Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging (CRACM) er en presisjonsteknikk for funksjonell kartlegging av langtrekkende nevronale projeksjoner mellom anatomisk og/ eller genetisk identifiserte grupper av nevroner. Her beskriver vi hvordan du bruker CRACM til å kartlegge auditive hjernestammeforbindelser, inkludert bruk av en rød-shifted opsin, ChrimsonR.
Når du undersøker nevrale kretser, er en standard begrensning av in vitro patch clamp tilnærming at aksoner fra flere kilder er ofte blandet, noe som gjør det vanskelig å isolere innganger fra individuelle kilder med elektrisk stimulering. Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM), kan denne begrensningen nå overvinnes. Her rapporterer vi en metode for å bruke CRACM til å kartlegge stigende innganger fra nedre auditive hjernestammekjerner og kommissærinnganger til en identifisert klasse av nevroner i den dårligere colliculus (IC), midthjernen kjernen i hørselssystemet. I IC, lokale, commissural, stigende, og synkende aksoner er tungt sammenvevd og derfor umulig å skille med elektrisk stimulering. Ved å injisere en viral konstruksjon for å drive uttrykk for en channelrhodopsin i en presynaptisk kjerne, etterfulgt av patch clamp opptak for å karakterisere tilstedeværelse og fysiologi av channelrhodopsin-uttrykkende synaptiske innganger, projeksjoner fra en bestemt kilde til en bestemt populasjon av IC-nevroner kan kartlegges med celletypespesifikk nøyaktighet. Vi viser at denne tilnærmingen fungerer med både Chronos, en blå lysaktivert channelrhodopsin og ChrimsonR, en rød-shifted channelrhodopsin. I motsetning til tidligere rapporter fra forhjernen, finner vi at ChrimsonR er robust smuglet ned aksonene av dorsal cochleakjerne kjerne hovednevroner, noe som indikerer at ChrimsonR kan være et nyttig verktøy for CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen som presenteres her inneholder detaljerte beskrivelser av intrakraniell virusinjeksjonskirurgi, inkludert stereotaxic koordinater for målretting av injeksjoner til dorsal cochleakjerne og IC av mus, og hvordan du kombinerer hele celle patch clamp opptak med channelrhodopsin aktivering for å undersøke langsiktige projeksjoner til IC nevroner. Selv om denne protokollen er skreddersydd for å karakterisere auditive innganger til IC, kan den enkelt tilpasses for å undersøke andre langdistanseprojeksjoner i den hørbare hjernestammen og utover.
Synaptiske forbindelser er avgjørende for neural kretsfunksjon, men den nøyaktige topologien og fysiologien til synapser innenfor nevrale kretser er ofte vanskelige å sondere eksperimentelt. Dette skyldes at elektrisk stimulering, det tradisjonelle verktøyet for cellulær elektrofysiologi, ukritisk aktiverer aksoner i nærheten av stimuleringsstedet, og i de fleste hjerneregioner henger aksoner fra forskjellige kilder (lokalt, stigende og/eller synkende). Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM)1,2, kan denne begrensningen nåovervinnes 3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktivert, kation-selektiv ion kanal opprinnelig funnet i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres av blått lys av en bølgelengde rundt 450-490 nm, depolarisere cellen gjennom kation tilstrømning. ChR2 ble først beskrevet og uttrykt i Xenopus oocytes av Nagel og kolleger4. Kort tid etter det uttrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrnevroner og viste at de kunne bruke lyspulser til pålitelig kontroll på en millisekund tidsskala, induserehandlingspotensialer ~ 10 ms etter aktivering av ChR2 med blått lys. Optogenetiske kanaler med enda raskere kinetikk har blitt funnet nylig (f.eks. Chronos6).
Den grunnleggende tilnærmingen til et CRACM-eksperiment er å transfect en populasjon av antatte presynaptiske nevroner med en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som bærer genetisk informasjon for en channelrhodopsin. Transfection av nevroner med rAAV fører til uttrykk for kodet channelrhodopsin. Vanligvis er channelrhodopsin merket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescent Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), slik at transfection av nevroner i målområdet lett kan bekreftes med fluorescensavbildning. Fordi rAAVs er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potensial og langvarig genuttrykk7,8, har de blitt en standard teknikk for å levere channelrhodopsins til nevroner. Hvis aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysblinker, etter transfeksjon av en antatt presynaptisk populasjon av nevroner, fremkaller aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysglimt postsynaptiske potensialer eller strømmer i målnevronene, dette er bevis på en aksonal forbindelse fra den transinfiserte kjernen til den registrerte cellen. Fordi avskårne aksoner i hjerneskiveeksperimenter kan bli drevet til å frigjøre nevrotransmitter gjennom channelrhodopsin aktivering, kjerner som ligger utenfor den akutte skive, men sende aksoner inn i postsynaptic hjerneregionen kan identifiseres med CRACM. Kraften i denne teknikken er at tilkobling og fysiologi av identifiserte langrekkevidde synaptiske innganger kan undersøkes direkte.
I tillegg til channelrhodopsins som er spennende av blått lys, etterforskere har nylig identifisert flere rød-shifted channelrhodopsins9,10, inkludert Chrimson og dens raskere analogchrimsonR, som begge er begeistret med rødt lys av ~ 660 nm6. Rød-forskjøvet opsiner er av interesse fordi rødt lys trenger vev bedre enn blått lys, og rødt lys kan ha en lavere cytotoksisitet enn blått lys10,11,12. Rød-forskjøvet channelrhodopsins også åpne opp muligheten for dual farge CRACM eksperimenter, hvor konvergens av aksoner fra forskjellige kjerner på samme nevron kan testes i ett eksperiment6,13,14. Imidlertid viser dagens rød-forskjøvet opsins ofte uønsket kryssaktivering med blått lys15,16,17, noe som gjør to fargeeksperimenter vanskelig. I tillegg har noen rapporter indikert at ChrimsonR gjennomgår begrenset aksonal handel, noe som kan gjøre det utfordrende å bruke ChrimsonR for CRACM eksperimenter16,17.
Nesten alle stigende projeksjoner fra de lavere auditive hjernestammene konvergerer i den dårligere colliculus (IC), midbrain-knutepunktet til den sentrale auditive veien. Dette inkluderer projeksjoner fra cochleakjernen (CN)18,19, det meste av det overlegne olivary-komplekset (SOC)20,og dorsal (DNLL) og ventrale (VNLL) kjerner av lateral lemniscus21. I tillegg avsluttes en stor synkende projeksjon fra den hørbare cortex i IC18,19,20,21,22, og IC nevroner selv synapse bredt innenfor de lokale og kontralaterale fliker av IC23. Innheking av aksoner fra mange kilder har gjort det vanskelig å sondere IC-kretser ved hjelp av elektrisk stimulering24. Som et resultat, selv om nevroner i IC utføre beregninger viktig for god lokalisering og identifisering av tale og andre kommunikasjonslyder25,26, organiseringen av nevrale kretser i IC er i stor grad ukjent. Vi har nylig identifisert VIP nevroner som den første molekylært identifiserbare nevron klassen i IC27. VIP nevroner er glutamatergic stellate nevroner som projiserer til flere langdistanse mål, inkludert auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nå i stand til å bestemme kildene og funksjonen til lokale og langdistanse innganger til VIP-nevroner og for å finne ut hvordan disse kretsforbindelsene bidrar til lydbehandling.
Protokollen som presenteres her er skreddersydd for å undersøke synaptiske innganger til VIP-nevroner i IC av mus, spesielt fra kontralateral IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan enkelt tilpasses ulike inngangskilder, en annen nevrontype eller en annen hjerneregion helt. Vi viser også at ChrimsonR er en effektiv rød-shifted channelrhodopsin for lang rekkevidde krets kartlegging i den auditive hjernestammen. Vi viser imidlertid at ChrimsonR er sterkt aktivert av blått lys, selv ved lave intensiteter, og dermed å kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farge CRACM eksperimenter, må forsiktige kontroller brukes for å hindre kryssaktivering av ChrimsonR.
Vi har funnet ut at CRACM er en kraftig teknikk for å identifisere og karakterisere synaptiske innganger i lang rekkevidde til nevroner i musen IC. Etter protokollen som er beskrevet her, oppnådde vi robust transfection av nevroner i DCN og IC, samt pålitelig aksonal handel av Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. I tillegg viste vi at denne teknikken muliggjør måling og analyse av postsynaptiske hendelser, inkludert PSP amplitude, halfwidth, forfalltid og reseptorfarmakologi. Vår erfaring tyder på …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, prosjektnummer 401540516, til DG) og National Institutes of Health stipend R56 DC016880 (MTR).
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
Fixed stage microscope | any | n/a | |
Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
Heating pad | Custom build | N/A | |
Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
Standard chemicals | local vendors | N/A | |
standard imaging solutions | |||
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
Temperature controller | Custom build | N/A | |
Vibratome | any | n/a | |
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
Water bath | any | n/a |