Summary
Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging (CRACM) er en presisjonsteknikk for funksjonell kartlegging av langtrekkende nevronale projeksjoner mellom anatomisk og/ eller genetisk identifiserte grupper av nevroner. Her beskriver vi hvordan du bruker CRACM til å kartlegge auditive hjernestammeforbindelser, inkludert bruk av en rød-shifted opsin, ChrimsonR.
Abstract
Når du undersøker nevrale kretser, er en standard begrensning av in vitro patch clamp tilnærming at aksoner fra flere kilder er ofte blandet, noe som gjør det vanskelig å isolere innganger fra individuelle kilder med elektrisk stimulering. Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM), kan denne begrensningen nå overvinnes. Her rapporterer vi en metode for å bruke CRACM til å kartlegge stigende innganger fra nedre auditive hjernestammekjerner og kommissærinnganger til en identifisert klasse av nevroner i den dårligere colliculus (IC), midthjernen kjernen i hørselssystemet. I IC, lokale, commissural, stigende, og synkende aksoner er tungt sammenvevd og derfor umulig å skille med elektrisk stimulering. Ved å injisere en viral konstruksjon for å drive uttrykk for en channelrhodopsin i en presynaptisk kjerne, etterfulgt av patch clamp opptak for å karakterisere tilstedeværelse og fysiologi av channelrhodopsin-uttrykkende synaptiske innganger, projeksjoner fra en bestemt kilde til en bestemt populasjon av IC-nevroner kan kartlegges med celletypespesifikk nøyaktighet. Vi viser at denne tilnærmingen fungerer med både Chronos, en blå lysaktivert channelrhodopsin og ChrimsonR, en rød-shifted channelrhodopsin. I motsetning til tidligere rapporter fra forhjernen, finner vi at ChrimsonR er robust smuglet ned aksonene av dorsal cochleakjerne kjerne hovednevroner, noe som indikerer at ChrimsonR kan være et nyttig verktøy for CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen som presenteres her inneholder detaljerte beskrivelser av intrakraniell virusinjeksjonskirurgi, inkludert stereotaxic koordinater for målretting av injeksjoner til dorsal cochleakjerne og IC av mus, og hvordan du kombinerer hele celle patch clamp opptak med channelrhodopsin aktivering for å undersøke langsiktige projeksjoner til IC nevroner. Selv om denne protokollen er skreddersydd for å karakterisere auditive innganger til IC, kan den enkelt tilpasses for å undersøke andre langdistanseprojeksjoner i den hørbare hjernestammen og utover.
Introduction
Synaptiske forbindelser er avgjørende for neural kretsfunksjon, men den nøyaktige topologien og fysiologien til synapser innenfor nevrale kretser er ofte vanskelige å sondere eksperimentelt. Dette skyldes at elektrisk stimulering, det tradisjonelle verktøyet for cellulær elektrofysiologi, ukritisk aktiverer aksoner i nærheten av stimuleringsstedet, og i de fleste hjerneregioner henger aksoner fra forskjellige kilder (lokalt, stigende og/eller synkende). Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM)1,2, kan denne begrensningen nåovervinnes 3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktivert, kation-selektiv ion kanal opprinnelig funnet i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres av blått lys av en bølgelengde rundt 450-490 nm, depolarisere cellen gjennom kation tilstrømning. ChR2 ble først beskrevet og uttrykt i Xenopus oocytes av Nagel og kolleger4. Kort tid etter det uttrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrnevroner og viste at de kunne bruke lyspulser til pålitelig kontroll på en millisekund tidsskala, induserehandlingspotensialer ~ 10 ms etter aktivering av ChR2 med blått lys. Optogenetiske kanaler med enda raskere kinetikk har blitt funnet nylig (f.eks. Chronos6).
Den grunnleggende tilnærmingen til et CRACM-eksperiment er å transfect en populasjon av antatte presynaptiske nevroner med en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som bærer genetisk informasjon for en channelrhodopsin. Transfection av nevroner med rAAV fører til uttrykk for kodet channelrhodopsin. Vanligvis er channelrhodopsin merket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescent Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), slik at transfection av nevroner i målområdet lett kan bekreftes med fluorescensavbildning. Fordi rAAVs er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potensial og langvarig genuttrykk7,8, har de blitt en standard teknikk for å levere channelrhodopsins til nevroner. Hvis aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysblinker, etter transfeksjon av en antatt presynaptisk populasjon av nevroner, fremkaller aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysglimt postsynaptiske potensialer eller strømmer i målnevronene, dette er bevis på en aksonal forbindelse fra den transinfiserte kjernen til den registrerte cellen. Fordi avskårne aksoner i hjerneskiveeksperimenter kan bli drevet til å frigjøre nevrotransmitter gjennom channelrhodopsin aktivering, kjerner som ligger utenfor den akutte skive, men sende aksoner inn i postsynaptic hjerneregionen kan identifiseres med CRACM. Kraften i denne teknikken er at tilkobling og fysiologi av identifiserte langrekkevidde synaptiske innganger kan undersøkes direkte.
I tillegg til channelrhodopsins som er spennende av blått lys, etterforskere har nylig identifisert flere rød-shifted channelrhodopsins9,10, inkludert Chrimson og dens raskere analogchrimsonR, som begge er begeistret med rødt lys av ~ 660 nm6. Rød-forskjøvet opsiner er av interesse fordi rødt lys trenger vev bedre enn blått lys, og rødt lys kan ha en lavere cytotoksisitet enn blått lys10,11,12. Rød-forskjøvet channelrhodopsins også åpne opp muligheten for dual farge CRACM eksperimenter, hvor konvergens av aksoner fra forskjellige kjerner på samme nevron kan testes i ett eksperiment6,13,14. Imidlertid viser dagens rød-forskjøvet opsins ofte uønsket kryssaktivering med blått lys15,16,17, noe som gjør to fargeeksperimenter vanskelig. I tillegg har noen rapporter indikert at ChrimsonR gjennomgår begrenset aksonal handel, noe som kan gjøre det utfordrende å bruke ChrimsonR for CRACM eksperimenter16,17.
Nesten alle stigende projeksjoner fra de lavere auditive hjernestammene konvergerer i den dårligere colliculus (IC), midbrain-knutepunktet til den sentrale auditive veien. Dette inkluderer projeksjoner fra cochleakjernen (CN)18,19, det meste av det overlegne olivary-komplekset (SOC)20,og dorsal (DNLL) og ventrale (VNLL) kjerner av lateral lemniscus21. I tillegg avsluttes en stor synkende projeksjon fra den hørbare cortex i IC18,19,20,21,22, og IC nevroner selv synapse bredt innenfor de lokale og kontralaterale fliker av IC23. Innheking av aksoner fra mange kilder har gjort det vanskelig å sondere IC-kretser ved hjelp av elektrisk stimulering24. Som et resultat, selv om nevroner i IC utføre beregninger viktig for god lokalisering og identifisering av tale og andre kommunikasjonslyder25,26, organiseringen av nevrale kretser i IC er i stor grad ukjent. Vi har nylig identifisert VIP nevroner som den første molekylært identifiserbare nevron klassen i IC27. VIP nevroner er glutamatergic stellate nevroner som projiserer til flere langdistanse mål, inkludert auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nå i stand til å bestemme kildene og funksjonen til lokale og langdistanse innganger til VIP-nevroner og for å finne ut hvordan disse kretsforbindelsene bidrar til lydbehandling.
Protokollen som presenteres her er skreddersydd for å undersøke synaptiske innganger til VIP-nevroner i IC av mus, spesielt fra kontralateral IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan enkelt tilpasses ulike inngangskilder, en annen nevrontype eller en annen hjerneregion helt. Vi viser også at ChrimsonR er en effektiv rød-shifted channelrhodopsin for lang rekkevidde krets kartlegging i den auditive hjernestammen. Vi viser imidlertid at ChrimsonR er sterkt aktivert av blått lys, selv ved lave intensiteter, og dermed å kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farge CRACM eksperimenter, må forsiktige kontroller brukes for å hindre kryssaktivering av ChrimsonR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Få godkjenning fra den lokale institusjonelle dyreverns- og brukskomiteen (IACUC) og følg NIH-retningslinjene for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Alle prosedyrer i denne protokollen ble godkjent av University of Michigan IACUC og var i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av laboratoriedyr.
1. Kirurgi Forberedelser
- Utfør operasjoner under aseptiske forhold. Autoklav/steriliser alle kirurgi verktøy og materialer før operasjonen. Bruk kirurgi kjole og maske for operasjonen.
- Sanitize kirurgi området (spray og tørk ned med 70% etanol), og plasser sterile håndkle gardiner for å dekke operasjonsområdet.
- Forbered utvinningburet. Fjern bursengetøy for å begrense risikoen for kvelning. Sett en varmepute under buret. Gi en mat- og vannkilde.
- Trekk en glasskapillær for nanoinjektoren på en pipetteavtrekker. Den intense varmen av oppvarmingfilamentet under trekkprosessen vil sterilisere glasskapillær. Klipp eller bryt av spissen for å oppnå en åpning ca. 5 μm i diameter.
- Bevel kapillærspissen til en ca. 30° vinkel for å forbedre vevspenetrasjonen og redusere tilstopping. Fyll kapillæren med mineralolje og sett inn i en nanoliter injektor.
- Få en aliquot av ønsket channelrhodopsin-koding rAAV og fortynn til ønsket titer ved hjelp av sterile PBS.
MERK: Vi har funnet ut at serotype 1 rAv-er fungerer bra for transfection av auditive hjernestammenkjerner. Spesielt rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blått lysaktivert channelrhodopsin) og rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (rød-shifted channelrhodopsin), som er tilgjengelig fra offentlig tilgjengelige repositorier og vektorkjerner, konsekvent gi de høye uttrykksnivåene og god langdistanse aksonal handel av kanaliserere som trengs for CRACM eksperimenter. - Følg injektorinstruksjonene til frontfyllingskapillær med 1-3 μL rAAV i steril e-PBS.
2. Kirurgi
- Sett dyret i et induksjonskammer og indusere anestesi med 3% isofluran i oksygen levert via en kalibrert isofluranfordamper. Følg musen til pusten blir dyp og langsom og en tå klemme refleks er fraværende, ca 3-5 min.
- Overfør dyret til en stereotaxic ramme. Fest dyrets hode ved å sette munnen på en ganestang med en gassanestesimaske og ved å plassere ikke-perforerende ørestenger i begge øregangene.
- Sett inn en rektal temperaturprobe og slå på den homeostatiske temperaturregulatoren.
- Påfør oftalmisk salve for å hindre at øynene tørker ut.
- Administrer forebyggende smertestillende (f.eks. subkutan injeksjon på 5 mg/kg karprofen).
- Juster isofluran ei til 1-2,5 %, i henhold til dybden av den bedøvede tilstanden. Overvåk temperatur, pust ing og farge på slimhinner minst hvert 15.
- Barber hodebunnen med elektriske klippere. Aseptically forberede hodebunnen med tre vekslende vattpinner av povidone-jod og 70% etanol.
- Lag et snitt i hodebunnen langs midtlinjen som starter mellom ørene og fortsetter rostral for øynene, utsette lambda og bregma suturer. Skyv huden til siden og fjern periosteum fra eksponert bein om nødvendig.
- Merk lambdasuturen med en steril kirurgisk markør, plasser spissen av nanoinjektoren slik at den bare berører lambda, og null mikromanipulatorkoordinatene. Bruk nanoinjektovet og mikromanipulatoren til å måle forskjellen i høyde mellom lambda og bregma suturer. Juster ganebarhøyde for å bringe lambda og bregma til innenfor ± 100 μm høydeforskjell.
- Kartinjeksjonsstedet ved hjelp av nanoinjektorspissen og mikromanipulatorkoordineringssystemet og merk stedet med en steril kirurgisk markør. For å injisere IC eller DCN av P21-P30 mus, bruk koordinater i forhold til lambda suturen, som vist i tabell 1. Vær oppmerksom på at Z-dybden i koordinatene våre måles fra overflaten av skallen ved lambda.
- Bruk en mikromotorbor med en steril 0,5 mm borgrad til å utføre kraniotomi over injeksjonsstedet.
- For å sikre bred transfection av nevroner i målkjernen, gjør injeksjoner på ulike dybder i vevet (Tabell 1, Z koordinater), og i tilfelle av større hjerneregioner som IC, gjør injeksjoner i løpet av to eller flere gjennomføringer på forskjellige X og Y koordinater (Tabell 1, Høyre IC penetrasjon 1 og Høyre IC penetrasjon 2).
- Utfør injeksjoner. For IC injeksjoner, innskudd 20 nL virus i intervaller på 250 μm langs Z-aksen (injeksjondybde) mellom 2250 μm og 1750 μm dybde. For DCN injeksjoner, innskudd 20 nL virus på en dybde på 4750 μm og 4550 μm, henholdsvis.
- Etter injeksjon ved hver Z-koordinat, vent 2-3 min før du flytter injektoren til neste Z-koordinate. Dette vil gi tid for viruset å spre seg bort fra injeksjonsstedet, noe som reduserer sannsynligheten for at viruset vil bli sugd opp injeksjonskanalen når nanoinjektoren er omplassert.
- Etter siste injeksjon i en penetrasjon, vent 3-5 min før du trekker nanoinjektor fra hjernen.
- Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellom penetreringsforhold og mellom dyr, må du løse ut et lite volum virus fra spissen for å kontrollere at spissen ikke er tilstoppet.
- Etter injeksjoner, bruk sterile PBS for å fukte de kuttede kantene av hodebunnen og deretter forsiktig flytte huden tilbake mot midtlinjen. Lukk såret med enkle avbrutte suturer med 6-0 (0,7 metriske) nylonsuturer.
- Påfør 0,5-1 ml 2% lidokaingel på såret.
- Fjern ørestenger og temperaturprobe, slå av isoflurane, fjern musen fra ganelinjen og overfør den til gjenopprettingsburet.
- Overvåk gjenopprettingen nøye. Når dyret er helt våken, beveger seg rundt, og viser ingen tegn på smerte eller nød, overføre det tilbake i buret og returnere buret til vivarium.
- Hvis operasjoner vil bli utført på flere dyr på en dag, bruk en varm perle sterilisator for å rense kirurgi verktøy og bore burr før neste operasjon.
3. Kirurgisk oppfølging
- Sjekk dyr daglig for sårlukking, infeksjon eller tegn på smerte eller nød i løpet av de neste 10 dagene, og følg institusjonens retningslinjer for dyrepleie.
- Vent 3-4 uker før du bruker dyr i eksperimenter for å tillate optimalt uttrykk for kanalofdopsinene.
4. Tilberedning av hjerneskiver og bekreftelse av injeksjonsmål
- For CRACM, bruk akutt forberedt hjerneskiver fra transinfiserte dyr i standard in vitro elektrofysiologi eksperimenter, beskrevet her bare kort (se Goyer et al. 2019 for en mer detaljert beskrivelse27).
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) som inneholder (i mM): 125 NaCl, 12,5 D-glukose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 CaCl2,1 MgSO4. Boble ACSF til en pH på 7,4 med 5% CO2 i 95% O2.
- Utfør alle følgende trinn, inkludert in vitro elektrofysiologi, i nær mørke eller rødt lys for å begrense aktivering av channelrhodopsins.
- Dypt bedøve musen med isofluran og halshugge den raskt. Disseker hjernen raskt i ~ 34 ° C ACSF.
- Skjær koronarskiver (200-250 μm) som inneholder IC i ~ 34 ° C ACSF med et vibrerende mikrotome og inkuber skivene ved 34 ° C i 30 min i et holdekammer fylt med ACSF boblet med 5% CO2 i 95% O2. Etter inkubasjon, lagre skiver ved romtemperatur til det brukes til opptak.
- Hvis injeksjonsmålet ikke var IC, kutt flere koronale skiver av den injiserte hjerneregionen og kontroller transfection av målkjernen under et fluorescensmikroskop. Hvis det ikke er transfection i målkjernen eller ekstra transfeksjon i forskjellige hjerneregioner, ikke fortsett med eksperiment.
5. In Vitro Opptak og CRACM Eksperiment
MERK: For å gi optisk stimulering av Chronos og ChrimsonR bruker vi lysdioder kombinert til epifluorescensporten til mikroskopet. Lasere kan imidlertid brukes i stedet for lysdioder. Hvis du bruker lasere, få forhåndsgodkjenning fra institusjonelle sikkerhetstjenestemenn og følg passende retningslinjer for sikker laserbruk.
- Trekk elektroder fra borosilikatglass til en motstand på 3,5-4,5 MΩ. Den interne elektrodenoppløsningen skal inneholde (i mM): 115 K-glukonat, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfokreain, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, supplert med 0,1% biocyttin (w / v), pH justert til 7,3 med KOH og osmolalitet til 290 mOsm / kg med sukrose.
- For å gjøre opptak, bruk standard patch clamp metoder. Plasser skiven i et opptakskammer under et fast stadium oppreist mikroskop og kontinuerlig fylle med ACSF ved ~ 2 ml / min. Utfør opptak nær fysiologisk temperatur (~ 34-36 ° C).
- Patch nevroner under visuell kontroll ved hjelp av en passende patch klemme forsterker. Riktig for seriemotstand, pipettekapasitans og væskekoblingspotensial.
- Under hele celleopptak aktiverer du Chronos ved å levere korte pulser (1-5 ms) på 470 nm-lys eller ChrimsonR med korte pulser på 580 nm-lys gjennom kommersielt tilgjengelige lysdioder. Bestem terskelen for opsin aktivering og bruke en minimal stimulering protokoll for å fremkalle postsynaptic potensialer. Generelt, bruk den korteste stimulansvarigheten som fremkaller en PSP, og sett den optiske kraften til 120% av terskelkraften som kreves for å fremkalle PSPs.
- For å bekrefte at de registrerte endringene i membranpotensialet faktisk er synaptiske innganger til nevronen, kan standard antagonister for eksitatori/hemmende postsynaptiske reseptorer vaskes i under forsøket. For å undersøke ulike reseptorbidrag til en PSP (f.eks. NMDA vs AMPA-reseptorer), kan egnede reseptorantagonister vaskes inn. For hver reseptorantagonist bør legemiddeleffekter reversere etter utvasking.
- Bruk ventetiden, jitter og påliteligheten til PSPs for å bekrefte at lysaktiverte synaptiske innganger stammer fra direkte, optisk aktivering av synapser på det registrerte nevronet, i motsetning til aktivering av channelrhodopsin-uttrykkende synapser på en intervenerende nevron som synapserer på det registrerte nevronet. Generelt, lav ventetid (<2 ms), lav jitter (<1 ms standardavvik i ventetid), og høy pålitelighet (>50%) indikerer en direkte synaptisk forbindelse fra channelrhodopsin som uttrykker presynaptisk nevron til det registrerte nevronet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi krysset VIP-IRES-Cre mus(Viptm1 (cre) Zjh/ J) og Ai14 Cre-reporter mus (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) for å generere F1 avkom der VIP-nevroner uttrykker fluorescerende protein tdTomato. F1 avkom av begge kjønn ble brukt, alderen postnatal dag (P) 21 til P70. Totalt 22 dyr ble brukt i denne studien.
Stereotaxic injeksjon av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH inn i høyre IC av VIP-IRES-Cre x Ai14 mus ved hjelp av koordinater vist i tabell 1 resulterte i sterke Chronos-EGFP uttrykk i høyre IC (Figur 2A). Visuell inspeksjon av Chronos-EGFP fluorescens indikerte at det meste av somata merket i høyre IC var plassert i den sentrale kjernen av IC (ICc), men merket somata var noen ganger også til stede i dorsal cortex av IC (ICd) og noen ganger i lateral cortex av IC (IClc). Målrettingen og omfanget av transfeksjon bør kontrolleres for hvert dyr som brukes i et eksperiment, da uttrykk for kanalisofdopsiner i ikke-målrettede regioner kan føre til falske positiver. For å oppnå bredere eller mer begrenset uttrykk for Chronos, kan mengden avdeponert virus samt stereotaxic koordinatene enkelt justeres for å oppnå ønsket resultat.
Stereotaxic injeksjon av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH inn i DCN (se koordinater i tabell 1) av VIP-IRES-Cre x Ai14 mus resulterte i sterk transfection av DCN nevroner (Figur 2B). For å bekrefte selektiv transfection av DCN, bør hjernestammen til hvert dyr skjæres for å bekrefte at EGFP-uttrykket var tilstede og begrenset til DCN. Hvis det ikke er transfection eller hvis det er betydelig uttrykk for EGFP i hørselsnerven eller VCN, bør opptak ikke utføres. Ved hjelp av koordinatene som vises i tabell 1 med et samlet injeksjonsvolum på 40 ml, vil Chronos-EGFP-uttrykket være begrenset til DCN i de fleste tilfeller. EGFP-merkede aksoner var til stede i venstre (kontralateral) ICc 3 uker etter injeksjon for både IC og DCN injeksjon nettsteder (Figur 2A høyre, 2B høyre).
For å teste den lange handelen med ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH ble injisert i riktig DCN av VIP-IRES-Cre x Ai14 mus, ved hjelp av de samme koordinatene som med Chronos injeksjoner. ChrimsonR injeksjon førte til sterkt uttrykk i DCN, med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre (Figur 3A). I den kontralaterale ICc var fibre sterkt merket med tdTomato tydelig synlig etter 3 uker, og viste den lange handelsevnen til ChrimsonR-tdTomato-konstruksjonen når de injiseres i auditive hjernestammenkjerner (figur 3B). Optisk aktivering av ChrimsonR fremkalte EpPs i IC VIP nevroner (Figur 3C),noe som indikerer at ChrimsonR er et nyttig verktøy for langdistanse CRACM eksperimenter når eksperimentelle parametere krever bruk av rødt lys i stedet for blått lys. Vi fant imidlertid ut at ChrimsonR var lett aktivert med blått lys, og viste samme terskel for aktivering av blått lys som Chronos (figur 4). Følsomheten til ChrimsonR til blått lys betyr at det må utvises spesiell forsiktighet for å skille mellom innganger som er overført med ChrimsonR eller Chronos i samme dyr13.
Når du målretter mot opptak til VIP-nevroner i kontralateral (venstre) ICc etter injeksjoner i høyre IC, fremkalte blått lys eksitatariske postsynaptiske potensialer (EPPer) eller hemmende postsynaptiske potensialer (IPSPs). Dette bekrefter tvangsprojeksjoner til VIP-nevroner. For å analysere commissural EPSPs og Ip-adresser separat, brukte vi reseptorantagonister til å blokkere IP-er under EPSP-opptak, og omvendt. Representative EpPs og IP-adresser registrert under CRACM eksperimenter er vist i figur 5. Ip-adresser ble observert i 6 av 12 testede ICc VIP-nevroner. IPSPs var små (1,53 mV ± 0,96 mV) og hadde moderate kinetikk. De 10 - 90% økningstider av Ip-psps var 7,8 ms ± 2,1 ms, halfwidths var 15,1 ms ± 6,8 ms, og forfall tid konstanter var 32,4 ms ± 17,0 ms (Figur 5A, venstre). IPSPs ble mediert av GABAA reseptorer, som de ble blokkert av 5 μM gabazine, en GABAA reseptor antagonist(Figur 5A, høyre; n = 6). EpPs ble observert i 11 av 27 ICc VIP nevroner testet. EpPs var også små (1,52 mV ± 1,08 mV) og hadde moderate kinetikk. De 10 - 90% økningstider av EPSPs var 8,3 ms ± 4,3 ms, halfwidths var 19,6 ms ± 7,6 ms, og forfall tid konstanter var 43,5 ms ± 16,8 ms (Figur 5B "Kontroll"). EpPs ble mediert av AMPA og NMDA reseptorer. Påføring av 50 μM D-AP5, en NMDA reseptor antagonist, redusert EPSP halvbredde (14,3 ms ± 4,7 ms, p = 0,006) og trended mot å redusere stigetiden (6,3 ms ± 1,6 ms, p = 0,09), forfall tid konstant (30,6 ms ± 7,3 ms, p = 0,06), og EPSP amplitude (1,38 ± 0,33 mV, p = 0,105;; ANOVA for gjentatte målinger med Tukey post-hoc-test). Anvendelse av 10 μM NBQX, en AMPA-reseptorantagonist, blokkerte resten av EPSP(figur 5B "+ AP5 og NBQX").
Opptak av VIP-nevroner i venstre ICc etter DCN injeksjoner avslørte EpPs fremkalt av blått lys blinker, bekrefter synaptiske innganger fra DCN til VIP nevroner i IC. DCN CRACM eksperimenter ble utført med GABAergic og glycinergic blokkere i badekaret for å blokkere spontane IP-er. Vi fant at 2-5 ms pulser av blått lys fremkalte EpPs i 19 av 25 nevroner testet. Lysfremkalt EPSPs hadde moderate amplituder (2,85 mV ± 2,98 mV) og relativt langsomme stigningstider (4,2 ms ± 1,3 ms), halvbredder (20,6 ms ± 14,4 ms) og forfalltidkonstanter (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 celler, data vises ikke).
Alle PSPs fremkalt av Chronos eller ChrimsonR aktivering ble fremkalt på en helt-eller-ingen måte og ikke skalere sin amplitude med økende optisk kraft (data ikke vist). Dette resultatet avhenger imidlertid av antall og fysiologi av de transinfiserte synapsene som gir innspill til et bestemt nevron og er derfor sannsynlig å variere avhengig av den bestemte kombinasjonen av aksonal projeksjon og nevrontype som undersøkes.
Figur 1: rAAV injeksjonssteder og eksperimentelt oppsett. (A) Injeksjonssted og eksperimentelt oppsett for å undersøke kommissurale projeksjoner. Venstre: En rAAV-konstruksjon (f.eks. rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) injiseres i riktig IC og målrettede opptak utføres i kontralateral IC. Høyre: Under patch clamp opptak, Chronos-transfected fibre er begeistret med blått lys for å fremkalle postsynaptic potensialer. (B) Injeksjonssted og eksperimentelt oppsett for å undersøke langsiktige projeksjoner fra DCN til IC. Venstre: ChrimsonR-konstruksjonen injiseres i høyre DCN, og målrettede opptak utføres i kontralateral IC. Høyre: Under patch clamp opptak, ChrimsonR-transfected fibre er begeistret med rødt lys for å registrere ChrimsonR fremkalt postsynaptic potensialer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Chronos-EGFP uttrykk etter injeksjoner i IC og DCN. (A) Venstre: Bilde av koronar IC skive som viser tdTomato-merket VIP nevroner i hele IC (magenta) og Chronos-EGFP uttrykk i somata lokalisert til injeksjonssteder i høyre IC (grønn). Høyre: Høyere forstørrelsesbilde som viser en innspilt VIP-nevron (hvitgrønn) i IC kontralateral til injeksjonsstedet. Grønn puncta er Chronos-EGFP som uttrykker projeksjoner fra kontralateral IC. (B) Bilde av koronar hjernestammen skive som viser Chronos-EGFP uttrykk i DCN etter rAAV-Chronos-EGFP injeksjon. Venstre: Bilde av DCN, som viser transfected DCN og EGFP-positive fibre inn i dorsal akustisk stria. Midten: Høyere forstørrelsesbilde som viser Chronos-transinfiserte cellelegemer i DCN. Høyre: Chronos-EGFP uttrykk i fibre og terminaler i kontralateral IC fra langt rekke DCN-IC projeksjoner. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ChrimsonR-tdTomato-uttrykk i DCN- og DCN-projeksjonene til IC. (A) Bilde av en koronar hjernestammen skive fra en mus der høyre DCN ble injisert med rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Venstre: Bilde av ChrimsonR-uttrykk i høyre DCN. Høyre: Høyere forstørrelsesbilde av høyre DCN som viser sterk transfection av nevroner med ChrimsonR. (B) Høyt forstørrelsesbilde av ChrimsonR-transinfiserte DCN-aksoner i IC. (C) Optogenetically fremkalt EPSPs registrert fra en VIP nevron i IC contralateral til rAAV-ChrimsonR injisert DCN. Originale spor er vist i lys grå og gjennomsnittlig EPSP er i rødt. Oransje boks indikerer tidspunktet for 590 nm lyspuls. Skalerstolper = 20 ms/0,5 mV. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Aktivering av ChrimsonR ved lave nivåer av blått lys. (A) Aktivering av Chronos i commissural projeksjoner av pulser på 470 nm blått lys. Topp: Originale spor (lys grå) og gjennomsnittlig (cyan) av Chronos-drevne IP-er, fremkalt med en optisk effekt litt over terskelen for Chronos-aktivering (skalalinjer viser 20 ms/0,5 mV). Bunn: Forholdet mellom optisk kraft på 470 nm og sannsynligheten for å observere en Chronos-fremkalt PSP. (B) Aktivering av ChrimsonR med 470 nm blått lys. Topp: Originale spor (lys grå) og gjennomsnittlig (rød) av ChrimsonR-drevne EPPs, fremkalt med 470 nm blått lys ved samme optiske kraft som brukes i A, topp (skalastenger viser 20 ms / 0,5 mV). Bunn: Forholdet mellom optisk kraft på 470 nm og sannsynligheten for å observere en ChrimsonR-drevet PSP. Vær oppmerksom på at terskelen for blålysaktivering av ChrimsonR PSPs var identisk med terskelen for å fremkalle Chronos PSPs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Karakterisering av lysfremkallede PSPer fra kommissærsynapser på VIP-nevroner. Høyre IC ble injisert med rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH og opptak ble laget av VIP-nevroner i den kontralaterale ICc. (A) Optogenetisk fremkalt IPSPs ble fremkalt av 2-5 ms blått lys blinker (venstre) mens EpPs ble blokkert av 10 μM NBQX og 50 μM D-AP5. IPSPs ble avskaffet av gabazine (høyre). (B) Optogenetically-fremkalt EPSPs ble fremkalt av 2-5 ms blått lys blinker (venstre) mens IPSPs ble blokkert med 1 μM stryknin og 5 μM gabazine. Innvask av 50 μM D-AP5 reduserte halvveis bredde og forfall tid konstant av lysfremkallede EPPs (midten). Innvask av 10 μM NBQX avskaffet gjenværende EPSP (høyre). Originale spor i A og B er vist i lys grå, og gjennomsnitt fra opptil 50 individuelle spor er vist i svart. Fra Goyer et al., 2019. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| X (sideveis) | Y (caudal) | Z (dybde) | |
| Høyre IC penetrasjon 1 | 1000 μm | -900 μm | 2 250-1500 μm (250 μm trinn) |
| Høyre IC penetrasjon 2 | 1250 μm | -900 μm | 2 250-1750 μm (250 μm trinn) |
| Høyre DCN | 2 155 μm | -1325 μm | 4750 μm, 4550 μm |
Tabell 1: Stereotaxic koordinater for rAAV injeksjoner i IC og DCN. Alle koordinatene er i forhold til lambda i μm. Z koordinater måles fra dorsal overflaten av skallen ved lambda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnet ut at CRACM er en kraftig teknikk for å identifisere og karakterisere synaptiske innganger i lang rekkevidde til nevroner i musen IC. Etter protokollen som er beskrevet her, oppnådde vi robust transfection av nevroner i DCN og IC, samt pålitelig aksonal handel av Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. I tillegg viste vi at denne teknikken muliggjør måling og analyse av postsynaptiske hendelser, inkludert PSP amplitude, halfwidth, forfalltid og reseptorfarmakologi. Vår erfaring tyder på at denne tilnærmingen lett kan tilpasses for å utføre funksjonelle kretskartleggingseksperimenter gjennom den auditive hjernestammen og utover.
Samlet sett gir spesifisiteten av optogenetisk kretskartlegging en klar fordel over elektrisk stimulering av aksoner. Virale transfeksjoner gir evnen til å romlig og molekylært begrense uttrykket av kanaliserere til en målrettet populasjon av presynaptiske nevroner. I motsetning kan elektrisk stimulering ikke skille mellom aksoner som stammer fra forskjellige presynaptiske kjerner når disse aksonene er blandet, som det er tilfelle i de fleste hjerneregioner. Elektrisk stimulering kan også initiere både ortodromic og antidromic pigger, ytterligere kompliserende saker når en distale stimulering området inneholder aksoner stammer fra nevroner som ligger i nærheten av opptaksstedet.
For å sikre stabilt uttrykk og god aksonal handel av en channelrhodopsin, velge riktig viral vektor og serotype er avgjørende. Vi fant at stabilt uttrykk for Chronos i IC nevroner ble oppnådd med en serotype 1 rAAV inkludert en Chronos eller ChrimsonR konstruksjon kombinert med en trechuck hepatitt posttranscriptional regulatorisk element (WPRE) og storfe veksthormon (BGH) polyadenyleringssignal. rAAV serotype 5 kunne ikke produsere funksjonelle opsiner i IC, men var funksjonell i DCN (data vises ikke). Den strenge valideringen av injeksjonskoordinater for hvert eksperiment og sikre at opsinuttrykk er begrenset til den målrettede hjerneregionen, er på samme måte viktig. En meningsfull identifikasjon av innganger er bare mulig hvis uttrykket for opsinen kontrolleres nøye og dokumenteres for hvert eksperiment.
rAAV1.ChrimsonR-konstruksjonen som brukes i protokollen ovenfor ga stabilt uttrykk og god aksonal handel av proteinet, selv i langt rekke projeksjoner fra DCN til IC (Figur 3). Dette gjør ChrimsonR til en passende opsin for (langdistanse) kretskartlegging. En rød-forskjøvet opsin som ChrimsonR kan være nyttig hvis de eksperimentelle parametrene krever lett penetrasjon dypt inn i vevet, men eksperimentereren må være klar over at alle tilgjengelige rød-forskjøvet opsins viser noen kryssaktivering med blått lys. Selv om noen studier har hevdet at ChrimsonR og Chronos kan aktiveres separat6,14,16, tyder våre data på at stor forsiktighet må tas med denne tilnærmingen. En nylig rapport beskriver flere metoder som bør brukes hvis du forsøker å skille rød-forskjøvet opsins fra Chronos13. Derfor, når du bruker ChrimsonR og Chronos i to farge CRACM eksperimenter, nøye utformet kontroll eksperimenter må utføres for å sikre klar separasjon av blå og rød-shifted opsin aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, prosjektnummer 401540516, til DG) og National Institutes of Health stipend R56 DC016880 (MTR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
