Summary
Denne protokol præsenterer en robust, reproducerbar model af vaskulære komposit allotransplant (VCA) rettet mod samtidig undersøgelse af immunologi og funktionel genopretning. Den tid, der investeres i omhyggelig teknik i en højre midt-låret bagekstremiteten ortopisk transplantation med hånd syet vaskulære anastomoses og neurale coaptation giver mulighed for at studere funktionel helbredelse.
Abstract
Limb transplantation i særdeleshed og vaskulariseret komposit allotransplant (VCA) generelt har bred terapeutisk løfte, der er blevet hæmmet af de nuværende begrænsninger i immunsuppression og funktionelle neuromotoriske opsving. Mange dyremodeller er udviklet til at studere unikke funktioner i VCA, men her præsenterer vi en robust reproducerbar model af ortopisk hind lemmer transplantation hos rotter designet til samtidig at undersøge begge aspekter af den nuværende VCA begrænsning: immunsuppression strategier og funktionelle neuromotoriske opsving. Kernen i modellen hviler en forpligtelse til omhyggelige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker såsom håndsyet vaskulære anastomoses og håndsyet neural coaptation af lårbensnerven og iskiasnerven. Denne fremgangsmåde giver holdbare lemmer rekonstruktioner, der giver mulighed for længere levede dyr i stand til rehabilitering, genoptagelse af daglige aktiviteter, og funktionelle test. Med kortvarig behandling af konventionelle immunsuppressive midler overlevede allotransplanterede dyr op til 70 dage efter transplantationen, og isotransplanterede dyr giver langvarige kontroller ud over 200 dage efter operationen. Tegn på neurologisk funktionel helbredelse er til stede ved 30 dage efter operativt. Denne model giver ikke kun en nyttig platform for afhøring af immunologiske spørgsmål, der er unikke for VCA og nerveregenerering, men giver også mulighed for in vivo-test af nye terapeutiske strategier, der er skræddersyet til VCA.
Introduction
Limb transplantation under den bredere kategori af vaskulære-komposit allotransplant (VCA) eller komposit væv allotransplant (CTA) har endnu ikke opfyldt sit terapeutiske løfte. Siden de første vellykkede menneskelige hånd transplantationer i Lyon, Frankrig og Louisville, Kentucky i 1998 og 1999, over 100 øvre ende transplantationer er blevet udført på verdensplan i nøje udvalgte patienter1. Bredere anvendelighed er blevet hæmmet af betydelig immunsuppression og begrænset funktionel neuromotorisk opsving. Nuværende immunsuppressionsstrategier resulterer i 85% forekomst af akut afstødning i lyset af 77% forekomst af opportunistisk infektion2. På den anden side, funktionel opsving efter hånd transplantation opstår; gennemsnitlige scorer for armskuld og hånd (DASH) forbedres fra 71 til 43, men dette funktionsniveau kan stadig betragtes som et handicap2. I betragtning af den ikke-besparende karakter af lemmer transplantation, skal de nuværende teknikker raffineres i dyremodeller til at tage det næste skridt i VCA.
Siden den første rottemodel af lemtransplantation i 19783er der udviklet mange innovative dyremodeller til at fremme feltet af VCA4, der omfatter vaskulære manchet anastomosesforat minimere den udløsendetid 5,6,heterotopisk osteomyokutane transplantationer for at minimere fysiologisk fornærmelse mod recipientdyret7,8,,9,10,11og nye immunologiske tilgange7,12,13,14. Den rotte model af ortotopisk højre bagbensbenseks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen om pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH) og blev godkendt af Northwestern University Animal Care and Use Committee. De specifikke procedurer blev udført under protokol IS00001663.
BEMÆRK: Der blev anvendt to stammer af rotter, Lewis rotter og August Copenhagen x Irish (ACI) rotter. Dyr blev opdelt i tre behandlingsgrupper: allotransplant uden immunundertrykkelse (ACI til Lewis), allotransplant med konventionel immunundertrykkelse (ACI til Lewis) og isotransplant (Lewis til Lewis eller ACI til ACI). Lewis er en indavlet stamme, mens ACI rotter repræsenterer en udavlet vildtype, derfor blev denne kombination valgt til at modellere den værst værre sag afvisning svar. Konventionel immunsuppression blev administreret subkutende enten som rapamycin 1 mg/kg fra postoperativ dag (POD) minus 1 til POD 28 eller som FK506 3 mg/kg fra POD 0 til POD 14 og derefter en gang ugentligt derefter. Både mandlige og kvindelige rotter var støtteberettigede modtagere fra 8 til 16 uger gamle, vejer mellem 250 og 400 gram på tidspunktet for operationen.
1. Donor højre bag lemmer høst
- Inducer generel anæstesi med 5% isofluran i ren ilt gennem en vaporizer med et passende skyllesystem.
- Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi med tå knivspids, og derefter bruge hårklippere til at trimme pelsen ud af højre baglem og højre lyske kirurgiske sted
- Ned-titrate isofluran gennem en gnaver næse kegle til 2-2,5%.
- Placer rotte liggende med spredte lemmer tapede ud til siderne på en drift bord med en varmepude nedenunder. Desinficere den hårløse hud med 70% sprit og beskytte det kirurgiske område med steril gaze.
- Ved hjælp af en passende mikrokirurgisk mikroskop, mikrokirurgiske instrumenter, og med nem adgang til bipolar og monopolær elektrokauteri, begynde dissektion.
- Brug saks til at gøre en omkreds hud / subkutane væv snit omkring højre hindlimb. Start i den lyskelige krølle medialt på nogenlunde samme niveau som lyskeledbånd og udvide dorsal-lateralt at fuldføre omkredsen indsnit.
- Efter at have udsat det muskulære lag direkte under snittet, dissekere og ætse de overfladiske epigastriske fartøjer, der fører fra det muskulære lag til den proksimale hud / subkutane flap netop oprettet.
- Afspejler den proksimalske flap superomedialt til lyske ledbånd og den distale hud / subkutan flap inferolaterally til knæet.
- Brug en wire retractor eller rullet gaze til at hjælpe med at eksponere feltet.
- Overhold, at den lyskelige anatomi af rotten ligner mennesker; fra lateral til mediale ligge nerve, arterie, og vene.
- Disseker ud femorale nerve, opdele det skarpt på inguinal ledbånd, proksimalt til bifurcation hvis det er muligt. Træk den delte nerve ringere, holde det sikkert ud af vejen, dækket under fugtig gaze.
- Hvis du vender opmærksomheden mod lårpulsåren og venen, skal du bruge 4 cm 7-0 silkebånd til atramatisk trække beholderne tilbage i stedet for at håndtere dem direkte.
- Ligate alle grene af femorale fartøjer, som de opstår med 7-0 silke bånd; opdele grenene mellem båndene. For meget små grene, bipolar ætsning kan anvendes i stedet for bånd.
BEMÆRK: Arterielle og venøse grene, som kræver opdeling omfatter den overfladiske circumflex iliaca og muskuløse fartøjer. Den overfladiske circumflex iliaca er normalt største og synes at dykke dybt som ville profunda femorale hos mennesker, men profunda er fraværende i rotten15. Mere distale grene af femorale fartøjer såsom den højeste genicular og saphenous gren normalt ikke kræver opdeling. - Systemisk injicere 500 internationale enheder af heparin gennem penis vene i en mandlig rotte donor. Brug den overfladiske epigastriske vene, hvis donorrotte er hunne.
- Lad heparinen cirkulere systemisk i 2 min. før du fortsætter med de næste trin.
- Ligate lårpulsåren med 7-0 silke bånd så proksimalt til lyskeledbånd som muligt og kløft mellem båndene.
- Svarende til arterien, ligate og opdele femorale vene.
- Afspejler både arterie og vene inferiorly, sikkert ud af vejen, dækket under fugtig gaze sammen med lårbensnerven dækket tidligere. Dissekere ventrale muskelgrupper, passe på at ætse eventuelle synlige fartøj, der opstår. Opmærksomhed på hæmostase her vil minimere modtageren blodtab efter reperfusion.
- Dybt til ventrale muskelgrupper, identificere og skarpt opdele iskiasnerven proksimalt til sine grene. Tre iskiasgrene er normalt synlige: tibial, peroneal og sural. Alle tre bør alle bevares i donorlem ud. En fjerde kutan gren ses typisk ikke i denne dissektion15,16.
- Afslut dividere de resterende ventrale og dorsale muskelgrupper i midten af låret niveau med omhyggelig hæmostase. Det kan være nødvendigt at trække lemmer medialt at fuldføre dividere musklerne.
- Transect lårbenet ved midten afshaft ved hjælp af en håndholdt trådløs roterende sav.
- Efter at have fjernet legemstransplantatet fra donoren skæres de silkebundne ender fra transplantatsidens lårpulsåre og venestubbe, hvorved karrene åbnes igen.
- Indsæt en 24-gauge angiocatheter i graft arterie stump og skyl transplantatet med 250 internationale enheder af heparin fortyndet i 5 ml iskold normal saltvand, ser det flyde ud klart gennem den åbnede vene.
- Skyl langsomt transplantatet i ca. 3 min. Overskydende kraftig skylning kan beskadige endotelet.
- Placer transplantatet i en kølet saltvandsskål indlejret i en isspand indtil transplantation.
- Aflive donorrotter med bilateral thoracotomy.
- Rengør alle kirurgiske instrumenter korrekt.
2. Modtager indfødte højre baglemmer amputation
- Anskaf anæstesi med isofluran ved 5 %, bekræft dybde, trim pelsen, placer dyret, og desinficer huden med alkohol som beskrevet for donorrottet.
- Isofluran med nedtikant til 2-2,5 % og indsprøjt subkutan præoperativ analgesi med buprenorphin 1,2 mg/kg og præoperativ profylakse med enrofloxacin 7,5 mg/kg.
- Samme som for donor, foretage en omkreds indsnit i den lyskeagtige krølle, afspejler hud flapper sikre hæmostase, og dissekere ud femorale nerve, arterie og vene, ligating den samme gren fartøjer som ovenfor.
- Del lårbensnerven mere distally end for donor, men proksimalt til bifurcation hvis det er muligt.
- Disseker ud femorale arterie og vene med tilstrækkelig plads til at klemme hver separat på niveau med den lyskelige ledbånd. Klem venen og arterien med mikrokirurgiske bulldog klemmer. Når fastspændt, opdele hver beholder skarpt med en saks.
- Divider ventrale og rygmuskler i låret i midten af låret niveau med omhyggelig hæmostase, trække lemmer medialt efter behov.
- Identificer og opdele iskiasnervener proksimale til deres gren punkter som ovenfor.
- Transect lårbenet ved midten afshaft ved hjælp af saven.
- Fjern modtageren indfødte højre bagben og bortskaffe korrekt.
- Ned-titrere isofluran til 1-1,5% gennem næsen kegle.
3. Donor til implantation af recipientlemmer
- Brug den håndholdte motorsav, barber alle uregelmæssigheder fra både donor og modtager lårben skåret ender.
- Ved hjælp af saven afskæres navetden af en 18-gauge nål, som bliver lårbenet intramedullær stang.
- Før man manipulerer knoglen, anvende en lille mængde knoglevoks til modtageren skærende ende af lårbensknoglen for at reducere marvsblødning under reaming processen.
- Coapt donor og modtager femorale knogler ved hjælp af 18-gauge nål som en intramedullær stang. Nogle kraft er nødvendig, men ikke ream enten knogle så vidt som til at fraktur cortex.
- Efter behov fjernes nålen og trimmes til en passende længde, så begge knogler passer glat over nålen uden nålen, der vises mellem knoglen.
- Placer en lille støtte såsom en pude af gaze eller en lille sten eller modellering ler under donor lemmer til at holde det ud spænding.
- Reproximat ventrale muskelgrupper med otte til ti enkle afbrudt 5-0 polyglactin suturer, således at transplantatet ikke roterer omkring lårbenet nålen. Dette giver lemmer stabilitet for anastomoses.
- Periodisk overrisle graft og kirurgisk felt med iskold saltvand for bedre visualisering og for at reducere varm iskæmisk reperfusion skade.
- Juster donor og modtager femorale arterier og anastomose dem i sidste ende mode ved hjælp af simple afbrudt 10-0 nylon sutur, undgå både spænding og looping. Arterien kræver i gennemsnit seks suturer.
- Svarende til arterien, anastomose donor og modtager femorale vener i sidste ende mode. Venen kræver seks til otte suturer.
BEMÆRK: Generøs kold saltvandsvanding, atraumatiske fartøj håndtering teknik, og forlader lange haler til at tjene som ophold suturer for fartøjet tilbagetrækning er vigtige værktøjer til effektiv mikrokirurgisk anastomoses. - Placer en lille mængde hæmostatisk cellulose pulver omkring begge anastomoses, og derefter fjerne de proksimale mikrokirurgiske bulldog klemmer på venen og arterien.
- Undersøg både anastomoses for god patency og flow. Brug vatpind pinde til forsigtigt prod venen og sikre god hæmostase af begge anastomoses. Hold trykket over blødende steder og placere mere hæmostatisk cellulose pulver, hvis det er nødvendigt. En anden sutur kan placeres gennem et blødende hul med risiko for "back-walling" nålen kun som en sidste udvej.
- Når begge anastomoses bekræftes tilfredsstillende, trimme eventuelle resterende lange ophold sutur haler kort til at matche de andre.
- Reposition rotten til venstre lateral decubitus position, bruge liberale elektrokauter for at opnå omhyggelig hæmostase af enhver reperfusion muskelblødning.
- Drej opmærksomheden på nerve anastomoses når muskel hæmostase er sikret. Trim tilbage eventuelle nerve cut ender, der vises laset.
- Reapproximate de dorsale muskelgrupper under iskiasnerven med simple afbrudt 5-0 polyglactin suturer.
- Genopproximat iskiasnerven. Otte til ti 10-0 nylon neurale simple afbrudt suturer vil normalt være tilstrækkeligt.
- Reapproximate den minder dorsale muskelgrupper og derefter lukke dorsale hud med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur.
- Flyt rotten tilbage til liggende position og reapproximate lårbensnerven. To til tre 10-0 nylon neurale simple afbrudt suturer vil normalt være tilstrækkeligt.
- Luk den ventrale hud med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur. Undgå overskydende sutur hale, som kan være irriterende for rotten, når vågen.
4. Postoperativ pleje
- Genvind dyr i deres bure med en varmepude under buret og let adgang til mad og vand, overvågning for tidlige komplikationer dagligt for den første uge.
- Der gives postoperativ analgesi med subkutan meloxicam daglig 1 mg/kg daglig injektion gennem POD 2. Giv postoperativ antibiotisk profylakse fortyndet enrofloxacin spray. Giv demotiverende for autotomy (selv-lemlæstelse) med Bitter Safe Mist sprøjtes to gange dagligt til transplantatet gennem POD 7.
- Opretholde transplanterede rotter i bure med andre rotter, at stimulere tilbagevenden til daglige aktiviteter og rehabilitere den transplanterede lemmer.
5. Postoperativ sensationstest
- Påfør Hargreaves test af termisk fornemmelse protokol, også beskrevetandetsteds 17,18.
- Læg rotten i testbeholderen og tillod det at akklimatisere i 20 minutter. Apparatets glas er bekræftet rent, og varmekilden bekræftet at arbejde med investigatorfinger.
- Før test, bekræfte, at rotten er vågen, og den testede pote er placeret over den infrarøde bevægelsesdetektor.
- Transmitter termisk energi ved intensitetsniveau 90. Tidsforsinkelse i dyret flytter sin pote væk fra varmekilden registreres. Hvis der ikke sker nogen bevægelse inden for 20 sekunder, afbrydes testen for at undgå personskade.
- Der skal gennemføres fem forsøg pr. testet lemmer, bortset fra den højeste og laveste værdi, før det gennemsnitlige tilbageholdelsestidstid for hvert dyr beregnes.
6. Postoperativ motorprøvning
- Ved hjælp af en gangart analyse løbebånd og integreret software analyse platform, vælge kandidater til løbebånd test på fire til seks uger efter operationen.
- Trim alle rotte tånegle en eller to dage før test.
- Akklimatisere dyr til testrummet i en time før test, og give mulighed for et minut af pre-test petting at berolige angst.
- Placering af rotten inde i løbebåndet, køre løbebåndet på forsøg med stigende hastighed, fra 10 cm / s, til 14 cm / s, til målet 18 cm / s. Hvis rotten er tilbageholdende og ikke kan lokkes til at gå, afbryde testen den dag for at undgå negativ konditionering. Lad de høje performere gå op til 24 cm/s.
- Skyl løbebåndsapparatet med 70% ethanol mellem testede dyr.
- Gangart parametre er output fra analyseplatformens proprietære software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse og helbredelse afhænger af omhyggelig kirurgisk teknik. Opmærksomhed på de vaskulære anastomoses og neurale anastomoses, samt knogle coaptation som beskrevet ovenfor er afgørende maksimere succesen af denne model. Operative design og repræsentative anastomotiske resultater er vist i figur 1.
Den samlede dødelighed var afhængig af immunsuppressionsstrategi, hvor størstedelen af de isotransplanlagte dyr nåede studiets endepunkt på 100-200 postoperative dage som det fremgår af figur 2. Når de er ude af det akutte postoperative vindue, kan behandlede allotransplanterede dyr opleve overlevelse op til 58 postoperative dage. Isografterede rotter levede på ubestemt tid i løbet af undersøgelsen, mens allograft transplanterede rotter havde variabel dødelighed fra rapamycin og FK506. Ud af de behandlinger FK506 fremmet den længste levedygtighed (dag 57), mens rapamycin var næstbedste (dag 20) over ubehandlet kontrol (dag 10).
Sensorisk og motorisk genvinding kan vises i figur 3. Dyr viste sig at have genvundet sensorisk nervefunktion af den transplanterede pote ved hjælp af Hargreaves apparatet ved dag 30. Dyr viste signifikant restitution med fire uger efter operationen (Aii). Dyr vist markante forbedringer i motorisk funktion af den transplanterede lemmer ved hjælp af en gangart analyse løbebånd og integreret software analyse platform. Eksempel gangart parameter baseret på specifikke lemmer er vist (Bii) og en Iskias funktion Index (SFI) er også præsenteret (Biii).
Figur 1: Operativt design er afbildet i tegneserieformat. (A) Rotten er vist med (B) højre bagben tværsnit skildrer (i) lårbensbundtet (nerve, arterie, og vene) (ii) iskiasnerven, og (iii) knoglen. (C)Repræsentative mikrografer fra operationsmikroskopet (donor til venstre og modtager til højre) blev taget af i) iskiasnerven anastomose (ii) lårbensnerven arterie, og vene anastomoses (vist fra top til bund), og (iii) den 18-gauge nål intramedullær stang-lårbensbenskoordination. Bemærk donorstrukturerne vises til venstre i hvert billede. Bemærk også lårbenet er vist før fuld coaptation, når begge knogler er imod, og nålen er skjult indeni. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dyrs overlevelse i procent som de dage, der er blevet præsenteret efter operationen (POD). Viste grupper omfatter isograft, allografter uden behandling, rapamycin og FK506 immunhæmmende lægemidler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sensorisk nervegendannelse demonstreres ved (A) Hargreaves, der tester transplanterede dyr hver på seks postoperative tidspunkter, og i (B) stadig skudt af løbebåndstest ved hjælp af DigiGait. (i) Repræsentative billeder vises med (ii) respektive potedata. Respektive farvekodede billeder af poter er også i 0,025 ms rammer. Digigate modeller (iii) er også vist. Betydningen blev bestemt ved hjælp af en envejs ANOVA med en Bonferroni's multiple sammenligning test og SEM, hvor n= 7 og p< 0,05. Disse særlige DigiGait-data blev taget fra et isogene dyr, der blev testet på postoperativ dag 28. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limb transplantation, under den bredere kategori af vaskulære komponent allotransplantation (VCA), har bredt anvendelig terapeutisk løfte endnu uopfyldt. De vigtigste vejspærringer ligger i uløste immunologiske spørgsmål unikke for VCA og neuromotoriske opsving teknikker, der anvendes i øjeblikket. Udvikling af nye teknikker vil afhænge af dyremodellering, der er fleksibel, robust og reproducerbar.
Mange dyremodeller er blevet etableret i VCA, hver med særlige fordele4. Ikke-menneskelige primatmodeller giver humane patienter attraktivover oversættelse, men er blevet hæmmet af omkostningsproblemer og toksiske immunsuppressionsniveauer, der kræves4. Hunde modeller er blevet set som en fordel for specifikke ligheder af muskuløs struktur som mennesker samt en mere erfaren immunsystem19,,20. Porcine modeller tilbyder fordelene ved en stor dyremodel, hvor immunsystemet er i stigende grad godt undersøgt21,22. Musemodelsystemer præsenterer de mest avancerede teknikker til undersøgelse af immunologi, men på trods af vigtige fremskridt inden for cuffed vaskulære mikrokirurgiske anastomose23, mus lemmer transplantation er stadig teknisk udfordrende og har nogle begrænsninger i funktionelle opsvingvurdering 5,24,25,26.
Rottemodeller i VCA er blevet udnyttet siden 19783, hvilket giver en moden platform til at undersøge både immunologiskeogneuromotoriske hypoteser6, 9,13,14,17,27,28,938. Modellen her kombinerer fordelene ved hindlimb orthotopic tilgang, sutur anastomose, nerve re-tilnærmelse, og potentiale for gangart analyse. Hindlimb orthotopic i modsætning til forelimb transplantation er mindre af en behæftelse til rotten under helbredelsesprocessen og giver mulighed for fortsat normal grooming og fodring adfærd post operativt. Sutur anastomose selvom omhyggelige potentielt kan tilbyde mindre teknisk konfunderende for langsigtede undersøgelser. Nervere tilnærmelse giver mulighed for fremtidig undersøgelse17,18 og gangart analyse. Denne protokol bygger på omhyggelige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker godt beskrevet andetsteds29, der kræver konstant opmærksomhed for at undgå de umiddelbare faldgruber af bedøvelsesdosis, anastomotisk svigt, anastomotisk trombose, og overdreven kirurgisk blodtab. Selv om flere mikrokirurger kan forbedre arbejdsgangen, har vi beskrevet en metode, hvor en enkelt driftsmikrokirurg kan opnå tilstrækkelig eksperimentel produktion.
Autotomi eller selv-lemlæstelse har været et fænomen bemærket i flere mikrokirurgiske modeller, og det har været en hypotese at omvendt korrelere med nerve healing30,31. Autotomy var generelt kontrolleret i denne model, muligvis relaterede omhyggelige neurale anastomotiske teknik. Autotomi faldt også længere ind i indlæringskurven. Bitter Safe Mist var et værdifuldt supplement til at kontrollere dette fænomen.
Ganganalyse hos rotter er blevet undersøgt for flere modeller af skade32,33,34, mest relevant for iskiasnerven skade35,36. Rotter selv når ikke lemmer transplantation modtagere er kendt for at være heterogene emner for gangart analyse, og efterforskere stadig debat, som analyseparametre beskriver inddrivelse37. I denne model har vi beskrevet flere metoder til at opnå de bedste data fra transplanterede modtagere, der er villige og i stand til at gå. Forud for valget af tilstrækkelige vandrere var ikke prædiktiv for postoperativt samarbejde. Selv om dyrene er i stand til at bevæge sig om deres boliger, så snart flere timer efter operationen, de er ikke klar til løbebånd ambulation indtil mindst fire til seks uger efter operationen.
En protokol evne til at måle nerve opsving i VCA er afhængig af sin strategi for rehabilitering. Denne protokol udtrykkeligt fremmer transplantation modtagere interagere med andre rotter som tilskyndelse til at fungere. Denne strategi er bevidste om vigtigheden af at modellere rehabilitering, men er enkel, økonomisk, og er stort set standard. Fremtidige strategier kan omfatte mere aktiv rehabilitering såsom løbebånd uddannelse.
De immunologiske teknikker, der gælder for denne model, er uden for rammerne af denne diskussion, men især, at sammenligne isotransplant versus allotransplanterede dyr giver en nyttig kontrol til at differentiere allograftimmunologiske fænomener og afvisning fra den iskæmiske reperfusion skade, inflammation, revaskularisering, og post-kirurgisk infektion processer iboende i selve transplantationen. Isotransplants giver en lignende kontrol for nervefunktionsundersøgelser af samme grund.
Ved hjælp af denne platform, efterforskere kan være i stand til at fremme både VCA immunologi og neuromotorisk opsving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Frankel Foundation og Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operation RESTORE). Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medicial Sciences af National Institutes of Health under Award Nummer T32GM008152. Dette arbejde blev støttet af Northwestern University Microsurgery Core og Behavioral Fænotypebestemmelse Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al.
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
