Channelrhodopsin-assisterad krets kartläggning (CRACM) är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neuronala prognoser mellan anatomiskt och / eller genetiskt identifierade grupper av nervceller. Här beskriver vi hur man använder CRACM för att kartlägga auditiva hjärnstammen anslutningar, inklusive användning av en rödskiftad opsin, ChrimsonR.
Vid undersökning av neurala kretsar, en standard begränsning av in vitro patch klämma strategi är att axoner från flera källor ofta blandas, vilket gör det svårt att isolera ingångar från enskilda källor med elektrisk stimulering. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM), denna begränsning kan nu övervinnas. Här rapporterar vi en metod för att använda CRACM för att kartlägga stigande ingångar från lägre auditiva hjärnstammen kärnor och commissural ingångar till en identifierad klass av nervceller i sämre colliculus (IC), midbrain kärnan i hörselsystemet. I IC, lokala, commissural, stigande och fallande axons är starkt sammanflätade och därför omöjlig att skilja med elektrisk stimulering. Genom att injicera en viral konstruktion för att driva uttryck för en channelrhodopsin i en presynaptisk kärna, följt av patch klämma inspelning för att karakterisera närvaro och fysiologi channelrhodopsin-uttrycker synaptiska ingångar, prognoser från en viss källa till en specifik population av IC nervceller kan mappas med cell typ-specifik noggrannhet. Vi visar att detta tillvägagångssätt fungerar med både Chronos, en blå ljusaktiverad channelrhodopsin, och ChrimsonR, en rödskiftad channelrhodopsin. I motsats till tidigare rapporter från förhjärnan, finner vi att ChrimsonR är robust smugglas ner axons av dorsal cochlear kärnan huvudsakliga nervceller, vilket tyder på att ChrimsonR kan vara ett användbart verktyg för CRACM experiment i hjärnstammen. Protokollet som presenteras här innehåller detaljerade beskrivningar av intrakraniell virusinjektionskirurgi, inklusive stereotaxic koordinater för inriktning injektioner till dorsala cochlear kärnan och IC av möss, och hur man kombinerar hela cell patch klämma inspelning med channelrhodopsin aktivering för att undersöka långväga prognoser till IC nervceller. Även om detta protokoll är skräddarsytt för att karakterisera auditiva ingångar till IC, kan det enkelt anpassas för att undersöka andra långväga prognoser i hörselhjärnstammen och därefter.
Synaptiska anslutningar är kritiska till neural kretsfunktion, men den exakta topologi och fysiologi synapser inom neurala kretsar är ofta svåra att sondera experimentellt. Detta beror på att elektrisk stimulering, det traditionella verktyget för cellulär elektrofysiologi, urskillningslöst aktiverar axoner nära stimuleringsplatsen, och i de flesta hjärnregioner, axoner från olika källor (lokala, stigande och/eller fallande) intertwine. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM)1,2, denna begränsning kan nu övervinnas3. Channelrhodopsin (ChR2) är en ljusaktiverad, katjon-selektiv jonkanal som ursprungligen hittades i den gröna alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveras med blått ljus av en våglängd runt 450-490 nm, depolarisera cellen genom katjontillströmningen. ChR2 beskrevs först och uttrycktes i Xenopus äggceller av Nagel och kollegor4. Kort därefter uttryckte Boyden och kollegor5 ChR2 i däggdjursnervceller och visade att de kunde använda ljuspulser för att på ett tillförlitligt sätt kontrollera spikning på en millisekundstidsskala, vilket inducerar åtgärdspotentialerna ~ 10 ms efter aktivering av ChR2 med blått ljus. Optogenetiska kanaler med ännu snabbare kinetik har hittats nyligen (t.ex. Chronos6).
Den grundläggande metoden för en CRACM experiment är att transfect en population av förmodade presynaptiska nervceller med en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) som bär den genetiska informationen för en channelrhodopsin. Transfection av nervceller med rAAV leder till uttrycket av den kodade channelrhodopsin. Typiskt är channelrhodopsin märkt med ett fluorescerande protein som GFP (Green Fluorescerande protein) eller tdTomato (ett rött fluorescerande protein), så att transfection av nervceller i målregionen lätt kan bekräftas med fluorescens avbildning. Eftersom rAAVs är icke-patogena, har en låg inflammatorisk potential och långvariga genuttryck7,8, de har blivit en standard teknik för att leverera channelrhodopsins till nervceller. Om, efter transfection av en förmodade presynaptic befolkningen av nervceller, aktivering av en channelrhodopsin genom ljusblinkar framkallar postsynaptiska potentialer eller strömmar i målet nervceller, Detta är ett bevis på en axonal anslutning från den transfected kärnan till den inspelade cellen. Eftersom avhuggna axoner i hjärnan skiva experiment kan drivas att släppa signalsubstansen genom channelrhodopsin aktivering, nuclei som ligger utanför den akuta skiva men skicka axoner i postsynaptic hjärnan regionen kan identifieras med CRACM. Kraften i denna teknik är att anslutningen och fysiologiidentifierade långväga synaptiska ingångar kan undersökas direkt.
Förutom channelrhodopsins som är retliga av blått ljus, utredare har nyligen identifierat flera rödskiftade channelrhodopsins9,10, inklusive Chrimson och dess snabbare analoga ChrimsonR, som båda är glada med rött ljus på ~ 660 nm6. Rödskiftade opsins är av intresse eftersom rött ljus tränger in vävnad bättre än blått ljus, och rött ljus kan ha en lägre cytotoxicitet än blått ljus10,11,12. Rödskiftade channelrhodopsins öppnar också upp möjligheten till dubbla färg CRACM experiment, där konvergensen av axoner från olika kärnor på samma neuron kan testas i ett experiment6,13,14. Men nuvarande rödskiftade opsins uppvisar ofta oönskadkorsaktivering med blått ljus15,16,17, vilket gör två färgexperiment svåra. Dessutom har vissa rapporter visat att ChrimsonR genomgår begränsad axonal handel, vilket kan göra det svårt att använda ChrimsonR för CRACM experiment16,17.
Nästan alla stigande prognoser från den lägre auditiva hjärnstammen kärnor konvergerar i sämre colliculus (IC), midbrain navet i den centrala auditiva vägen. Detta inkluderar projektioner från cochlear kärnan (CN)18,19, de flesta av de överlägsna olivary komplex (SOC)20, och dorsala (DNLL) och ventral (VNLL) kärnor av laterala lemniscus21. Dessutom avslutas en stor fallande projektion från hörselbarken i IC18,19,20,21,22, och IC nervceller själva synapse i stort sett inom den lokala och kontralaterala lober ic ic23. Den sammanblandning av axoner från många källor har gjort det svårt att sondera IC kretsar med elektrisk stimulering24. Som ett resultat, även om nervceller i IC utföra utrop viktigt för ljudlokalisering och identifiering av tal och annan kommunikation ljud25,26, organisationen av neurala kretsar i IC är i stort sett okänd. Vi identifierade nyligen VIP-nervceller som den första molekylärt identifierbara neuron klassen i IC27. VIP nervceller är glutamaterga stellate nervceller som projektet till flera långväga mål, inklusive auditiva talamus och överlägsen colliculus. Vi kan nu bestämma källorna och funktionen hos lokala och långväga ingångar till VIP-nervceller och för att avgöra hur dessa kretsanslutningar bidrar till ljudbehandling.
Protokollet som presenteras här är skräddarsytt för att undersöka synaptiska ingångar till VIP-nervceller i IC av möss, särskilt från den kontralaterala IC och DCN(figur 1). Protokollet kan enkelt anpassas till olika källor till input, en annan neuron typ eller en annan hjärnregion helt och hållet. Vi visar också att ChrimsonR är en effektiv rödskiftad channelrhodopsin för långväga krets kartläggning i hörselhjärnstammen. Vi visar dock att ChrimsonR är starkt aktiverad av blått ljus, även vid låga intensiteter, och därmed för att kombinera ChrimsonR med Chronos i tvåfärgade CRACM-experiment, måste noggranna kontroller användas för att förhindra korsaktivering av ChrimsonR.
Vi har funnit att CRACM är en kraftfull teknik för att identifiera och karakterisera långväga synaptiska ingångar till nervceller i musen IC. Efter protokollet som beskrivs här uppnådde vi robust transfection av nervceller i DCN och IC samt tillförlitlig axonal handel med Chronos och ChrimsonR till synaptiska terminaler i IC. Dessutom visade vi att denna teknik möjliggör mätning och analys av postsynaptiska händelser, inklusive PSP amplitud, halvbredd, förfall tid, och receptor farmakologi. Vår erfarenhet t…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, till GD) och National Institutes of Health bevilja R56 DC016880 (MTR).
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
Fixed stage microscope | any | n/a | |
Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
Heating pad | Custom build | N/A | |
Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
Standard chemicals | local vendors | N/A | |
standard imaging solutions | |||
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
Temperature controller | Custom build | N/A | |
Vibratome | any | n/a | |
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
Water bath | any | n/a |