Summary

Tar neste trinn: en neural coaptasjon ortotopisk hind lem transplantasjon modell for å maksimere funksjonell utvinning i rotte

Published: August 30, 2020
doi:

Summary

Denne protokollen presenterer en robust, reproduserbar modell av vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) rettet mot samtidig studie av immunologi og funksjonell utvinning. Tiden investert i omhyggelig teknikk i en høyre midten av låret baklem ortotopisk transplantasjon med håndsydd vaskulære anastomoser og neural coaptation gir evnen til å studere funksjonell utvinning.

Abstract

Lemtransplantasjon spesielt og vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) generelt har bredt terapeutisk løfte som har blitt stymied av gjeldende begrensninger i immunsuppresjon og funksjonell nevromotorisk utvinning. Mange dyremodeller er utviklet for å studere unike egenskaper ved VCA, men her presenterer vi en robust reproduserbar modell av ortotopisk bakbenstransplantasjon hos rotter designet for å samtidig undersøke begge aspektene av gjeldende VCA-begrensning: immunsuppresjonsstrategier og funksjonell nevromotorisk gjenoppretting. Kjernen i modellen hviler en forpliktelse til grundige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker som håndsydd vaskulære anastomoser og håndsydd nevrale coaptation av lårnerven og isjiasnerven. Denne tilnærmingen gir holdbare lemrekonstruksjoner som gjør det mulig for lengre levende dyr som er i stand til rehabilitering, gjenopptakelse av daglige aktiviteter og funksjonell testing. Med kortvarig behandling av konvensjonelle immunsuppressive midler overlevde allotransplantede dyr opptil 70 dager etter transplantasjon, og isotransplanterte dyr gir langvarige kontroller utover 200 dager etter operativt. Bevis på nevrologisk funksjonell gjenoppretting er tilstede innen 30 dager etter operativt. Denne modellen gir ikke bare en nyttig plattform for avhør immunologiske spørsmål som er unike for VCA og nerveregenerering, men gir også mulighet for in vivo-testing av nye terapeutiske strategier spesielt skreddersydd for VCA.

Introduction

Lemtransplantasjon under den bredere kategorien av vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) eller komposittvev allotransplant (CTA) har ennå ikke oppfylt sitt terapeutiske løfte. Siden de første vellykkede menneskelige håndtransplantasjoner i Lyon, Frankrike og Louisville, Kentucky i 1998 og 1999, over 100 øvre ekstremiteter transplantasjoner har blitt utført over hele verden i nøye utvalgtepasienter 1. Større anvendelighet har blitt hindret av betydelig immunsuppresjon og begrenset funksjonell nevromotorisk gjenoppretting. Nåværende immunsuppresjonsstrategier resulterer i 85% forekomst av akutt avvisning i møte med 77% forekomst av opportunistisk infeksjon2. På den annen side oppstår funksjonell gjenoppretting etter håndtransplantasjon; gjennomsnittlig funksjonshemming av arm skulder og hånd (DASH) score forbedre fra 71 til 43, men at funksjonsnivået kan fortsatt kvalifisere som enfunksjonshemming 2. Gitt nonlife redde natur lem transplantasjon, gjeldende teknikker må raffineres i dyremodeller for å ta neste skritt i VCA.

Siden den første rottemodellen av lemtransplantasjon i 19783,har mange innovative dyremodeller blitt utviklet for å fremme feltet VCA4, som omfatter vaskulære mansjett anastomoser for å minimere operativ tid5,6, heteroto osteomyokutane transplantasjoner for å minimere fysiologisk fornærmelse mot mottakerdyret7,8,9,,10,,11og nye immunologiske tilnærminger7,12,13,14. Rottemodellen av ortotopiske høyre bakben midt på lårtransplantasjonen som presenteres her, understreker omhyggelige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker som håndsydd vaskulære anastomoser og nevrale coaptation som en forhåndsinvestering i en robust, reproduserbar modellplattform for samtidig å undersøke begge aspektene av gjeldende VCA-begrensning: immunsuppresjonsstrategier og funksjonell nevromotorisk gjenoppretting.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health (NIH) og ble godkjent av Northwestern University Animal Care and Use Committee. De spesifikke prosedyrene ble utført under protokollen IS00001663. MERK: To rotter ble brukt, Lewis rotter og August Copenhagen x Irish (ACI) rotter. Dyr ble delt inn i tre behandlingsgrupper: allotransplant uten immunundertrykkelse (ACI til Lewis), allotransplant med konvensjonell immunsuppres…

Representative Results

Overlevelse og gjenoppretting avhenger av omhyggelig kirurgisk teknikk. Oppmerksomhet til vaskulære anastomoser og nevrale anastomoser, samt beinsyaptasjonen som beskrevet ovenfor, er avgjørende for å maksimere suksessen til denne modellen. Operativ design og representative anastomotiske resultater er vist i figur 1. Samlet dødelighet var avhengig av immunsuppresjonsstrategi, med de fleste isotransplanterte dyr som oppnår studieendepunktet på 100-200 postope…

Discussion

Lemtransplantasjon, under den bredere kategorien av vaskularisert komponent allotransplantasjon (VCA), har allment anvendelig terapeutisk løfte som ennå ikke oppfylt. De viktigste veisperringene ligger i uløste immunologiske problemer som er unike for VCA og nevromotoriske utvinningsteknikker som brukes for tiden. Utvikling av nye teknikker vil avhenge av dyremodellering som er fleksibel, robust og reproduserbar.

Mange dyremodeller er etablert i VCA, hver med spesifikke fordeler<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av Frankel Foundation og Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operation RESTORE). Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medicial Sciences of the National Institutes of Health under Award Number T32GM008152. Dette arbeidet ble støttet av Northwestern University Microsurgery Core og Behavioral Phenotyping Core.

Materials

Anesthesia machine Vet Equip 911103
0.5cc syringe Exel 26018
18-gauge needle BD 305196
1cc syringe BD 309659
22-gauge needle BD 305156
24-gauge angiocatheter Sur-Vet SROX2419V
25-gauge needle Exel 26403
3 cc syringe BD 309657
5cc syringe Exel 26230
Alcohol Fisher Scientific HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber Vet Equip 941443
Anesthetic gas scavenger system Vet Equip 931401
Bipolar electrocautery Aura 26-500
Bitter Spray Mist Henry Schein 5553
Bone wax CP Medical CPB31A
Breathing circuit Vet Equip 921413
Buprenophine Reckitt Benckiser 12496075705
Castro-Viejos needle drivers Roboz RS-6416
Cordless rotary saw Dremel 8050-N/18
Cotton swab stick Fisher Scientific 23-400-101 For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software Mouse Specifics MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4) Roboz RS-4972
Dumont forceps (#5) Roboz RS-5035
Enrofloxacin Norbrook ANADA 200-495
FK-506 Astellas 301601
Gauze Kendall 1903
Gauze Covidien 8044
Gloves Microflex DGP-350-M
Hair clippers Oster 078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery Bovie AA00
Hargreaves Apparatus Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy 37370
Heating pad Walgreens 126987
Heparin Fresenius Kabi 42592K
Hot plate Corning PC-351 For warming resusscitation fluid
Isoflurane Henry Schein 29405
Lactated ringers Baxter 2B2074
Large petri dish Fisher Scientific FB0875713 For donor graft while in chilled saline
Meloxicam Henry Schein 49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors Roboz RS-5841
Microfibrillar collagen powder BD 1010590 For hemostasis
Microvascular clips Roboz RS-5420
Normal saline Baxter 2F7124
Opthalmic lube Dechra IS4398
Rapmycin MedChem Express HY-10219
Small petri dish Fisher Scientific FB0875713A For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes ProAdvantage N207100
Surgical gown Cardinal Health 9511
Surgical mask 3M 1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD Zeiss 169756
Surgical microscope, Universal S3 Zeiss 243188
Suture 10-0 nylon Covidien N2512
Suture 5-0 vicryl Ethicon J213H
Suture 7-0 silk tie Teleflex 103-S
Tape 3M 1530-1
Ultrasonic instrument cleaner Roboz RS-9911
Vessel dilation forceps Roboz RS-5047

References

  1. Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
  2. Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
  3. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
  4. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
  5. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
  6. Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
  7. Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
  8. Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
  9. Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  10. Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
  11. Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
  12. Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
  13. Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
  14. Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
  15. Greene, E. C. . Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , 27 (1935).
  16. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
  17. Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
  18. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  19. Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
  20. Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
  21. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
  22. Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
  23. Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
  24. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
  25. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
  26. Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
  27. Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
  28. Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
  29. Georgiade, N. G., Serafin, D. . A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
  30. Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
  31. Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
  32. Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
  33. Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  34. Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
  35. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
  36. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
  37. Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
  38. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).

Play Video

Cite This Article
Zheng, F., Tully, A., Koss, K. M., Zhang, X., Qiu, L., Wang, J., Naved, B. A., Ivancic, D. Z., Mathew, J. M., Wertheim, J. A., Zhang, Z. J. Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat. J. Vis. Exp. (162), e60777, doi:10.3791/60777 (2020).

View Video