Summary

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

Abstract

בארגון אורגנואידים מציעים מבני רקמה תלת-ממדיים המתארגנים תהליכים פיזיולוגיים בנוחות של מנה. בלוטת החלב מורין מורכבת משני תאים שונים האפיתל תאים, המשרתים פונקציות שונות: החיצוני, תא האפיתל מיוטורי ואת התא הפנימי, הפרשה לומיאל. כאן, אנו מתארים שיטה שבה התאים המרכיבים תאים אלה מבודדים ולאחר מכן משולבים כדי לחקור את התרומה האישית שלהם השושלת כדי בלוטת החלב מורפולגנזה ובידול. השיטה היא פשוטה ויעילה ואינה מצריכה טכנולוגיות הפרדה מתוחכמות כגון מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. במקום זאת, אנו הקציר ו אנזימטי מעכל את הרקמה, הזרע את האפיתל על מנות תרבות הרקמה מחסיד, ולאחר מכן להשתמש טריסיזציה דיפרנציאל הפרדה מיואפיתל מתאי הלומיאלים עם ~ 90% טוהר. התאים מצופים לאחר מכן במטריצה מחלבת שם הם מסדרים לתוך בילדו, תלת מימדי (3D) אורגנואידים כי ניתן לבדיל כדי לייצר חלב לאחר 10 ימים בתרבות. כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות גנטיות, תאים ניתן לקצור מסוג פראי או מהונדסים גנטית מודלים העכבר, או שהם יכולים להיות מניפולציות גנטית לפני התרבות 3D. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור אורגנואידים פסיפס המאפשרים חקירה של הפונקציה גן במיוחד ב הלומיאל או מיואפיתל התא.

Introduction

בלוטת החלב (MG) היא כמו עץ, מבנה האפיתל הצינורי המוטבע בתוך משתית עשיר אדיפוציטוטה. האפיתל הביקטיום כולל שכבת הבסיס החיצונית של כריתת המעטפת, תאי האפיתל (מיואקאס) ושכבה פנימית של לומיאל, תאי אפיתל הפרשה (LECs), המקיף לומן מרכזי1. במהלך ההנקה כאשר החוזה החיצוני מיוקל לסחוט חלב מכתשיים למדעי הפנים, ה-MG עובר שינויים רבים הנמצאים תחת שליטתה של גורמי גדילה (למשל, EGF ו-FGF) והורמונים (למשל פרוגסטרון, אינסולין, ו prolactin). שינויים אלה גורמים לבידול של מבנים מיוחדים, מכתשי, אשר מסנתז ומפרישות חלב במהלך ההנקה1. אפיטאליה של הפטמות יכול להיות מניפולציות בשיטות שבהן שברי רקמת אפיתל, תאים, או אפילו תא בסיס אחד מושתלים לתוך מארח מגיני שומן בחלב, מראש על הפטמות של החלב אנדוסוגני, ומותר לגדול כדי להוות מחדש שלמות, עץ אפיתל פונקציונלי2,3,4,5. השתלת היא טכניקה רבת עוצמה, אבל זה זמן רב ובלתי אפשרי אם תוצאות מוטציה בתוך החיים העובריים המוקדמים (לפני E14) המונע הצלה של שתילת שולחן החלב. יתרה מזאת, חוקרים מבקשים לעתים תכופות לחקור את תפקידם של שני התאים השונים, הנגזרים מתאי השושלת המוגבלים. בעוד טכנולוגיית היצור-לקס מאפשר מניפולציה גנטית דיפרנציאלית של מיויואס ו-LECs, זה גם משימה גוזלת זמן ויקר. לפיכך, מאז שנות החמישים, החוקרים השתמשו באורגנואידים מחוץ לבית הספר כדרך קלה ויעילה יחסית לטיפול בשאלות הנוגעות למבנה רקמת החלב ולתפקוד6,7.

בפרוטוקולים המוקדמים המתארים את הבידוד והתרבות של תאי האפיתל הראשוניים של החלב, החוקרים מצאו כי מטריצת קרום המרתף (BME), מורכב קריש פלזמה והעובר לחלץ עוף, נדרש עבור שברי MG גדל על מנה6. בעשורים הבאים, מטריצות של מסחטות (ecms, קולגן, ו מדוזות חלבון מטריצה מופרש על ידי אנגלברב-הולם-נחיל מורטין בתאי סרקומה) פותחו כדי להקל על תרבות 3d ולחקות טוב יותר בסביבה vivo7,8,9,10. תאים culturing בתוך 3d מטריצות מתגלים על ידי קריטריונים מרובים (מורפולוגיה, ביטוי גנים, ואת התגובה הורמון) כי כזה מיקרוסביבה מודלים טובים יותר vivo תהליכים פיזיולוגיים9,10,11,12. מחקר באמצעות תאים murine העיקרי זיהה גורמי צמיחה מפתח מורפולגנים הדרושים תחזוקה מורחבת והבידול של אורגנואידים13. מחקרים אלה קבעו את הבמה לפרוטוקול המוצג כאן, ולתרבות של תאי השדיים האנושיים כמו אורגנואידים 3D, אשר כיום הוא כלי קליני מודרני, המאפשר גילוי סמים ובדיקות סמים על דגימות החולה14. בסך הכל, אורגנואיד culturing מדגיש את היכולות של הארגון העצמי של התאים הראשוניים ואת תרומתם לורפוגנזה ובידול.

מוצג כאן הוא פרוטוקול מורנין התרבות epithelia שניתן לבדיל לתוך חלב מניב. טכניקת טריסיזציה דיפרנציאלית משמשת כדי לבודד את מיויואס ו-LECs המרכיבים את שני תאי התאים הייחודיים של ה-MG. אלה שברים תא מופרדים יכול לאחר מכן להיות מניפולציות גנטית כדי overexpress או מנוק פונקציה גנטית. מכיוון ששושלת-שושלת, הארגון העצמי הוא נכס מולדת של תאים אפיתל הפטמות15,16,17, שילוב מחדש של שברים אלה תאים מאפשר לחוקרים ליצור בילאיל, מארגני פסיפס. אנו מתחילים לעכל את רקמת השומן, ולאחר מכן מריטת את שברי הפטמות על צלחת תרבות הרקמה במשך 24 שעות (איור 1). שברי הרקמה מתפשרים על פוליסטירן מנות כשברים בvivo בארגון: שכבת מיואפיתל חיצונית המקיפה את שכבות הלומיאל הפנימיות. ארגון הסלולר הזה מאפשר לבידוד של היואקאס החיצוני על ידי טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול ב3-6 דקות ואחריו סיבוב שני של טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול המנתק את הצ הפנימי הנותר (איור 2). לפיכך, סוגי תאים אלה בעלי רגישות טריפסין שונים מבודדים ולאחר מכן יכולים להיות מעורבים ומצופים ב-ECM (איור 3). התאים עוברים ארגון עצמי כדי ליצור כדורים מבהרים, המכילים שכבה חיצונית של החברה הפנימית המקיפה את ה-LECs. היווצרות לומן מתרחשת כאשר התאים גדלים במדיום המכיל קוקטייל של גורמי גדילה (ראה מתכונים עבור צמיחה בינונית)13. לאחר 5 ימים, אורגנואידים יכול להיות מובחנים לייצור חלב על ידי מעבר למדיום מכתשי (לראות מתכונים ואיור 3F) ו מודבטים לעוד 5 ימים. לחילופין, אורגנואידים ימשיך להתרחב ולענף במדיום הצמיחה לפחות 10 ימים. אורגנואידים ניתן לנתח באמצעות immunofluorescence (איור 3D-F) או שוחרר ecm באמצעות פתרון שחזור (ראה טבלת חומרים) וניתח באמצעות שיטות אחרות (למשל, החיסוני, RT-qpcr).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז. 1. יום 1: עיכול בלוטת החלב היכונו למסוק את ה-MGs של עכברים נקבה בוגרת 10-14 שבועות של גיל. לבצע את הקציר על ספסל פתוח תחת תנאים אספטי. לחטא את כל חומרי הניתוח…

Representative Results

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקירת תרומות ספציפיות של שושלת היוחסין בתאי האפיתל של הפטמות על ידי עשיית שימוש באורגנואידים הפסיפס. כדי להשיג תאים murine הראשי עבור אורגנואידים, האפיתל בלוטת החלב צריך להיות הראשון מבודד הadipocyte עשיר המקיף משתית (איור 1). תהלי?…

Discussion

כאן, שיטה מוצגת המפרט כיצד חוקרים יכולים ליצור תרבויות 3D אורגאיד באמצעות תאי MG הראשי. ההבדל בין זה לבין פרוטוקולים אחרים הוא שאנחנו לפרט שיטה להפריד בין שני, ברורים תאים תא מג: מmyoecs הבסיס החיצוני ו LECs הפנימי. השיטה שלנו מעסיקה טריפסין דו-שלבים (0.05%) טיפול שאנו מכנים. טריסינוניזציה משלים<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לבן אברהמס לסיוע טכני ותמיכה ליבה מאוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז (UCSC) המכון לביולוגיה של תאי גזע (IBSC). אנו מודים סוזן Strome ואת ביל סאקטון לשימוש שלהם Solamere ספינינג דיסק מיקרוסקופ Confocal וקד. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענקים ucsc מן המכון הרפואי הווארד יוז באמצעות מלגות ג’יימס ה. גילהם למחקר מתקדם (S.R.), מ nih (nih GM058903) עבור היוזמה למקסם את התפתחות הסטודנטים (בריאות) ומ הקרן הלאומית למדע עבור מלגת מחקר בוגרת (ה1339067) ובמענק מענק (A18-0370) מוועדת התיאום של מחקר הסרטן (LH).

Materials

15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning) Fisher Scientific CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353004
70 µM nylon cell strainer (Corning) Fisher Scientific 08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062 Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
B6 ACTb-EGFP mice The Jackson Laboratory 003291
BD Insulin syringe 0.5 mL Thermo Fisher Scientific 14-826-79
Class 2 Dispase (Roche) Millipore Sigma 4942078001
Class 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004206
Corning Cell Recovery solution Fisher Scientific 354253 Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well Fisher Scientific CLS3471
Dexamethasone Millipore Sigma D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington Biochemical LS002007
Donkey anti-Goat 647 Thermo Fisher Scientific A21447 Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647 Jackson ImmunoResearch 715-606-150 Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Thermo Fisher Scientific 11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-250 Without Mg2+/Ca2+
EGF Fisher Scientific AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum VWR 97068–085 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech) Fisher Scientific 0100-01 Referred to as mounting media in text
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710064
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Goat anti-WAP Santa Cruz Biotech SC-14832 Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342 AnaSpec AS-83218 Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin Millipore Sigma I6634-100mg
KCl Fisher Scientific P217-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
KRT14–CreERtam The Jackson Laboratory 5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL Fisher Scientific CB-40230C Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile Millipore Sigma PEZGS0816 These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA Millipore Sigma A2547 Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502048
NaCl Fisher Scientific S671-3
NaH2PO4 Fisher Scientific S468-500
Nrg1 R&D 5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin National Hormone and Peptide Program Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3
Pentobarbital Millipore Sigma P3761
R26R-EYFP The Jackson Laboratory 6148
Rho inhibitor Y-27632 Tocris 1254
R-spondin Peprotech 120-38
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Triton X-100 Millipore Sigma x100-500ML Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300-062

References

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Play Video

Cite This Article
Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization. J. Vis. Exp. (157), e60742, doi:10.3791/60742 (2020).

View Video