein bozulmasında önemli bulunmuştur3. Bununla birlikte, o zamandan beri ubiquitin’in bir sinyal molekülü olarak işlevinin protein stabilitesinin düzenlenmesinin çok ötesine uzandığı tespit edilmiştir. Ubiquitin sinyali, protein stabilizasyonu, otofaji, hücre döngüsü kontrolü ve protein kaçakçılığı4gibi çok çeşitli diğer biyolojik işlevlerde yer almaktadır.
Diğer PTM’ler genellikle belirli bir site için ikili (yani protein modifiye edilir veya değiştirilmeden bırakılır) iken, ubiquitin bir proteini hem monomer hem de polimerik zincir olarak değiştirebilir ve ekli her yerde bulunur. Ayrıca, bu poliubiquitination zinciri, sekiz bağlantı sitesinden birine bağlı önceki ubiquitin’in her yerde bulunması ile çeşitli topolojilerde gelişebilir5,6. Ubiquitin, ubiquitin’in C-terminusunun yedi lizin kalıntılarından birine bağlı olduğu çok çeşitli enzip enzymatic bir işlemle transfer edilir (K06, K11, K27, K29, K33, K48 veya K63) veya önceki her yerde bulunanın N terminali (M1 veya doğrusal her yerde bulunma olarak adlandırılır)5,6. Bu zincir topolojisi, modifikasyonun altındaki proteinin kaderinin anahtarıdır. Örneğin, K48 veya K11 bağlantılı bir zincirle yapılan değişiklik, proteozomdaki değiştirilmiş proteinin bozulmasına yol açarken, NF-kB sinyalinin aktivasyonu için doğrusal bir zincir gereklidir. Bu nedenle, bu zincir topolojilerinin göreceli dağılımı çok çeşitli biyolojik sorularla ilgilidir.
Kütle spektrometresi (MS) kullanımı, antikor bazlı veya benzeşim tabanlı etkileşimlere dayanmadığı için her yerde zincir topoloji analizine özel bir fayda sağlar7,8, birçoğu sınırlı özgüllüğe sahiptir ve çeşitli zincir türleri arasında ayrım yapmaz. Farklı bir algılama olasılığı genetiği değiştirilmiş her yerde mutantlar kullanmaktır. Burada, belirli bir lizin, ubiquitin tarafından modifikasyonu destekleyemeyen arginin ile değiştirilir. Substrat proteininde ubiquitin zinciri oluşumunun olmaması daha sonra belirli bir topoloji için kanıt olarak yorumlanır9.
Her yerde bulunan proteinlerin MS tabanlı tanımlanması, ubiquitin C-terminusunun, MS analizi için numunelerin proteolitik hazırlanması sırasında tripsin tarafından tanınan ve C-terminal çift glisini ayıran 74 pozisyonunda bir arginin kalıntısı içermesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu GlyGly (-GG), substrat proteininin lizin kalıntısının ε-amino grubuna bağlı kalır. Ubiquitin topoloji analizi için, modifikasyon ubiquitin yedi lizin kalıntılarından birinde meydana gelir. Bu, topolojilerin her birine özgü, GG tarafından değiştirilen bir lizin kalıntısı taşıyan yedi anahtar peptit kümesi oluşturur (Şekil 2). Örneğin, K06 topolojisi ile, amino asit dizisindeki 6 pozisyonundaki lizin, bu lizine eklenen 114 Da’nın -GG modifikasyonu ile triptik sindirimden korunacaktır.
MS tarafından önceden belirlenmiş belirli peptitlerin tanımlanması, hedeflenen proteomik veya daha spesifik olarak hedeflenen peptit alımı10olarak adlandırılır. Kullanılan kütle spektrometresinin performansına bağlı olarak iki yöntem geliştirilmiştir. Bunlar, çoklu reaksiyon izleme (MRM) ve paralel reaksiyon izleme (PRM) olarak da adlandırılan seçilmiş reaksiyon izlemedir (SRM). SRM, öncü m/z ve ürün iyon m/z’den oluşan geçişlerin seçimini içerir. Tersine, PRM yalnızca öncül m/z gerektirir. Seçim sonrası, ürün iyonlarının tam bir anket taraması yapılır. Bu, ölçüm11’denönce belirli kütle spektrometresinde nicellik için uygun ürün iyonlarının seçilmesinin gerekli olmaması avantajına sahiptir. Hem SRM hem de PRM, cihaza bağlı olarak zamanlanabilir. Planlama, peptitler kromatografik sistemden tanımlanmış saklama sürelerinde elde olduğu için, belirli bir iyonun analiz için dahil edileceğini bir zaman penceresi atama uygulamasıdır. Herhangi bir zamanda sorgulanan iyonların sayısını azaltmak, o sırada planlanan iyonların sorgulanma sıklığını arttırır, böylece veri doğruluğunu artırır.
Genel olarak, ubiquitin topolojisi için hedeflenen proteomik uygulaması, hedeflenen diğer proteomik deneylerle aynıdır. Bununla birlikte, iki temel fark önemlidir: Birincisi, her yerde bulunan zincirlerin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Hücre lizisi üzerinde zincirleri hızla bozan birden fazla güçlü deubiquitinating enzim (DUB) vardır. Her yerde bulunan spesifik proteazlar iki kategoriye ayrılır: tiyoesterazlar ve metalloproteazlar. Ubiquitin-hidrolazların çoğu tiyoesterazdır ve aktif merkezlerinde sistein kalıntısı taşır. Bu sistein kalıntısını alklating atederek, inaktive edilebilirler. Bu nedenle, N-etirilimid (NEM) gibi alkilleştirici ajanlar içeren ubiquitin stabilizasyon tamponlarının ve yüksek oranda denatüre edici kimyasalların kullanılması ve numunelerin soğutulması başarılı bir analiz için hayati öneme sahiptir. İkincisi, diğer hedeflenen deneylerin aksine, peptit seçimi sabittir. Tipik bir hedefli deneyde, iyi kromatografik ve iyonlaşma performansı için proteotipik bir peptit seçilebilir. K48 gibi bazı topoloji karakteristik peptitler için bu özellikler iyidir, diğerleri için ise daha az arzu edilir. Örneğin, tipik bir ters faz kurulumunda K33 kromatografisi, gerilmiş bir elüsyon profilinin oluşumu nedeniyle zayıftır ve K27 peptidinin zayıf iyonlaşma özellikleri görünürlüğünü MS12azaltır.
Bu protokolde, PRM tarafından biyolojik bir numunenin ubiquitin topoloji değerlendirmesinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Prosedür için örnek veriler, birkaç farklı hücre tipinde MG-132 inhibitör tedavisi kullanılarak proteazomun pertürbasyonu kullanılarak sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir proteom içindeki ubiquitin durumunun analizi, çok çeşitli biyolojik sorular için giderek daha fazla önem taşımaktadır. Bir örneğin her yerde bulunma durumunun tanımı sadece her yerde bulunan proteinlerin profiline değil, aynı zamanda bu tür her yerde bulunanların topolojisine de odaklanmalıdır. Bu topolojinin burada açıklandığı gibi hedeflenen MS tarafından değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik araştırmalarda rol oynar.
Burada özetlenen protokolün küres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, temsili sonuçlarda açıklandığı gibi MG-132 tedavisi ile hücresel peletlerin oluşturulmasındaki yardımı için Céline Jeanty’ye ve protokolde kullanılan E. coli peletlerini temini için Elise Mommaerts’e teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
