Summary

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Abstract

Organoïden bieden zelforganiserende, driedimensionale weefselstructuren die fysiologische processen samenvatten in het gemak van een gerecht. De murine borstklier bestaat uit twee verschillende epitheelcelcompartimenten, die verschillende functies vervullen: de buitenste, contractiele myoepitheelcompartiment en het binnenste, secretoire luminaircompartiment. Hier beschrijven we een methode waarmee de cellen bestaande uit deze compartimenten worden geïsoleerd en vervolgens gecombineerd om hun individuele afstamming bijdragen aan borstklier morfogenese en differentiatie te onderzoeken. De methode is eenvoudig en efficiënt en vereist geen geavanceerde scheidingstechnologieën zoals fluorescentie geactiveerde celhet sorteren. In plaats daarvan oogsten en verwerken we het weefsel enzymatisch, zaaien we het epitheel op aanhangende weefselkweekgerechten en gebruiken we differentiële trypsinisatie om myoepitheel te scheiden van luminale cellen met ~90% zuiverheid. De cellen worden vervolgens verguld in een extracellulaire matrix waar ze zich organiseren in tweelaagse, driedimensionale (3D) organoïden die kunnen worden gedifferentieerd om melk te produceren na 10 dagen in de cultuur. Om de effecten van genetische mutaties te testen, kunnen cellen worden geoogst uit wilde type of genetisch gemanipuleerde muismodellen, of ze kunnen genetisch worden gemanipuleerd voorafgaand aan de 3D-cultuur. Deze techniek kan worden gebruikt om mozaïekorganoïden te genereren die het mogelijk maken om de genfunctie specifiek in het luminale of myoepitheelcompartiment te onderzoeken.

Introduction

De borstklier (MG) is een boomachtige, buisvormige epitheelstructuur ingebed in een adipocyte rijke stroma. Het tweelaagse buisepitheel bestaat uit een buitenste, basale laag contractiele, myoepitheelcellen (MyoECs) en een binnenste laag van luminale, secretoire epitheelcellen (LEC’s), die een centraal lumenomringen 1. Tijdens de lactatie wanneer de buitenste MyoECs contract om melk te persen uit de binnenste alveolar LECs, de MG ondergaat tal van veranderingen die onder de controle van groeifactoren (bijvoorbeeld, EGF en FGF) en hormonen (bijvoorbeeld progesteron, insuline, en prolactine). Deze veranderingen veroorzaken de differentiatie van gespecialiseerde structuren, longblaasjes, die melk synthetiseren en afscheiden tijdens lactatie1. De borstepithelia kan experimenteel worden gemanipuleerd met behulp van technieken waarbij ofwel epitheliale weefselfragmenten, cellen, of zelfs een enkele basale cel worden getransplanteerd in gastheer borstvetpads, vooraf gerooid van endogene borstparenchyma, en mag uitgroeien tot een volledige, functionele epitheelboom2,3,4,5. Transplantatie is een krachtige techniek, maar het is tijdrovend en onmogelijk als een mutatie resulteert in vroege embryonale letaliteit (voorafgaand aan E14) die de redding van transplanteerbare borstanlage voorkomt. Verder willen onderzoekers vaak onderzoek doen naar de rollen van de twee verschillende compartimenten, die zijn afgeleid van stamgebonden voorlopercellen. Hoewel Cre-lox-technologie differentiële genetische manipulatie van MyoECs en LEC’s mogelijk maakt, is dit ook een tijdrovende en dure onderneming. Sinds de jaren vijftig hebben onderzoekers dus in vitro borstorganoïden gebruikt als een relatief eenvoudige en efficiënte manier om vragen over de structuur van het borstweefsel en functie6,7aan te pakken.

In vroege protocollen die de isolatie en de cultuur van primaire borstepitheelcellen beschrijven, vonden de onderzoekers dat een demembraanmatrijmat (BME), die uit een plasmastolsel en kippenembryouittreksel wordt samengesteld, voor mg fragmenten nodig was die op een schotel worden gekweekt6. In de volgende decennia werden extracellulaire matrices (EPM’s, collageen en geleiachtige eiwitmatrix, uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoomcellen) ontwikkeld om de 3D-cultuur te vergemakkelijken en de in vivo omgeving7,8,,9,10beter na te bootsen. Kweekcellen in 3D-matrices onthulddoor meerdere criteria (morfologie, genexpressie en hormoonresponsiviteit) dat een dergelijke micro-omgeving betere modellen in vivo fysiologische processen9,10,11,12. Onderzoek met primaire murinecellen identificeerde belangrijke groeifactoren en morfogenen die nodig zijn voor het uitgebreide onderhoud en de differentiatie van organoïden13. Deze studies hebben het podium voor het protocol hier gepresenteerd, en voor de cultuur van menselijke borstcellen als 3D-organoïden, dat is nu een modern klinisch instrument, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen en drugs testen op patiënt monsters14. Over het algemeen benadrukt organoïde kweekde de zelforganisatiecapaciteiten van primaire cellen en hun bijdragen aan morfogenese en differentiatie.

Hier gepresenteerd is een protocol om de cultuur murine epithelia die kan worden gedifferentieerd in melkproducerende acini. Een differentiële trypsinisatietechniek wordt gebruikt om de MyoECs en LEC’s te isoleren die de twee verschillende MG-celcompartimenten omvatten. Deze gescheiden celfracties kunnen dan genetisch worden gemanipuleerd om de genfunctie te overexpresseren of neer te halen. Omdat afstamming-intrinsieke, zelforganisatie is een aangeboren eigenschap van borstepitheelcellen15,16,17, recombining deze celfracties kunnen onderzoekers om tweelaagse, mozaïek organoïden te genereren. We beginnen met enzymatisch verteren van het vetweefsel, en vervolgens het uitbroeden van de borstfragmenten op een weefsel kweekschotel voor 24 uur (Figuur 1). De weefselfragmenten vestigen zich op polystyreengerechten als tweelaagse fragmenten met hun in vivo organisatie: buitenste myoepitheellaag rond binnenarmatuurlagen. Deze cellulaire organisatie zorgt voor de isolatie van de buitenste MyoECs door trypsin-EDTA (0,05%) behandeling voor 3-6 min gevolgd door een tweede ronde trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die de resterende binnenste LEC’s losmaakt(figuur 2). Zo worden deze celtypen met verschillende trypsinegevoeligheid geïsoleerd en vervolgens gemengd en verguld in ECM(figuur 3). De cellen ondergaan zelforganisatie om tweelagige bollen te vormen, bestaande uit een buitenste laag MyoECs rond innerlijke LEC’s. Lumenvorming treedt op als de cellen groeien in een medium met een cocktail van groeifactoren (zie recepten voor Growth Medium)13. Na 5 dagen kunnen organoïden worden onderscheiden in melkproducerende acini door over te schakelen op Alveologenesis Medium (zie recepten en figuur 3F)en nog 5 dagen geïncubeerd. Als alternatief zullen organoïden blijven uitbreiden en vertakken in Growth Medium gedurende ten minste 10 dagen. Organoïden kunnen worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie(figuur 3D-F)of vrijgegeven uit de ECM met behulp van een hersteloplossing (zie Tabel met materialen)en geanalyseerd via andere methoden (bijvoorbeeld immunoblot, RT-qPCR).

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, Santa Cruz. 1. Dag 1: Borstkliervertering Bereid je voor om de MG’s te oogsten van volwassen vrouwelijke muizen van 10-14 weken oud. Voer de oogst uit op een open bank onder aseptische omstandigheden. Steriliseren alle chirurgische benodigdheden, kurk planken, en pinnen door autoclaving en weken in 70% alcohol voor 20 minuten …

Representative Results

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor het onderzoeken van specifieke afstammingsbijdragen van borstepitheelcellen door gebruik te maken van mozaïekorganoïden. Om primaire murinecellen voor organoïden te verkrijgen, moet het epiklierepitheel van de borstklier eerst worden geïsoleerd van de omringende adipocyterijke stroma(figuur 1). Dit proces wordt hier kort beschreven en wordt ook beschreven in een eerder gepubliceerde studie<sup c…

Discussion

Hier wordt een methode gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe onderzoekers 3D-organoïde culturen kunnen genereren met behulp van primaire MG-cellen. Het verschil tussen deze en andere protocollen is dat we een methode om de twee, verschillende MG celcompartimenten te scheiden detail: de buitenste basale MyoECs en innerlijke LECs. Onze methode maakt gebruik van een twee-staps trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die we differentiële trypsinisatienoemen 19. Deze procedure stelt onderzoekers in staa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Ben Abrams voor technische bijstand en kernondersteuning van de University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wij danken Susan Strome en Bill Saxton voor het gebruik van hun Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies aan UCSC van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma (S.R.), van het NIH (NIH GM058903) voor het initiatief voor het maximaliseren van de ontwikkeling van studenten (H.M.) en van de National Science Foundation voor een graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) en door een beurs (A18-0370) van het UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Materials

15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning) Fisher Scientific CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353004
70 µM nylon cell strainer (Corning) Fisher Scientific 08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062 Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
B6 ACTb-EGFP mice The Jackson Laboratory 003291
BD Insulin syringe 0.5 mL Thermo Fisher Scientific 14-826-79
Class 2 Dispase (Roche) Millipore Sigma 4942078001
Class 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004206
Corning Cell Recovery solution Fisher Scientific 354253 Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well Fisher Scientific CLS3471
Dexamethasone Millipore Sigma D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington Biochemical LS002007
Donkey anti-Goat 647 Thermo Fisher Scientific A21447 Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647 Jackson ImmunoResearch 715-606-150 Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Thermo Fisher Scientific 11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-250 Without Mg2+/Ca2+
EGF Fisher Scientific AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum VWR 97068–085 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech) Fisher Scientific 0100-01 Referred to as mounting media in text
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710064
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Goat anti-WAP Santa Cruz Biotech SC-14832 Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342 AnaSpec AS-83218 Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin Millipore Sigma I6634-100mg
KCl Fisher Scientific P217-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
KRT14–CreERtam The Jackson Laboratory 5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL Fisher Scientific CB-40230C Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile Millipore Sigma PEZGS0816 These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA Millipore Sigma A2547 Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502048
NaCl Fisher Scientific S671-3
NaH2PO4 Fisher Scientific S468-500
Nrg1 R&D 5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin National Hormone and Peptide Program Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3
Pentobarbital Millipore Sigma P3761
R26R-EYFP The Jackson Laboratory 6148
Rho inhibitor Y-27632 Tocris 1254
R-spondin Peprotech 120-38
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Triton X-100 Millipore Sigma x100-500ML Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300-062

References

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Play Video

Cite This Article
Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization. J. Vis. Exp. (157), e60742, doi:10.3791/60742 (2020).

View Video