Summary
Channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) anatomik ve / veya genetik olarak tanımlanan nöron grupları arasında uzun menzilli nöronal projeksiyonlar fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapı bağlantılarını haritalamak için CRACM'nin nasıl kullanılacağını anlatıyoruz, buna kırmızı-shifted opsin, ChrimsonR'ın kullanımı da dahil.
Abstract
Nöral devreleri araştırırken, in vitro yama kıskaç yaklaşımının standart bir sınırlaması, birden fazla kaynaktan gelen aksonlar genellikle birbirine karışmak, elektrikstimülasyon ile bireysel kaynaklardan girişleri izole etmek zor hale olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) kullanılarak, bu sınırlama artık aşılabilir. Burada, düşük işitsel beyin sapı çekirdekleri ve komiser girişleri artan girdileri alt kolikulus (IC), işitsel sistemin orta beyin çekirdeği nöronların tanımlanmış bir sınıfa haritalamak için CRACM kullanmak için bir yöntem rapor. IC'de, lokal, komiser, yükselen ve azalan aksonlar yoğun bir şekilde iç içe geçmiştir ve bu nedenle elektriksel uyarılma ile ayırt edilemez. Bir presinaptik çekirdekte bir kanaloidofin ekspresyonu sürücü için viral bir yapı enjekte ederek, kanalrhodopsin ifade sinaptik girdilerin varlığı ve fizyolojisi karakterize etmek için yama kıskaç kaydı takip, belirli bir kaynaktan projeksiyonlar IC nöronların belirli bir nüfusa hücre tipine özgü doğruluk ile eşlenebilir. Bu yaklaşımın hem Mavi ışıkla aktive edilmiş channelrhodopsin chronos, hem de kırmızı vitesli bir channelrhodopsin olan ChrimsonR ile çalıştığını gösteriyoruz. Ön beyin önceki raporların aksine, biz ChrimsonR sağlam dorsal koklear çekirdek çekirdek nöronlar aksonları aşağı ticareti olduğunu bulmak, ChrimsonR beyin sapı CRACM deneyler için yararlı bir araç olabileceğini gösteren. Burada sunulan protokol, dorsal koklear çekirdeğive farelerin IC enjeksiyonlarını hedeflemek için stereotaksik koordinatlar da dahil olmak üzere intrakranial virüs enjeksiyon cerrahisinin ayrıntılı açıklamalarını ve tüm hücre yama kıskaç kaydının nasıl birleştirileceğini içerir. IC nöronlar için uzun menzilli projeksiyonlar araştırmak için channelrhodopsin aktivasyonu ile. Bu protokol, işitsel girdileri IC'ye göre karakterize etmek için tasarlanmış olsa da, işitsel beyin sapı ve ötesindeki diğer uzun menzilli projeksiyonları araştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Sinaptik bağlantılar nöral devre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak nöral devreler içindeki sinapsların hassas topolojisi ve fizyolojisini deneysel olarak araştırmak genellikle zordur. Bunun nedeni, hücresel elektrofizyolojinin geleneksel aracı olan elektriksel stimülasyonun, stimülasyon bölgesine yakın aksonların gelişigüzel aktive edilmesidir ve çoğu beyin bölgesinde, farklı kaynaklardan (lokal, yükselen ve/veya azalan) aksonların iç içe geçmiş olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM)1,2kullanarak, bu sınırlama şimdi3aşılabilir . Channelrhodopsin (ChR2) bir ışık aktive, katyon seçici iyon kanalı aslında yeşil yosun Chlamydomonas reinhardtiibulundu. ChR2 450-490 nm civarında bir dalga boyu mavi ışık ile aktive edilebilir, katyon akını ile hücre depolarize. ChR2 ilk açıklanan ve Nagel ve meslektaşları tarafından Xenopus oositler ifade4. Bundan kısa bir süre sonra, Boyden ve meslektaşları5 memeli nöronlarda ChR2 ifade ve güvenilir bir milisaniye zaman ölçeğinde spiking kontrol etmek için ışık darbeleri kullanabilirsiniz gösterdi, mavi ışık ile ChR2 aktivasyonu ndan sonra eylem potansiyelleri ~ 10 ms indükleyen. Son zamanlarda daha hızlı kinetik içeren optogenetik kanallar bulunmuştur (örneğin, Chronos6).
Bir CRACM deneyiçin temel yaklaşım bir konfotik adeno-ilişkili virüs (rAAV) bir channelrhodopsin için genetik bilgi taşıyan putatif presinaptik nöronlar bir nüfus transfect etmektir. RAAV ile nöronların transfeksiyon kodlanmış channelrhodopsin ekspresyonuna yol açar. Tipik olarak, channelrhodopsin GFP gibi bir floresan protein ile etiketlenir (Yeşil Floresan Protein) veya tdTomato (kırmızı floresan protein), böylece hedef bölgede nöronların transfeksiyon kolayca floresan görüntüleme ile teyit edilebilir. RAAVs non-patojenik olduğundan, düşük inflamatuar potansiyeli ve uzun ömürlü gen ekspresyonuvar 7,8, onlar nöronlara channelrhodopsins sunmak için standart bir teknik haline gelmiştir. Eğer, nöronların putatif presinaptik popülasyontransfeksiyon sonra, ışık yanıp söner yoluyla bir channelrhodopsin aktivasyonu mesaj yofetik potansiyelleri veya hedef nöronlarda akımlar ortaya çıkarır, Bu transfected çekirdekten kaydedilmiş hücreye aksonal bağlantı kanıtıdır. Beyin dilimi deneylerinde kopmuş aksonları channelrhodopsin aktivasyonu yoluyla nörotransmitter serbest bırakmak için tahrik edilebilir çünkü, akut dilim dışında yalan ama postsinaptik beyin bölgesine akson göndermek çekirdekleri CRACM ile tespit edilebilir. Bu tekniğin gücü, tanımlanan uzun menzilli sinaptik girdilerin bağlantısı ve fizyolojisinin doğrudan araştırılabildiğidir.
Mavi ışık tarafından heyecanlı olan kanaloidofinler ek olarak, araştırmacılar son zamanlarda birkaç kırmızı kaydırılmış channelrhodopsins tespit var9,10, Chrimson ve daha hızlı analog ChrimsonR dahil, her ikisi de ~ 660 nm6kırmızı ışık ile heyecanlıyız . Kırmızı ışık mavi ışık daha iyi doku nüfuz çünkü kırmızı kaydırılmış opsins ilgi vardır, ve kırmızı ışık mavi ışık10daha düşük bir sitotoksisite olabilir10 ,11,12. Kırmızı-shifted channelrhodopsins da aynı nöron üzerinde farklı çekirdeklerden aksonların yakınsama bir deneydetest edilebilir çift renkli CRACM deneyleri, olasılığını açmak 6,13,14. Ancak, mevcut kırmızı-shifted opsins genellikle mavi ışık 15 ile istenmeyen çapraz aktivasyonsergilemek 15,16,17, iki renk deneyleri zor hale. Buna ek olarak, bazı raporlar ChrimsonR sınırlı aksonal ticareti uğrar göstermiştir, hangi CRACM deneyleri için ChrimsonR kullanmak zor yapabilirsiniz16,17.
Alt işitsel beyin sapı çekirdeklerinden gelen neredeyse tüm yükselen projeksiyonlar, merkezi işitsel yolun orta beyin merkezi olan alt koliulusta (IC) yakınlaşır. Bu koklear çekirdeğin projeksiyonları içerir (CN)18,19, üstün olilik kompleksi en (SOC)20, ve dorsal (DNLL) ve ventral (VNLL) lateral lemniscus çekirdekleri21. Ayrıca, işitsel korteksten büyük bir azalan projeksiyon IC sona erer18,19,20,21,22, ve IC nöronlar kendilerini ic yerel ve kontralateral loblar içinde geniş sinaps23. Birçok kaynaktan aksonların içiçe olması, ic devrelerinin elektriksel stimülasyon kullanılarak sondalanmasını zorlaştırmıştır24. Sonuç olarak, IC nöronlar ses lokalizasyonu ve konuşma ve diğer iletişim sesleri nin belirlenmesi için önemli hesaplamalar gerçekleştirmek rağmen25,26, IC nöral devrelerin organizasyonu büyük ölçüde bilinmemektedir. Yakın zamanda IC27'dekiilk moleküler olarak tanımlanabilir nöron sınıfı olarak VIP nöronları tanımladık. VIP nöronlar, işitsel talamus ve üstün kolikulus da dahil olmak üzere birçok uzun menzilli hedefe proje glutamaterjik stellat nöronlardır. Artık VIP nöronlara yerel ve uzun menzilli girdilerin kaynaklarını ve işlevini ve bu devre bağlantılarının ses işlemeye nasıl katkıda bulunduğunu belirleyebiliyoruz.
Burada sunulan protokol, özellikle kontralateral IC ve DCN'den(Şekil 1)farelerin IC'sindeki VIP nöronlara sinaptik girdilerin araştırılması için uyarlanmıştır . Protokol kolayca giriş farklı kaynaklara adapte edilebilir, farklı bir nöron tipi veya tamamen farklı bir beyin bölgesi. Ayrıca ChrimsonR'ın işitsel beyin sapında uzun menzilli devre haritalaması için etkili bir kırmızı kaydırmalı kanalrhodopsin olduğunu da gösteriyoruz. Ancak, ChrimsonR güçlü mavi ışık tarafından aktive olduğunu göstermektedir, düşük yoğunluklarda bile, ve böylece, iki renkli CRACM deneylerde Chronos ile ChrimsonR birleştirmek için, dikkatli kontroller ChrimsonR çapraz aktivasyonu önlemek için kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) onay alın ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yla ilgili NIH yönergelerine uyun. Bu protokoldeki tüm prosedürler Michigan IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Cerrahi Preparatlar
- Aseptik koşullarda ameliyatlar yapın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araç ve gereçleri otoklav/sterilize edin. Ameliyat için ameliyat elbisesi ve maske giyin.
- Ameliyat alanını dezenfekte edin (%70 etanol ile püskürtün ve silin) ve ameliyat alanını kapsayacak şekilde steril havlu perdeleri yerleştirin.
- Kurtarma kafesini hazırlayın. Boğulma riskini sınırlamak için kafes yataklarını çıkarın. Kafesin altına Bir ısıtma yastığı koyun. Bir gıda ve su kaynağı sağlayın.
- Bir pipet çekmece üzerinde nanoenjektör için bir cam kılcal çekin. Çekme işlemi sırasında ısıtma filamentinin yoğun ısısı cam kılcal damarı sterilize edecektir. Çapı yaklaşık 5 μm'lik bir açıklık elde etmek için ucu kesin veya kırın.
- Doku penetrasyonunu artırmak ve tıkanmayı azaltmak için kılcal ucu yaklaşık 30° açıya doğru bevel. Kapilleri mineral yağla doldurun ve nanolitre enjektöre yerleştirin.
- İstediğin kanalrhodopsin kodlama rAAV bir aliquot elde ve steril PBS kullanarak istenilen titretin seyreltmek.
NOT: Serotip 1 rAAV'ların işitsel beyin sapı çekirdeklerinin transfeksiyonunda iyi çalıştığını bulduk. Özellikle, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (mavi ışık la aktive edilmiş channelrhodopsin) ve rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (kırmızı-shifted channelrhodopsin), hangi kamuya açık depove vektör çekirdekleri mevcuttur, sürekli yüksek ifade düzeyleri ve iyi uzun menzilli aksonal kaçakçılık channelrhopsins CRACM deneyler için gerekli verim. - Steril PBS'de ön dolgu kılcal damarı için enjektör talimatlarına 1-3 μL rAAV uygulayın.
2. Cerrahi
- Bir indüksiyon odasına hayvan koyun ve kalibre isofluran buharlaştırıcı ile teslim oksijen% 3 izofluran ile anestezi neden. Nefes derin ve yavaş ve bir ayak tutam refleks yok olana kadar fare gözlemleyin, yaklaşık 3-5 dk.
- Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye aktarın. Ağzını gaz anestezi maskesi ile bir damak barına koyarak ve her iki kulak kanalına delik siz kulak çubuklarını yerleştirerek hayvanın başını sabitleyin.
- Bir rektal sıcaklık probu takın ve homeostatik sıcaklık kontrol cihazını açın.
- Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
- Preemptive analjezik uygulayın (örneğin, deri altı enjeksiyon 5 mg/kg karprofen).
- Anestezi durumuna göre isoflurane'yi %1-2,5'e ayarlayın. İşlem sırasında mukozanın sıcaklığını, solunumu ve rengini en az 15 dakikada bir takip edin.
- Elektrikli makasile kafa derisini tıraş edin. Aseptik povidon-iyot ve% 70 etanol üç alternatif swabs ile kafa derisi hazırlamak.
- Kulaklar arasında başlayan ve gözlere devam rostral orta hat boyunca kafa derisi bir kesi olun, lambda ve bregma dikişleri açığa. Cildi yana doğru itin ve gerekirse açıktaki kemikten periostalını çıkarın.
- Lambda sütür'ü steril bir cerrahi belirteçle işaretleyin, nanoenjektörün ucunu sadece lambda'ya dokunsa ve mikromanipülatör koordinatlarını sıfırla. Lambda ve bregma dikişleri arasındaki yükseklik farkını ölçmek için nanoenjektör ucu ve mikromanipülatör kullanın. ± 100 μm yükseklik farkı içinde lambda ve bregma getirmek için damak çubuğu yüksekliği ayarlayın.
- Nanoenjektör ucu ve mikromanipülatör koordinat sistemini kullanarak enjeksiyon bölgesini haritalayın ve bölgeyi steril bir cerrahi belirteçle işaretleyin. P21-P30 farelerinin IC veya DCN'ine enjekte etmek için Tablo 1'degösterildiği gibi lambda sütüre göre koordinatlar kullanın. Koordinatlarımızdaki Z derinliğinin lambda'daki kafatası yüzeyinden ölçüldüğüne dikkat edin.
- Enjeksiyon bölgesi üzerinde kraniyotomi yapmak için steril 0,5 mm matkap çapaklı bir mikromotor matkap kullanın.
- Hedef çekirdekteki nöronların geniş transfeksiyonunu sağlamak için, dokuya çeşitli derinliklerde enjeksiyonlar yapın(Tablo 1, Z koordinatları) ve IC gibi daha büyük beyin bölgeleri söz konusu olduğunda, farklı X ve Y koordinatlarında iki veya daha fazla penetrasyon sırasında enjeksiyonlar yapın(Tablo 1, Sağ IC penetrasyon 1 ve Sağ IC penetrasyonu 2).
- İğne yap. IC enjeksiyonları için, 2.250 μm ile 1750 m derinlik arasında Z ekseni (enjeksiyon derinliği) boyunca 250 μm aralıklarla 20 nL virüs yatırın. DCN enjeksiyonları için, sırasıyla 4.750 μm ve 4.550 μm derinlikte 20 nL virüs yatırın.
- Her Z koordinatına enjeksiyondan sonra enjektörü bir sonraki Z koordinatına taşımadan önce 2-3 dk bekleyin. Bu, virüsün enjeksiyon bölgesinden uzaklaşması için zaman sağlayacak ve nanoenjektör yeniden konumlandırıldığında virüsün enjeksiyon bölgesine çekilme olasılığını azaltacaktır.
- Bir penetrasyon son enjeksiyondan sonra, beyinden nanoenjektör çekmeden önce 3-5 dk bekleyin.
- Nanoenjektör, penetrasyonlar arasında ve hayvanlar arasında beyinden çıkarıldığında, ucun tıkanıp tıkanmadığını kontrol etmek için uçtan küçük bir miktarda virüs çıkar.
- Enjeksiyonlardan sonra, kafa derisinin kesilmiş kenarlarını ısladıktan sonra cildi yavaşça orta hatta doğru hareket ettirmek için steril PBS kullanın. 6-0 (0,7 metrik) naylon dikişler kullanarak basit kesilmiş dikişler ile yara kapatın.
- Yaraya 0.5-1 mL %2 lidokain jel uygulayın.
- Kulak çubuklarını ve sıcaklık sondasını çıkarın, izofluran'ı kapatın, fareyi damak çubuğundan çıkarın ve kurtarma kafesine aktarın.
- Kurtarmayı yakından izleyin. Bir kez hayvan tamamen uyanık, hareket, ve ağrı veya sıkıntı hiçbir belirti gösteren, onun kafes içine geri aktarın ve vivarium kafes dönmek.
- Ameliyatlar bir gün içinde birden fazla hayvan üzerinde yapılacaksa, bir sonraki ameliyattan önce ameliyat aletlerini dezenfekte etmek ve çapak delmek için sıcak boncuk sterilizatörü kullanın.
3. Cerrahi Takip
- Hayvanların her gün yara kapanması, enfeksiyon veya önümüzdeki 10 gün boyunca ağrı veya sıkıntı belirtileri olup olmadığını kontrol edin ve kurumun hayvan bakım kurallarına uyun.
- Kanaloidofinlerin en iyi şekilde ifade edilebilmesi için deneylerde hayvanları kullanmadan önce 3-4 hafta bekleyin.
4. Beyin Dilimi Hazırlama ve Enjeksiyon Hedef Onayı
- CRACM için, burada kısaca açıklanan standart in vitro elektrofizyoloji deneylerinde transfected hayvanlardan akut olarak hazırlanmış beyin dilimleri kullanın (daha ayrıntılı bir açıklama için Goyer ve ark. 2019'a bakın27).
- Hazırlayın yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) içeren (mM): 125 NaCl, 12.5 D-glukoz, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 CaCl2, 1 MgSO4. Kabarcık ACSF% 95 O2%5 CO2 ile 7,4 pH için .
- İn vitro elektrofizyoloji dahil olmak üzere, kanaloidofinlerin aktivasyonunu sınırlamak için karanlığa yakın veya kırmızı ışıkta aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.
- Derinden izoflurane ile fare anestezik ve hızlı bir şekilde decapitate. ~ 34 °C ACSF'de beyni hızlı bir şekilde inceleyin.
- ~34 °C ACSF'de IC'yi içeren koronal dilimleri (200-250 μm) titreşen bir mikrotomla kesin ve dilimleri 34 °C'de 30 dakika boyunca ACSF ile dolu bir tutma odasında %95 O2'de%5 CO2 ile kabardı. Kuluçkadan sonra, kayıtları için kullanılana kadar dilimleri oda sıcaklığında saklayın.
- Enjeksiyon hedefi IC değilse, enjekte edilen beyin bölgesinin ek koronal dilimlerini kesin ve floresan mikroskop altında hedef çekirdeğin transfeksiyonunu kontrol edin. Hedef çekirdekte transfeksiyon veya farklı beyin bölgelerinde ek transfeksiyon yoksa, denemeye devam etmeyin.
5. In Vitro Kayıt ve CRACM Deney
NOT: Chronos ve ChrimsonR'ın optik stimülasyonunu sağlamak için mikroskobun epifloresans portuna göre LED'ler kullanıyoruz. Ancak LED yerine lazerler kullanılabilir. Lazer kullanıyorsanız, kurumsal güvenlik yetkililerinden önceden onay alın ve güvenli lazer kullanımı için uygun yönergeleri uygulayın.
- Borosilikat camdan elektrotları 3,5-4,5 MΩ direncine çekin. Elektrot iç çözeltisi içermelidir (mM): 115 K-glukonat, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfokreatin, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, %0.1 biyositin (w/v), pH 7.3'e ayarlanan KOH ve osmolalite ile 290 mOsm/kg sakkaroz.
- Kayıtları yapmak için standart yama kelepçesi yöntemlerini kullanın. Dilimi sabit bir sahne dik mikroskobu altında bir kayıt odasına yerleştirin ve ~2 mL/dk. Sıcaklıklara (~34-36 °C) yakın bir zamanda ACSF ile sürekli olarak nüfuz edin.
- Uygun bir yama kelepçeamplifikatör kullanarak görsel kontrol altında yama nöronlar. Seri direnci, pipet kapasitansi ve sıvı bağlantı potansiyeli için doğru.
- Tüm hücre kayıtları sırasında, ticari olarak kullanılabilen LED'ler aracılığıyla 580 nm ışıktan oluşan kısa darbeler ile 470 nm ışık veya ChrimsonR'dan oluşan kısa darbeler (1-5 ms) sağlayarak Chronos'u etkinleştirin. Opsin aktivasyon eşiğini belirleyin ve postsinaptik potansiyelleri ortaya çıkarmak için minimal stimülasyon protokolü kullanın. Genel olarak, PSP ortaya çıkarır kısa uyarıcı süresi kullanın ve PSPs ortaya çıkarmak için gerekli eşik gücü% 120 optik güç ayarlayın.
- Membran potansiyelinde kaydedilen değişikliklerin gerçekten nörona sinaptik girdiler olduğunu doğrulamak için, uyarıcı / inhibitör postsinaptik reseptörleri için standart antagonistler deney sırasında yıkanabilir. PSP'ye (örneğin NMDA vs AMPA reseptörleri) farklı reseptör katkılarını araştırmak için uygun reseptör antagonistleri yıkanabilir. Her reseptör antagonist için, ilaç etkileri yıkama sonra ters etmelidir.
- Akrobasin ifade eden sinapsların araya giren bir şekilde aktivasyonunun aksine, ışıkla aktive edilen sinaptik girişlerin kayıtlı nöron üzerindeki sinapsların doğrudan optik aktivasyonundan kaynaklandığını doğrulamak için PSP'lerin gecikmesini, gerginliğini ve güvenilirliğini kullanın. kaydedilen nöron üzerinde sinaps nöron. Genel olarak düşük gecikme (<2 ms), düşük titreme (<1 ms standart gecikme sapması) ve yüksek güvenilirlik (>%50) kaydedilen nörona presinaptik nöron ifade channelrhodopsin doğrudan bir sinaptik bağlantı gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz VIP-IRES-Cre fareler geçti(Viptm1(cre)Zjh/ J) ve Ai14 Cre-muhabir fareler (B6). Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) hangi VIP nöronlar floresan protein tdTomato ifade F1 yavruları oluşturmak için. Her iki cinsiyetin F1 yavruları, doğum sonrası gün (P) 21-P70 yaş olarak kullanıldı. Bu çalışmada toplam 22 hayvan kullanılmıştır.
AAV1 stereotaksik enjeksiyon. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH VIP-IRES-Cre x Ai14 farelerin sağ IC içine Tablo 1 gösterilen koordinatları kullanarak doğru IC güçlü Chronos-EGFP ifade sonuçlandı (Şekil 2A). Chronos-EGFP floresansının görsel incelemesi, sağ IC'de etiketlenmiş somataların çoğunun IC'nin (ICc) merkezi çekirdeğinde bulunduğunu, ancak etiketli somataların bazen IC'nin (ICd) dorsal korteksinde ve bazen de IC'nin (IClc) lateral korteksinde bulunduğunu göstermiştir. Hedeflenen olmayan bölgelerde ki kanaloidopinlerin ekspresyonu yanlış pozitif sonuçlara yol açabileceğinden, transfeksiyonun hedeflemesi ve kapsamı bir deneyde kullanılan her hayvan için kontrol edilmelidir. Chronos daha geniş veya daha sınırlı ifade elde etmek için, yatırılan virüs miktarı yanı sıra stereotaksik koordinatları kolayca istenilen sonucu elde etmek için ayarlanabilir.
AAV1 stereotaksik enjeksiyon. VIP-IRES-Cre x Ai14 farelerinin DCN içine Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH(Tablo 1koordinatlarına bakınız) DCN nöronların güçlü transfeksiyonu ile sonuçlandı ( Şekil 2B). DCN'nin seçici transfeksiyonunu doğrulamak için, her hayvanın beyin sapı EGFP ifadesinin mevcut olduğunu ve DCN ile sınırlı olduğunu doğrulamak için dilimlenmelidir. Transfeksiyon yoksa veya işitsel sinir veya VCN'de önemli miktarda EGFP ekspresyonu varsa, kayıtlar yapılmamalıdır. Toplam enjeksiyon hacmi 40 nL olan Tablo 1'de gösterilen koordinatlar kullanılarak Chronos-EGFP ifadesi çoğu durumda DCN ile sınırlı olacaktır. EGFP etiketli aksonlar hem IC hem de DCN enjeksiyon bölgeleri için enjeksiyondan 3 hafta sonra sol (kontralateral) ICc'de mevcuttu(Şekil 2A sağ, 2B sağ).
ChrimsonR, AAV1'in uzun menzilli ticaretini test etmek için. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH, Chronos enjeksiyonları ile aynı koordinatları kullanarak VIP-IRES-Cre x Ai14 farelerin sağ DCN içine enjekte edildi. ChrimsonR enjeksiyonu DCN güçlü ifade yol açtı, tdTomato floresan hücreleri ve liflerde görülebilir(Şekil 3A). Kontralateral ICc'de, tdTomato ile güçlü bir şekilde etiketlenmiş lifler 3 hafta sonra açıkça görülebiliyordu ve işitsel beyin çekirdeği çekirdeklerine enjekte edildiğinde ChrimsonR-tdTomato yapısının uzun menzilli insan ticareti yeteneğini gösterdiler (Şekil 3B). ChrimsonR optik aktivasyonu IC VIP nöronlarda EPSS ortaya(Şekil 3C),ChrimsonR uzun menzilli CRACM deneyleri için yararlı bir araç olduğunu gösteren deneysel parametreler mavi ışık yerine kırmızı ışık kullanımını talep. Ancak, ChrimsonR'nin mavi ışıkla kolayca aktive edildiğini ve Chronos ile aynı mavi ışık aktivasyonu eşiğini gösterdiğini gördük (Şekil 4). ChrimsonR'nin mavi ışığa karşı hassasiyeti, aynıhayvan13'teChrimsonR veya Chronos ile aktarılan girdileri ayırt etmek için özel dikkat edilmesi gerektiği anlamına gelir.
Sağ IC'ye yapılan enjeksiyonlardan sonra kontralateral (sol) ICc'deki VIP nöronlara kayıtları hedef alırken, mavi ışık yanıp söner ve uyarıcı postsinaptik potansiyeller (EPS) veya inhibitör postsinaptik potansiyeller (IPSP) ortaya çıkar. Bu VIP nöronlar için komiser projeksiyonları doğrular. Kptp ve IPSP'leri ayrı ayrı analiz etmek için, EPSKayıtları sırasında IPSP'leri engellemek için reseptör antagonistleri kullandık, ya da tam tersi. CRACM deneyleri sırasında kaydedilen temsilci EPS ve IPSP'ler Şekil 5'tegösterilmiştir. Test edilen 12 ICc VIP nöronun 6'sında IPSP ler gözlendi. IPSP'ler küçüktü (1.53 mV ± 0.96 mV) ve orta derecede kinetik vardı. IPSP'lerin %10 - %90 yükselme süreleri 7.8 ms ± 2.1 ms, yarım genişlikleri 15.1 ms ± 6.8 ms ve çürüme süresi sabitleri 32.4 ms ± 17.0 ms idi(Şekil 5A, sol). IPSP'ler GABAA reseptörleri tarafından aracılık edildi, onlar tarafından bloke edildi 5 μM gabazine, bir GABAA reseptör antagonisti(Şekil 5A, sağ; n = 6). Test edilen 27 ICc VIP nöronun 11'inde EPS gözlendi. EPS'ler de küçüktü (1.52 mV ± 1.08 mV) ve orta derecede kinetik vardı. EPPS'lerin %10 - %90 yükselme süreleri 8.3 ms ± 4.3 ms, yarım genişlikleri 19.6 ms ± 7.6 ms ve çürüme süresi 43.5 ms ± 16.8 ms idi (Şekil 5B "Kontrol"). EPS AMPA ve NMDA reseptörleri aracılık edildi. Bir NMDA reseptör antagonisti olan 50 μM D-AP5 uygulaması, azaltılmış EPSP yarım genişliği (14.3 ms ± 4.7 ms, p = 0.006) ve yükseliş süresini azaltmaya doğru eğilimli (6.3 ms ± 1.6 ms, p = 0.09), bozunma süresi sabiti (30.6 ms ± 7.3 ms, p = 0.06 ms) ve EPSP genliği (1.38 ± 0.33 mV, p = 0.105; Tukey post-hoc testi ile tekrarlanan ölçümler için ANOVA). Bir AMPA reseptör antagonisi olan 10 μM NBQX uygulaması EPSP'nin geri kalanını bloke etti (Şekil 5B "+ AP5 & NBQX").
DCN enjeksiyonları sonrası sol ICc VIP nöron kayıtları mavi ışık yanıp söner tarafından uyarılmış EPS saptandı, IC VIP nöronlar DCN sinaptik girişleri doğrulayan. DCN CRACM deneyleri spontan IPSP'leri engellemek için banyoda GABAerjik ve gliserinlik blokerlerle yapılmıştır. Test edilen 25 nöronun 19'unda 2-5 ms'lik mavi ışık darbelerinin ePS'lerden kaynakgösterildiğini bulduk. Işık uyarılmış EPS'lerin orta genlikleri (2,85 mV ± 2,98 mV) ve nispeten yavaş yükselme süreleri (4,2 ms ± 1,3 ms), yarım genişlikleri (20,6 ms ± 14,4 ms) ve bozunma süresi sabitleri (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 hücre, veri gösterilmedi).
Chronos veya ChrimsonR aktivasyonu tarafından uyarılan tüm PSP'ler ya hep ya hiç bir şekilde ortaya çıkarıldı ve artan optik güçle genliklerini ölçeklendirmedi (veriler gösterilmedi). Ancak, bu sonuç belirli bir nörona giriş sağlayan transfected sinapsların sayısına ve fizyolojisine bağlıdır ve bu nedenle araştırılan aksonal projeksiyon ve nöron tipinin belirli kombinasyonuna bağlı olarak değişme olasılığı yüksektir.
Şekil 1: rAAV enjeksiyon bölgeleri ve deneysel kurulum. (A) Enjeksiyon alanı ve deneysel kurulum komiser projeksiyonları araştırmak için. Sol: Bir rAAV yapısı (örneğin, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) sağ IC içine enjekte edilir ve hedeflenen kayıtlar kontralateral IC yapılır. Sağ: Yama kelepçe kayıtları sırasında, Chronos transfected lifler ilerlikapetik potansiyelleri ortaya çıkarmak için mavi ışık ile heyecanlı. (B) ENJEKSIYON alanı ve DCN'den IC'ye kadar uzun menzilli projeksiyonları araştırmak için deneysel kurulum. Sol: ChrimsonR yapısı sağ DCN içine enjekte edilir ve hedeflenen kayıtlar kontralateral IC yapılır. Sağ: Yama kıskaç kayıtları sırasında, ChrimsonR-transfected lifler chrimsonR uyarılmış postsinaptik potansiyelleri kaydetmek için kırmızı ışık ile heyecanlıyız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: IC ve DCN içine enjeksiyonlar sonra Chronos-EGFP ifadesi. (A) Sol: Sağ IC enjeksiyon bölgelerine lokalize somata IC boyunca tdTomato etiketli VIP nöronlar gösteren koronal IC dilim görüntüsü (yeşil). Sağ: Enjeksiyon bölgesine IC kontralateral kayıtlı bir VIP nöron gösteren yüksek büyütme görüntü (beyaz-yeşil). Yeşil puncta contralateral IC projeksiyonları ifade Chronos-EGFP vardır. (B) RAAV-Chronos-EGFP enjeksiyonundan sonra DCN'de Chronos-EGFP ekspresyonu gösteren koronal beyin sapı diliminin görüntüsü. Sol: DcN görüntü, transfected DCN ve EGFP pozitif lifler dorsal akustik stria girerek gösteren. Orta: DCN'de Chronos transfected hücre gövdelerini gösteren daha yüksek büyütme görüntüsü. Sağ: Uzun menzilli DCN-IC projeksiyonları kontralateral IC lifler ve terminallerde Chronos-EGFP ifade. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DCN ve DCN projeksiyonlarında CHrimsonR-tdTomato ekspresyonu IC'ye. (A) Sağ DCN rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH enjekte edildi bir fare bir koronal beyin sapı dilim görüntüsü. Sol: Sağ DCN ChrimsonR ifade görüntüsü. Sağ: ChrimsonR ile nöronların güçlü transfeksiyon gösteren sağ DCN yüksek büyütme görüntü. (B) IC ChrimsonR transfected DCN aksonlar yüksek büyütme görüntü. (C) OPtogenetik uyarılmış EPS'ler IC kontralateral bir VIP nörondan rAAV-ChrimsonR enjekte DCN kaydedilen. Orijinal izler açık gri ve ortalama EPSP kırmızı gösterilir. Turuncu kutu 590 nm ışık darbesinin zamanlamasını gösterir. Ölçek çubukları = 20 ms/0.5 mV. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ChrimsonR'nin düşük mavi ışık seviyeleriyle aktivasyonu. (A) Kronometrenin 470 nm mavi ışık darbeleri ile komiser projeksiyonlarında aktivasyonu. Üst: Chronos aktivasyonu için eşiğin biraz üzerinde bir optik güçte uyarılmış Orijinal izlemeler (açık gri) ve Chronos güdümlü IPSP'lerin ortalaması (zil) (ölçek çubukları 20 ms/0.5 mV gösterir). Alt: 470 nm optik güç ve Chronos uyarılmış PSP gözlemleme olasılığı arasındaki ilişki. (B) 470 nm mavi ışık ile ChrimsonR aktivasyonu. Üst: Orijinal izleri (açık gri) ve ortalama (kırmızı) ChrimsonR tahrikLI EPS, 470nm mavi ışık ile uyarılmış aynı optik güç A kullanılan , üst (ölçek çubukları göstermek 20 ms/0.5 mV). Alt: 470 nm optik güç ve ChrimsonR odaklı PSP gözlemleme olasılığı arasındaki ilişki. ChrimsonR PSPs mavi ışık aktivasyonu için eşik Chronos PSPs ortaya çıkarmak için eşik aynı olduğunu unutmayın.
Şekil 5: Commissural sinapslardan ışık uyandıran PSPs'nin VIP nöronlara karakterizasyonu. Sağ IC rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH enjekte edildi ve kayıtları kontralateral ICc VIP nöronlar yapıldı. (A) Optogenetik uyarılmış IPSP'ler 2-5 ms mavi ışık yanıp söner (solda) uyarılırken, EPS 10 μM NBQX ve 50 μM D-AP5 tarafından bloke edildi. IPSP'ler gabazin (sağda) tarafından kaldırıldı. (B) Optogenetik olarak uyarılmış EPS 2-5 ms mavi ışık yanıp söner (solda) tarafından uyarılmış, IPSP'ler ise 1 μM strychnine ve 5 μM gabazin ile bloke edildi. 50 μM D-AP5'in yıkanma süresi, ışık uyandıran EPS'lerin (orta) yarı genişlik ve bozunma süresini önemli ölçüde azalttı. 10 μM NBQX'in yıkanma kısmı kalan EPSP'yi (sağda) ortadan kaldırmış. A ve B'deki orijinal izler açık gri renkte, ortalama50 ayrı iz siyah renkte gösterilir. Gönderen Goyer ve ark., 2019. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| X (yanal) | Y (kaudal) | Z (derinlik) | |
| Sağ IC penetrasyonu 1 | 1.000 μm | -900 μm | 2.250-1500 m arası (250 m artış) |
| Sağ IC penetrasyon 2 | 1.250 m | -900 μm | 2.250-1750 m arası (250 m artış) |
| Sağ DCN | 2.155 m | -1325 μm | 4.750 μm, 4.550 m |
Tablo 1: IC ve DCN içine rAAV enjeksiyonları için stereotaksik koordinatları. Tüm koordinatlar μm. Z koordinatlarında lambda'ya göredir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cracm'nin fare IC'deki nöronlara uzun menzilli sinaptik girdileri tanımlamak ve karakterize etmek için güçlü bir teknik olduğunu bulduk. Burada ayrıntılı olarak yapılan protokolü takiben, DCN ve IC'deki nöronların sağlam transfeksiyonunun yanı sıra Chronos ve ChrimsonR'ın IC'deki sinaptik terminallere güvenilir aksonal ticareti sağladık. Ayrıca, bu tekniğin PSP genliği, yarıgenişlik, çürüme süresi ve reseptör farmakolojisi de dahil olmak üzere postsinaptik olayların ölçülmesini ve analizini sağladığını gösterdik. Deneyimlerimiz, bu yaklaşımın işitsel beyin sapı boyunca ve ötesinde işlevsel devre haritalama deneyleri yapmak için kolayca uyarlanabileceğini göstermektedir.
Genel olarak, optogenetik devre haritalama özgüllüğü akson elektriksel stimülasyon üzerinde ayrı bir avantaj sağlar. Viral transfeksiyonlar, kanaloidofinlerin ekspresyonunu presinaptik nöronların hedeflenen popülasyonuna göre mekansal ve moleküler olarak kısıtlama olanağı sağlar. Buna karşılık, elektriksel stimülasyon, çoğu beyin bölgesinde olduğu gibi, bu aksonlar iç içe geçtiğinde farklı presinaptik çekirdeklerden kaynaklanan aksonlar arasında ayrım yapamaz. Elektriksel stimülasyon da hem ortokromik hem de antidromik ani artışlar başlatabilir, bir distal stimülasyon sitesi kayıt alanı yakınında bulunan nöronlar kaynaklanan aksonları içerdiğinde daha da karmaşık konularda.
Bir kanalrhodopsin istikrarlı ifade ve iyi aksonal ticareti sağlamak için, doğru viral vektör ve serotip seçimi çok önemlidir. Biz IC nöronlarda Chronos istikrarlı ekspresyonu bir serotip 1 rAAV chronos veya ChrimsonR yapı bir woodchuck hepatit posttranskripsiyonel düzenleyici unsur (WPRE) ve sığır büyüme hormonu (BGH) ile birlikte inşa ile elde edildi bulundu poliadenilasyon sinyali. rAAV serotip 5 IC fonksiyonel opsinler üretmek için başarısız oldu, ancak DCN fonksiyonel oldu (veri gösterilmedi). Her deney için enjeksiyon koordinatlarının titiz bir şekilde doğrulanması ve opsin ekspresyonunun hedeflenen beyin bölgesiyle sınırlı olmasını sağlamak da benzer şekilde önemlidir. Girdilerin anlamlı bir tanımlaması, ancak opsin ifadesi dikkatle kontrol edilip her deney için belgelenirse mümkündür.
Yukarıdaki protokolde kullanılan rAAV1.ChrimsonR yapısı, DCN'den IC'ye uzun menzilli projeksiyonlarda bile kararlı bir ifade ve proteinin iyi aksonal ticaretini ortaya çıkarmış(Şekil 3). Bu ChrimsonR (uzun menzilli) devre haritalama için uygun bir opsin yapar. ChrimsonR gibi kırmızı-shifted opsin deneysel parametreler doku derin ışık penetrasyonu gerektiriyorsa yararlı olabilir, ama deneyci tüm şu anda mevcut kırmızı-shifted opsins mavi ışık ile bazı çapraz aktivasyon göstermek farkında olmalıdır. Bazı çalışmalar ChrimsonR ve Chronos ayrı ayrı aktif olabileceğini savundu rağmen6,14,16, bizim veri büyük özen bu yaklaşım ile alınması gerektiğini göstermektedir. Yakın tarihli bir rapor, kırmızı yayılımlı opsinleri Chronos13'tenayırmaya çalışırken kullanılması gereken ek yöntemleri ayrıntılarıyla belirtin. Bu nedenle, chrimsonr ve Chronos'u iki renkli CRACM deneylerinde kullanırken, mavi ve kırmızı kaydırılmış opsin aktivasyonunun net bir şekilde ayrılmasını sağlamak için dikkatlice tasarlanmış kontrol deneylerinin yürütülmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, proje numarası 401540516, DG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R56 DC016880 (MTR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
