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Behavior

Valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina

doi: 10.3791/60751 Published: June 4, 2020

Summary

Questo articolo presenta procedure sperimentali per valutare i disturbi della memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia, che è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia.

Abstract

La compromissione cognitiva è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia del lobo temporale. Per ricapitolare il declino cognitivo associato all'epilessia associata all'epilessia in un modello animale di epilessia, abbiamo generato topi epilettici cronici trattati con pilocarpina. Presentiamo un protocollo per tre diversi test comportamentali utilizzando questi mouse epilettici: nuova posizione dell'oggetto (NL), nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) e di separazione dei modelli (PS) per valutare rispettivamente l'apprendimento e la memoria per luoghi, oggetti e contesti. Spieghiamo come impostare l'apparato comportamentale e fornire procedure sperimentali per i test NL, NO e PS a seguito di un test sul campo aperto che misura le attività locomotorie basali degli animali. Descriviamo anche i vantaggi tecnici dei test NL, NO e PS rispetto ad altri test comportamentali per la valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici. Infine, discutiamo delle possibili cause e soluzioni per i topi epilettici che non riescono a fare 30 s di buon contatto con gli oggetti durante le sessioni di familiarizzazione, che è un passaggio critico per il successo dei test di memoria. Pertanto, questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come valutare le compromissione di memoria associate all'epilessia utilizzando i topi. I test NL, NO e PS sono semplici, saggi efficienti che sono appropriati per la valutazione di diversi tipi di memoria nei topi epilettici.

Introduction

L'epilessia è un disturbo cronico caratterizzato da convulsioni ricorrenti spontanee1,2,3. Poiché le crisi ripetitive possono causare anomalie strutturali e funzionali nel cervello1,2,3, un'attività convulsiva anomala può contribuire alla disfunzione cognitiva, che è una delle comorbidità associate all'epilessia più comuni4,5,6. Contrariamente agli eventi convulsioni cronici, che sono transitori e momentanei, i disturbi cognitivi possono persistere durante la vita dei pazienti epilettici, deteriorando la loro qualità di vita. Pertanto, è importante comprendere i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia.

Vari modelli animali sperimentali di epilessia sono stati utilizzati per dimostrare i deficit di apprendimento e memoria associati all'epilessia cronica7,8,9,,10,11,12. Ad esempio, il labirinto d'acqua Morris, il condizionamento contestuale della paura, la posizione degli oggetti (NL) e i nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) sono stati spesso utilizzati per valutare la disfunzione della memoria nell'epilessia del lobo temporale (TLE). Poiché l'ippocampo è una delle regioni primarie in cui il TLE mostra patologia, i test comportamentali che possono valutare la funzione di memoria dipendente dall'ippocampo sono spesso selezionati preferibilmente. Tuttavia, dato che le convulsioni possono indurre neurogenesi ippocampale aberrante e contribuire al declino cognitivo associato all'epilessia10, i paradigmi comportamentali per testare la funzione neuronale neonatale (cioè, la separazione del modello spaziale,PS) 8,13 possono anche fornire informazioni preziose sui meccanismi cellulari delle compromissione della memoria nell'epilessia.

In questo articolo, dimostriamo una batteria di test di memoria, NL, NO, e PS, per topi epilettici. I test sono semplici e facilmente accessibili e non richiedono un sistema sofisticato.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università Cattolica della Corea e sono state eseguite in conformità con i National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications N. 80-23).

1. Test di posizione dell'oggetto nuovo (NL)

  1. Preparare i topi epilettici C57BL/6 o transgenici 4–6 settimane dopo l'iniezione di pilocarpina.
    NOTA: Le crisi acutati sono state indotte dall'iniezione di pilocarpina intraperitoneale (IP), seguendo il protocollo descritto nel nostro precedente rapporto14.
  2. Trasferire i topi epilettici dalla sala di riproduzione alla sala dei comportamenti un giorno prima dell'inizio dei test comportamentali. Lasciare che i topi si abittano per almeno 12 h durante la notte.
  3. Nella sala dei comportamenti, separare i singoli topi in nuove gabbie per alloggiamento singolo. Scrivere le informazioni per ogni animale sulla scheda gabbia e tenere gli animali nelle stesse gabbie durante i test comportamentali. Più gabbie possono essere trasferite simultaneamente utilizzando un carrello.
  4. Il giorno successivo, inizia 3 giorni di sessioni di assuefazione (H1-H3) al mattino presto. Acclimatare gli animali alla luce bassa nelle loro gabbie di casa per almeno 30 min.
  5. Preparare una casella di campo aperta con dimensioni esterne di 44 x 44 x 31 cm e dimensioni interne di dimensioni 43 x 43 x 30,5 cm. Il giorno 1 dell'assuefazione (H1), posizionare un illuminometro al centro della scatola di campo aperto e regolare l'illuminazione a 60 lux.
  6. Spruzzare il pavimento e le pareti della scatola aperta con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere possibili spunti olfattivi. Quindi attendere almeno 1 min fino a quando l'alcol residuo si è asciugato completamente.
  7. Valutare l'attività locomotoria di ogni mouse eseguendo un test sul campo aperto.
    1. Per registrare e monitorare il comportamento di ogni mouse sperimentale, utilizzare il software di monitoraggio video del comportamento animale (vedere Tabella dei materiali).
    2. Una volta aperto il software di tracciamento video, calibrare le dimensioni della scatola del campo aperto. Quindi, impostare la zona per il rilevamento. Imposta 3 s di latenza e 15 min di tempo di acquisizione per evitare di tracciare le mani di uno sperimentatore. Inserire le informazioni su ogni topo sperimentale (gruppo, sesso, età, ecc.).
    3. Quindi, posizionare delicatamente un mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete. Fare questo posizionandolo sul coperchio della gabbia per ridurre al minimo lo stress e l'ansia associati alla movimentazione. Quindi, rilasciare il mouse vicino al muro della casella di campo aperto che è il più lontano da dove gli oggetti saranno durante la sessione di familiarizzazione (passaggio 1.9.3.).
      NOTA: Una volta che il mouse è nella casella del campo aperto, il software di monitoraggio del mouse lo rileverà automaticamente e avvierà la registrazione. Per un tracciamento ottimale dell'esplorazione, la telecamera può essere posizionata direttamente sopra la casella di campo aperta.
    4. Dopo 15 min di registrazione, riportare l'animale nella sua gabbia di casa posizionandolo sul coperchio della gabbia. Pulire la scatola a campo aperto con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito tra una prova e l'altra. Ripristinare la luce intensa e misurare la distanza totale dell'animale spostato utilizzando il software di monitoraggio video secondo le istruzioni del produttore.
      1. Aprire il software di tracciamento video e le clip video. Quindi, fare clic su Analisi per calcolare la distanza totale spostata in base alla calibrazione delle dimensioni della casella del campo aperto.
  8. Il giorno 2 e il giorno 3, eseguire le sessioni di assuefazione (H2, H3) ripetendo i passaggi da 1.3 a 1.7.
  9. Il giorno 4, eseguire la sessione di familiarizzazione (F1).
    1. Nella luce fioca, posizionare ogni mouse nel campo aperto vuoto per 3 min. Dopo quella breve riavversione, riporta l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare due oggetti identici (bambole di gomma, oggetto A) nell'arena campo aperto 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperto, di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuovere il mouse dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
    5. Dopo che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
  10. Il giorno 5, eseguire la sessione di test NL.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area aperta del campo per una riassenza di 3 min. Quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Sposta un oggetto (bambola di gomma, oggetto A) nella posizione diagonale, a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare l'oggetto con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia nell'area aperta del campo e posizionarlo di fronte alla parete della scatola aperta.
      NOTA: controbilanciare la posizione dell'oggetto spostato per ridurre qualsiasi potenziale preferenza innata per una determinata direzione. Ad esempio, modificare la posizione dell'oggetto preferito dalla sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e, per il resto degli animali, spostare l'oggetto meno preferito dalla sessione di familiarizzazione.
    4. Consenti 10 min di esplorazione gratuita e registra con un sistema di tracciamento video. Misurare il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcolare il rapporto di discriminazione come
      Equation 1
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    5. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa. Per 3 giorni (giorni 6-8), lasciate riposare il mouse con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
    6. Una volta che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta.

2. Nuovo test di riconoscimento degli oggetti (NO)

  1. Il giorno 9, eseguire una sessione di assuefazione di 15 min ripetendo i passaggi da 1,2 a 1,7.
  2. Il giorno 10, eseguire la sessione di familiarizzazione (F1).
    1. Nella luce fioca, posizionare il mouse nel campo aperto vuoto per 3 min. Dopo aver abituato il mouse all'area aperta del campo, riportarlo temporaneamente nella sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo ad asciugare completamente.
    3. Collocare due oggetti identici (50 mL di tubi di plastica riempiti con 40 mL d'acqua, oggetto B) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Poiché l'animale è esposto ai due oggetti diversi (tubo di plastica da 50 mL riempito con 40 mL d'acqua, oggetto B; vaso di vetro Coplin, oggetto C) nel test NO, controbilancia l'oggetto durante la sessione di F1. Ad esempio, presentare due oggetti identici (barattoli di vetro Coplin, oggetto C) per la metà degli animali del gruppo.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
    6. Dopo che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
  3. Il giorno successivo (giorno 11), eseguire la sessione di test NO.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa al campo aperto per una riabitoriera per 3 min, e quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Sostituire un oggetto (50 mL di plastica riempito con 40 mL di acqua, oggetto B) con un altro oggetto (vaso di vetro Coplin, oggetto C) a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia sul campo aperto e posizionarlo di fronte alla parete. Controbilanciare gli oggetti presentati insieme durante il test NO. Ad esempio, sostituire un barattolo coplin di vetro (oggetto C) con un tubo di plastica da 50 mL riempito con 40 mL di acqua (oggetto B) per i topi esposti ai due vasi di vetro Coplin (oggetto C) durante la sessione di familiarizzazione.
      NOTA: È anche possibile eseguire il controbilanciamento della posizione dell'oggetto sostituito per ridurre la potenziale preferenza innata per una determinata direzione. Ad esempio, per ogni coorte di animali esposti all'insieme di due oggetti (oggetto B o oggetto C), modificare l'oggetto preferito nella sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e per il resto degli animali sostituire l'oggetto meno preferito nella sessione di familiarizzazione.
    4. Consentire 10 min di esplorazione gratuita e registrarlo utilizzando un sistema di tracciamento video. Misura il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcola il rapporto di discriminazione.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    5. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa. Per 3 giorni (giorni 12-14), lasciate riposare il mouse con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
    6. Una volta che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola di campo aperto con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta.

3. Test di separazione dei motivi (PS)

  1. Il giorno 15, eseguire la prima sessione di familiarizzazione (F1) per il test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e poi restituirlo alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra del pavimento (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con l'ampia griglia (5,5 x 5,5 cm) nella scatola di campo aperta e posizionare due oggetti identici (t-flasks in plastica riempiti con 50 mL di acqua, oggetto D) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Poiché l'animale è esposto a due oggetti diversi (t-flask in plastica riempito con 50 mL di acqua, oggetto D; bottiglia di vetro, oggetto E) nel test PS, controbilancia l'oggetto durante le sessioni F1 e F2. Ad esempio, presentare due oggetti identici (bottiglie di vetro, oggetto E) sul pavimento a griglia larga per metà degli animali del gruppo.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso nell'esplorazione di entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione totale (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Dopo il completamento della prima sessione di familiarizzazione (F1), pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con 70% spray etanolo e rimuoverli dalla scatola aperta campo.
  2. Il giorno successivo (giorno 16), eseguire la seconda sessione di familiarizzazione (F2) per il test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra del pavimento (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la griglia stretta (2,75 x 2,75 cm) nella scatola del campo aperto e posizionare due oggetti identici (bottiglie di vetro, oggetto E) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Per controbilanciare, presentare due oggetti identici (t-flasks in plastica riempiti con 50 mL di acqua, oggetto D) sul pavimento griglia stretto.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione totale (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione F2 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Dopo il completamento della seconda sessione di familiarizzazione (F2), pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con 70% spray etanolo e rimuoverli dalla scatola aperta campo.
  3. Il giorno successivo (giorno 17), eseguire la sessione di test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e poi restituirlo alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra con la griglia stretta (2,75 x 2,75 cm) nella scatola di campo aperta e posizionare due oggetti diversi (t-flask di plastica riempito con 50 mL di acqua, oggetto D; bottiglia di vetro, oggetto E) sulla piastra del pavimento a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia nell'area aperta del campo e posizionarlo di fronte alla parete.
    4. Controbilanciare gli oggetti presentati insieme durante il test PS. Ad esempio, posizionare ogni oggetto (oggetto D, oggetto E) sul pavimento della griglia stretto per rendere l'oggetto E un oggetto nuovo in questo contesto. Controbilanciare la posizione dell'oggetto D o dell'oggetto E (un nuovo oggetto sul modello a pavimento stretto) può anche essere eseguito per ridurre il potenziale di una preferenza innata per una certa direzione. Ad esempio, sostituire l'oggetto preferito dalla seconda sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e per il resto degli animali, sostituire l'oggetto meno preferito dalla seconda sessione di familiarizzazione.
    5. Consentire 10 min di esplorazione gratuita e registrare utilizzando un sistema di tracciamento video. Misura il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcola il rapporto di discriminazione.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa.

4. Colorazione viola Cresyl

  1. Dopo aver completato tutti i test comportamentali, anestesizzare l'animale iniettando un cocktail (4:0.5) di ketamina (50 mg/mL) e xylazina (23,3 mg/mL) sciolta in salina a una dose di 110 mL/kg di peso corporeo (IP; 1 mL di siringa). Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di una risposta a un pizzico di punta.
  2. Una volta che l'animale è profondamente anetizzato, eseguire perfusione transcardiale con 4% paraformaldeide per fissare il cervello15.
  3. Dopo che la perfusione transcardiale è terminata, decapitare l'animale con un paio di forbici15. Quindi, rimuovere il cranio utilizzando un paio di forbici iride per esporre il cervello. Dopo che il cervello è isolato, suffisso in 4% paraformaldeide durante la notte, seguito da crioprotezione nel 30% di saccarosio in 0,01 M di salina tampone di fosfato.
  4. Fare sezioni coronali (30 m) dal cervello snap-congelato utilizzando un criostato.
  5. Montare i tessuti cerebrali sui vetrini ed eseguire una serie di passaggi di idratazione dal 100% di etanolo all'acqua del rubinetto lavando per 3 min in sequenza nel 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanolo.
  6. Incubare i vetrini di tessuto in soluzione di callina cresila 0.1% per 15 min.
  7. Rimuovere la colorazione eccessiva immergendo i vetrini dei tessuti nel 95% di etanolo/0,1% di acido acetico glaciale, quindi disidratare i tessuti con soluzioni di 100% etanolo, 50% di etanolo/50% xilene e 100% xilene.
  8. Coverslip i vetrini del tessuto utilizzando un supporto di montaggio xilene disponibile in commercio.

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Representative Results

Nella figura 1è illustrato un programma sperimentale generale e la configurazione per la valutazione della funzione cognitiva. Sei settimane dopo l'introduzione di crisi acute indotta da pilocarpina, i topi sono stati sottoposti ai test NL, NO e PS in ordine separato da periodi di riposo di 3 giorni tra i test (Figura 1A). Per il test NL, due oggetti identici sono stati inseriti nel campo aperto durante la sessione di familiarizzazione (F1) e il giorno successivo, un oggetto è stato spostato in una nuova posizione. Nel test NO, un oggetto è stato sostituito con uno nuovo durante la sessione di test. Per il test PS, le due sessioni di familiarizzazione (F1, F2) hanno introdotto combinazioni di diversi modelli e oggetti della griglia del pavimento. Quindi, il giorno del test, un oggetto da ogni sessione di familiarizzazione è stato posizionato sullo stretto modello di pavimento della griglia, rendendo un romanzo di oggetto nel contesto del modello di pavimento a griglia stretto (Figura 1B). La scatola aperta può essere posizionata su una scrivania direttamente sotto una fotocamera del dispositivo accoppiata a carica e circondata da una tenda nera per evitare inutili segnali visivi (Figura 2A). Gli oggetti campione erano facili da pulire materiali di dimensioni simili o leggermente più grandi di un mouse (Figura 2B). Le combinazioni di oggetti dovevano essere preselezionate per confermare che non vi era alcuna preferenza significativa tra i due oggetti presentati insieme (Figura 2C). Le piastre del pavimento con modelli diversi sono state collocate nella scatola aperta per fornire ulteriori segnali sperimentali nel test PS (Figura 2B). Una volta che un mouse è stato introdotto nella casella del campo aperto, un sistema di tracciamento video ha tracciato la sua traiettoria per analizzare la sua distanza totale di locomozione (Figura 2D). Sei settimane dopo un'iniezione di pilocarpina, i topi epilettici hanno mostrato una significativa riduzione del rapporto di discriminazione nel test NL, dimostrando un compromissione della memoria spaziale (Figura 3). Inoltre, nel test NO, che è un test per la memoria di riconoscimento degli oggetti, i topi epilettici hanno mostrato una funzione di memoria compromessa rispetto ai controlli fittizi. Quando la funzione neuronale neonatale dentata è stata valutata con il test PS, i topi epilettici hanno avuto difficoltà a riconoscere il nuovo oggetto in un contesto con più segnali. Come esperimenti di controllo, attività locomotoria e latenza per raggiungere i criteri di esplorazione durante la sessione di familiarizzazione sono stati valutati (Figura 3). La misurazione dell'attività locomotoria ha mostrato un aumento significativo degli animali epilettici (Figura 3C), in linea con i rapporti precedenti16,17, mentre la motivazione per esplorare gli oggetti era paragonabile tra gli animali farsi e gli animali epilettici (Figura 3D). I nostri tassi di abbandono dei criteri di esplorazione nella sessione di familiarizzazione sono stati del 17,4%, del 18,2%, dello 0% rispettivamente per il test NL, NO e PS, suggerendo che gli animali si sono abituati agli ambienti sperimentali durante la serie di prove comportamentali. Infine, abbiamo valutato la morte delle cellule ippocampali dopo l'epilepticus dello stato indotto dalla pilocarpina usando la colorazione viola cresila per confermare danni neuronali indotti dalle vulsivule (Figura 4). Gli animali trattati con pilocarpina hanno dimostrato cellule piknotiche nell'hilus e nel sottocampo CA3 dell'ippocampo, a differenza dei controlli fittizi (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Presentazione schematica della batteria di prova comportamentale. (A) Disegno schematico dell'abaco comportamentale per la nuova posizione dell'oggetto (NL), il nuovo riconoscimento degli oggetti (NO) e i test di separazione dei modelli (PS) per i topi sham ed epilettici. (B) Immagini rappresentative delle disposizioni relative agli oggetti e alle targhe per i test NL, NO e PS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Apparato comportamentale per la valutazione della funzione cognitiva. (A) Una panoramica generale dell'impostazione comportamentale. Una telecamera è stata posizionata direttamente sopra la scatola aperta, che era circondata dalla tenda per evitare segnali inutili. (B) Oggetti di esempio per la nuova posizione dell'oggetto (NL), il nuovo test di riconoscimento degli oggetti (NO) e di separazione dei motivi (PS). Per il test PS, una piastra da pavimento con modelli diversi, cioè griglie larghe e strette, è stata inserita nella scatola di campo aperto per fornire segnali aggiuntivi. (C) Grafici che mostrano il tempo di esplorazione di ogni oggetto presentato insieme durante la sessione di test NO e PS (n - 7), rispettivamente. Si noti che non vi era alcuna differenza significativa nella preferenza tra i due oggetti valutati dal test Mann-Whitney U (per nessun test) e il test t non accoppiato dello Studente (per il test PS). (D) Immagine che mostra che un sistema di tracciamento video ha rilevato il mouse sperimentale nella casella aperta del campo. Il quadrato rosso indica la zona preimpostata per tracciare la traiettoria del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Compromissione della memoria spaziale e separazione dei modelli nei topi epilettici. (A) Presentazione schematica della nuova posizione dell'oggetto (NL), del nuovo riconoscimento degli oggetti (NO) e dei test di separazione dei motivi (PS). Un nuovo oggetto è indicato come un cerchio rosso. (B) Grafici che mostrano il rapporto di discriminazione nei test NL, NO e PS tra i topi nHam (n ) e quelli epilettici (n - 10). Si noti che i topi epilettici hanno dimostrato compromissione significativa nei test NL, NO e PS, che testano la funzione della memoria rispettivamente per luoghi, oggetti e contesti. Test Mann-Whitney U per il test NL di .p < 0,05. p;0.05 dal test t non accoppiato di Student per i test NO. p; 0.05 dal test t non accoppiato di Student con la correzione di Welch per il test PS. (C) Un grafico che mostra l'attività locomotoria di farsa (n ) e topi epilettici (n - 10). Si noti che i topi epilettici hanno dimostrato una maggiore locomozione, in linea con i rapporti precedenti. p;0.05 dal test t non accoppiato di Student. (D) Grafici che mostrano la latenza a criteri 30 s nella sessione di familiarizzazione dei test NL, NO e PS. Si noti che non c'erano differenze nella motivazione per esplorare gli oggetti tra tosa (n - 8) e topi epilettici (n - 10). I dati sono presentati come errore medio di media (SEM). SE - stato epilettico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Morte neuronale nell'ippocampo dopo l'epilepticus dello stato indotto dalla pilocarpina (SE). Immagini rappresentative dei gruppi epilettici (A) e(B)58 giorni dopo l'iniezione di pilocarpina. Le immagini ingrandite mostrano l'hilus (a, d), il sottocampo CA1 (b, e) e il sottocampo CA3 (c, f) dell'ippocampo, indicati come quadrati bianchi nelle immagini con basso ingrandimento. Notare le cellule piknotiche nell'hilus e nel sottocampo CA3 dell'ippocampo. Barra della scala nell'immagine all'estrema sinistra di 200 m, valida anche per l'immagine inferiore; barra della scala in un, b, c , 40 m, valido anche per d, e, f, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo lavoro descrive le procedure sperimentali per valutare la funzione cognitiva nei topi con epilessia cronica. Molti diversi paradigmi di test comportamentali vengono utilizzati per valutare le funzioni di apprendimento e memoria nei topi18. Il labirinto dell'acqua Morris, il labirinto del braccio radiale, il labirinto Y, il condizionamento contestuale della paura e i test basati su oggetti sono i test comportamentali più utilizzati e forniscono risultati affidabili. Tra questi, i test NL, NO e PS sono metodi efficienti e semplici per valutare l'apprendimento e la memoria nei topi epilettici8,10. Poiché i topi epilettici possono avere convulsioni spontanee inaspettate durante le sessioni di comportamento, è meglio usare test comportamentali basati sull'inclinazione naturale degli animali per esplorare la novità senza aggiungere altri rinforzi positivi o negativi, come quelli utilizzati in compiti motivati da prevenzione come il condizionamento della paura, la mite fame o il nuoto forzato a rimanere a galla, che possono innescare convulsioni ricorrenti19,20. Inoltre, rispetto ad altri test comportamentali, i test basati sulla novità sono meno stressanti per gli animali perché non sono necessarie lunghe sessioni di formazione. Inoltre, i test comportamentali basati sulla novità possono essere facilmente modificati per valutare diversi tipi di memoria (ad esempio, memoria spaziale, memoria di riconoscimento o memoria episodica) semplicemente modificando la posizione dell'oggetto, presentando un nuovo oggetto o combinando stimoli aggiuntivi. Nel loro insieme, test basati su novità come i test NL, NO e PS hanno vantaggi versatili per la valutazione delle funzioni cognitive nei topi epilettici.

Anche se i test NL, NO e PS sono modelli sperimentali rapidi e utili per studiare l'apprendimento e la funzione di memoria nei topi epilettici, diversi fattori devono essere considerati quando li si utilizza. È risaputo che i topi epilettici cronici mostrano un'ansia intensificata dalle iniezioni di pilocarpina7, portando ad una marcata diminuzione dell'esplorazione degli oggetti durante le sessioni di familiarizzazione. Questa mancanza di esplorazione può causare un'errata interpretazione dei risultati del test. Pertanto, è importante includere sufficiente assuefazione al campo aperto per i topi per abituarsi all'ambiente prima della sessione di familiarizzazione. A seconda dei ceppi, i topi possono ancora non riuscire a esplorare gli oggetti per 30 s entro i 20 min della sessione di familiarizzazione, anche dopo 3 sessioni di assuefazione. In tal caso, l'aggiunta di un'altra sessione di assuefazione con coppie extra di oggetti nella casella di campo aperto potrebbe contribuire a ridurre l'ansia del mouse verso gli oggetti. Le tende che circondano la scatola di campo aperto possono ridurre al minimo i segnali esterni della stanza, consentendo ai topi sperimentali di concentrarsi sugli oggetti nel campo aperto. Inoltre, i criteri di esplorazione devono essere sufficientemente rigorosi da escludere i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio sedersi sull'oggetto, passare accanto all'oggetto o appoggiarsi con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto. Infine, anche se può essere molto raro, eventi di sequestro possono verificarsi durante le attività comportamentali. In questo caso, si raccomanda che tali animali vengano rimossi da ulteriori valutazioni in quanto questa può essere una possibile fonte di distorsione confusa per la valutazione della funzione di memoria.

Poiché i test NL, NO e PS sono esperimenti molto sensibili che si basano sulla naturale curiosità degli animali per nuovi stimoli, sottili cambiamenti possono influenzare il comportamento esplorativo dei topi, con conseguenti rapporti di discriminazione inconcludenti21,22. Ad esempio, la gestione rigida del topo, un cambiamento di biancheria da letto proprio prima dei compiti comportamentali, tempi incoerenti del test e acclimatamento insufficiente alla sala prove possono tutti elevare i livelli di stress degli animali, causando risultati equivoci dei test. Inoltre, gli ambienti di test alterati, come presentazioni incoerenti di oggetti asimmetrici ad ogni sessione, il posizionamento di gabbie domestiche vicino all'arena sperimentale o la commutazione della firma olfattiva dello sperimentatore devono essere attentamente considerati per evitare ulteriori fattori. Nella fase dell'analisi dei dati, le valutazioni effettuate da più sperimentatori possono contribuire ad aumentare le variabili nei risultati comportamentali a causa di diversi criteri di comportamenti esplorativi dei roditori o degli usi dei cronometri. Collettivamente, questi aspetti dovrebbero anche essere tenuti a mente per la corretta implementazione dei test NL, NO e PS.

L'ippocampo e la regione paraippocampale sono noti per svolgere ruoli unici nell'elaborazione della memoria23,24. È ampiamente accettato che la memoria spaziale dipenda in gran parte dalla funzione dell'ippocampo, che può essere facilmente valutata dal test NL23,24. D'altra parte, la memoria di riconoscimento degli oggetti sembra coinvolgere più regioni del cervello, tra cui la corteccia perireninale, la corteccia insulare e la corteccia prefrontale ventromata, oltre all'ippocampo25,26,27,28,29,30,31,32,33 , 34,,35,36,37,38.34 I topi epilettici trattati con pilocarpina hanno costantemente dimostrato disturbi comportamentali nei test della memoria spaziale con ingenti danni neuronali ippocampali39,40, 41,41,42, mentre i test di memoria di riconoscimento degli oggetti hanno prodotto risultati controversi, con degenerazione neuronale variabile nelle regioni cerebrali paraippocampali10,41,42,43,44.44 Questi dati implicano che il riconoscimento degli oggetti potrebbe richiedere connessioni di rete sofisticate tra più regioni del cervello, a differenza della memoria spaziale in cui l'ippocampo può svolgere un ruolo centrale. Quando i sottocampi ippocampali specifici sono attentamente valutati, le regioni del giro CA1 e CA3/dentato vengono trovate per elaborare informazioni diverse. In particolare, si ritiene che i neuroni CA1 siano attivati per esposizione a oggetti simili, mentre CA3 e il giro dentato sono coinvolti nella discriminazione di oggetti simili23,45. Coerentemente con questa ipotesi, prove emergenti suggeriscono che i neuroni neonati dentati possono contribuire alle prestazioni di separazione dei modelli45,46,47. Dato che la neurogenesi dell'ippocampo aberrante può essere indotta durante l'epilettica10, i topi epilettici possono dimostrare prestazioni compromesse in esperienze analoghe discriminanti a causa dell'integrazione interrotta dei neuroni neonatali nell'epilessia cronica.

In conclusione, descriviamo come valutare i disturbi della memoria nei topi epilettici. In particolare, forniamo protocolli sperimentali per tre test comportamentali, i test NL, NO e PS, che testano la memoria per luoghi, oggetti e contesti, rispettivamente. Tra i molti paradigmi di test cognitivi disponibili per i topi, i test NL, NO e PS sono abbastanza semplici, brevi saggi che sottolineano minimamente gli animali, il che li rende ottimali per valutare la funzione di memoria negli animali epilettici senza innescare crisi ricorrenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il dottor Jae-Min Lee per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A0000167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

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References

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Valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina
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Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).More

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

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