Summary
यह प्रोटोकॉल एक उपकरण प्रस्तुत करता है जो 100% ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति प्रणाली में कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार को बढ़ावा देने के लिए पीआरपी का उत्पादन करता है।
Abstract
वर्तमान में त्वचा की मरम्मत के लिए ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग में बहुत नैदानिक रुचि है। ज्यादातर मामलों में, विट्रो में त्वचा कोशिकाओं की संस्कृति की आवश्यकता होती है। हालांकि, ज़ेनोजेनिक या एलोजेनिक कल्चर मीडिया का उपयोग करने वाले सेल कल्चर के कुछ नुकसान हैं (यानी, संक्रामक एजेंट संचरण या धीमी सेल विस्तार का जोखिम)। यहां, एक रोगी के अपने प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) का उपयोग करके विट्रो में मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक ऑटोलॉगस कल्चर सिस्टम विकसित किया गया है। मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट ्स को एब्डोमिनोप्लास्टी से गुजरते समय रोगी से अलग किया जाता है। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) या पीआरपी के साथ पूरक माध्यम का उपयोग करके 7 दिनों तक संस्कृतियों का पालन किया जाता है। पीआरपी तैयारी, प्रसार और फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव में रक्त कोशिका सामग्री का मूल्यांकन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक समर्पित चिकित्सा उपकरण का उपयोग करके पीआरपी की मानकीकृत, गैर-सक्रिय तैयारी प्राप्त करने की विधि का वर्णन करता है। तैयारी के लिए केवल एक चिकित्सा उपकरण (क्यूटसेल-पीआरपी) और सेंट्रीफ्यूज की आवश्यकता होती है। यह उपकरण पर्याप्त चिकित्सा अभ्यास स्थितियों के तहत उपयुक्त है और एक-चरण, एपिरोजेनिक और बाँझ बंद प्रणाली है जिसके लिए 5 मिनट के लिए 1,500 x g के एकल, नरम स्पिन सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, रक्त घटक अलग हो जाते हैं, और प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा आसानी से एकत्र हो जाता है। यह उपकरण पीआरपी की त्वरित, सुसंगत और मानकीकृत तैयारी की अनुमति देता है जिसे मानव कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार के लिए सेल कल्चर पूरक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां प्राप्त पीआरपी में लाल और सफेद रक्त कोशिकाओं के अधिमान्य निष्कासन के साथ पूरे रक्त की तुलना में 1.5 गुना प्लेटलेट एकाग्रता होती है। यह दिखाया गया है कि पीआरपी एफबीएस (7.7x) की तुलना में सेल प्रसार में एक बढ़ावा देने वाला प्रभाव प्रस्तुत करता है और यह कि फाइब्रोब्लास्ट पीआरपी उपचार पर सक्रिय होते हैं।
Introduction
पुनर्योजी चिकित्सा का उद्देश्य उम्र, बीमारी या आघात के साथ-साथ जन्मजात दोषों को ठीक करने से क्षतिग्रस्त ऊतकों और अंगों को ठीक करना या बदलना है। ऑटोलॉगस थेरेपी में, कोशिकाओं या ऊतक को एक रोगी से वापस ले लिया जाता है, विस्तारित या संशोधित किया जाता है, फिर दाता को फिर से पेश किया जाता है। चिकित्सीय के इस रूप में त्वचाविज्ञान के क्षेत्र में व्यापक क्षमता है1. ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट थेरेपी में, एक रोगी के फाइब्रोब्लास्ट को सुसंस्कृत किया जाता है और झुर्रियों, राइटिड्स या मुँहासे के निशान के इलाज के लिए पुन: इंजेक्ट किया जाता है। चूंकि फाइब्रोब्लास्ट डर्मिस में मुख्य कार्यात्मक कोशिकाएं हैं, इसलिए चेहरे के कायाकल्प में अन्य उपचारों की तुलना में ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट का इंजेक्शन अधिक फायदेमंद हो सकताहै।
त्वचा में, फाइब्रोब्लास्ट बाह्य प्रोटीन (यानी, कोलेजन, इलास्टिन, हाइलूरोनिक एसिड और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स) के संश्लेषण और स्राव के लिए जिम्मेदार होते हैं। वे विकास कारकों को भी जारी करते हैं जो सामान्य त्वचा होमियोस्टैसिस और घाव भरने में सेल फ़ंक्शन, माइग्रेशन और सेल-मैट्रिक्स / सेल-सेल इंटरैक्शन को नियंत्रित करतेहैं। त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स को पहले से ही त्वचा के घाव भरने के लिए एक संभावित नैदानिक सेल थेरेपी के रूप में पेश किया गया है4, ऊतक पुनर्जनन5, या एस्थेटिक और प्लास्टिक सर्जरी प्रक्रियाओं में त्वचीय भराव6. कुछ अध्ययनों से यह भी पता चलता है कि, पुनर्योजी चिकित्सा के संदर्भ में, फाइब्रोब्लास्ट मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की तुलना में अधिक व्यावहारिक और प्रभावी सेल थेरेपी हो सकतीहै।
नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए फाइब्रोब्लास्ट की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, सेल विस्तार आमतौर पर अनिवार्य होता है। इन विट्रो सेल कल्चर को सेल आसंजन और प्रसार का समर्थन करने के लिए विकास कारकों, प्रोटीन और एंजाइमों के साथ पूरक बेसल माध्यम की आवश्यकता होती है। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) सेल कल्चर मीडिया के लिए एक आम पूरक है, क्योंकि भ्रूण रक्त 1) वयस्क रक्त की तुलना में विकास कारकों में समृद्ध है और 2) कम एंटीबॉडी सामग्रीप्रस्तुत करता है। जैसे-जैसे सेल थेरेपी आगे बढ़ती है, शास्त्रीय सेल संस्कृति स्थितियों की सुरक्षा के बारे में चिंताएं हैं जिसमें एफबीएस को संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। इसके अलावा, अब एफबीएस को विकल्प9 के साथ बदलने की प्रवृत्ति है। कई एफबीएस विकल्पों ने आशाजनक परिणाम दिखाए हैं।
प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) विकल्प को यहां चुना गया है, और हमने पीआरपी की मानकीकृत तैयारी का उत्पादन करने के लिए एक चिकित्सा उपकरण विकसित किया है, जिसका नाम क्यूटसेल-पीआरपी है। इस उपकरण का इच्छित उपयोग जीएमपी स्थितियों के तहत ऑटोलॉगस कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार के लिए एक संस्कृति मीडिया पूरक के रूप में उपयोग किए जाने के लिए ऑटोलॉगस पीआरपी की तैयारी है।
पीआरपी को प्लाज्मा में एक केंद्रित प्लेटलेट निलंबन के रूप में परिभाषित किया गया है। क्योंकि कई तैयारी प्रोटोकॉल हैं, जो 1) आवश्यक रक्त की मात्रा, 2) उपयोग किए गए उपकरणों के प्रकार, और 3) सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल में भिन्न होते हैं, परिणामस्वरूप प्लेटलेट सांद्रता रक्त बेसलाइन मूल्य से थोड़ा ऊपर से 10 गुना से अधिक तक भिन्न होती है। इसके अलावा, पीआरपी तैयारी में लाल और सफेद रक्त कोशिका संदूषण के परिवर्तनीय स्तर होते हैं। शब्दावली "पीआरपी" का उपयोग इस प्रकार उन उत्पादों का वर्णन करने के लिए किया जाता है जो उनकी जैविक संरचना और संभावित चिकित्सीय प्रभावों में बहुत भिन्न होते हैं।
अधिकांश अध्ययनों में, एफबीएस प्रतिस्थापन पीआरपी की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो सक्रिय होता है (थ्रोम्बिन या कैल्शियम द्वारा)। यह कृत्रिम सक्रियण 15 मिनट से 24 घंटे 11 तक प्लेटलेट विकास कारकों की तत्काल और महत्वपूर्ण रिहाई को उकसाताहै। इसलिए, यह माना जाता है कि प्लेटलेट सक्रियण सेल संस्कृतियों में अनुप्रयोगों के लिए अवांछनीय है, जिसमें क्रमिक प्लेटलेट अपघटन से विकास कारकों की धीमी रिहाई की आवश्यकता होती है।
पीआरपी थेरेपी में केंद्रित प्लाज्मा12 में ऑटोलॉगस प्लेटलेट्स की तैयारी शामिल है। इष्टतम प्लेटलेट एकाग्रता स्पष्ट नहीं है, और पीआरपी13 तैयार करने के लिए वाणिज्यिक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है। मानकीकरण की यह कमी अध्ययनों के बीच असंगति के परिणामस्वरूप होती है और इंजेक्शन की खुराक और समय के बारे में एक ब्लैक बॉक्स का कारण बनी है। यह प्रोटोकॉल 100% ऑटोलॉगस एक्स विवो कल्चर मॉडल में त्वचा फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार करने के लिए इस समर्पित पीआरपी डिवाइस का उपयोग करके ऑटोलॉगस पीआरपी प्राप्त करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
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Protocol
अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा का अनुपालन करता है, और सभी रोगियों ने अध्ययन में भाग लेने से पहले लिखित सूचित सहमति प्रदान की। जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पतालों (जिनेवा, स्विट्जरलैंड) में प्लास्टिक, पुनर्निर्माण और सौंदर्य सर्जरी विभाग में एब्डोमिनोप्लास्टी से गुजरने वाली स्वस्थ महिलाओं से त्वचा के नमूने प्राप्त किए जाते हैं। प्रक्रिया हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुरूप है और स्थानीय संस्थागत नैतिकता समिति (प्रोटोकॉल # 3126) द्वारा अनुमोदित की गई थी।
1. पीआरपी की तैयारी
नोट: क्यूटसेल-पीआरपी ट्यूब (सामग्री की तालिका) एक बंद सर्किट सिस्टम में रोगी के रक्त की एक छोटी मात्रा से पीआरपी की तेजी से तैयारी के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।
- पूरे रक्त का संग्रह
नोट: चिकित्सा संस्थान के संग्रह प्रोटोकॉल के अनुसार, पीआरपी ट्यूब से सीधे जुड़े तितली सुई का उपयोग करके हाथ की परिधीय नस से ऑटोलॉगस रक्त की कटाई करें। यदि रोगी संज्ञाहरण के अधीन है तो रक्त को सीधे शिरापरक प्रवेशनी के माध्यम से वापस लिया जा सकता है।- ट्यूब ब्लिस्टर पैक खोलें। शिरापरक पंचर करें और पूरे रक्त के साथ पीआरपी ट्यूबों की वांछित संख्या भरें। ट्यूबों के भीतर वैक्यूम रक्त की आवश्यक मात्रा (~ 10 एमएल) के स्वचालित संग्रह को सक्षम करेगा।
- एंटीकोआगुलेंट के साथ रक्त को मिलाने के लिए ट्यूबों को कई बार उल्टा करें।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा 2) के अंदर, रक्त कोशिका संख्या की गिनती के लिए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके कुल रक्त के 100 μL को हटा दें।
- सेंट्रीफ्यूजेशन
नोट: सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज शुरू करने से पहले सही ढंग से संतुलित है।- एक बार पीआरपी ट्यूबों में रक्त एकत्र हो जाने के बाद, यदि आवश्यक हो, तो पीआरपी ट्यूब में रक्त के समान स्तर तक पानी के साथ एक संतुलित ट्यूब (अलग से आपूर्ति की गई) तैयार करें। भरे हुए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज में एक दूसरे के विपरीत रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मशीन संतुलित है।
- 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
नोट: सेंट्रीफ्यूज निर्माता के निर्देशों के अनुसार संबंधित आरपीएम गति सेट करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, रक्त अंशीकृत हो जाएगा। लाल और सफेद रक्त कोशिकाएं जेल के नीचे फंस जाती हैं, और प्लेटलेट्स जेल की सतह पर बस जाते हैं (चित्रा 1)।
- प्लाज्मा सुपरनैटेंट में प्लेटलेट जमा को फिर से निलंबित करने के लिए पीआरपी ट्यूब 20 एक्स को धीरे से उलट दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेटलेट्स जेल से पूरी तरह से अलग हैं। प्लाज्मा को स्पष्ट और पारदर्शी से टर्बिड में बदलना चाहिए। यदि प्लेटलेट समुच्चय मौजूद हैं, तो उन्हें प्लाज्मा के साथ एकत्र किया जाना चाहिए। - पीआरपी एकत्र करने के लिए, 10 एमएल सिरिंज से जुड़े सिरिंज ट्रांसफर डिवाइस का उपयोग करके ट्यूब से प्लाज्मा समाधान लें।
नोट: प्रत्येक ट्यूब से लगभग 5 एमएल पीआरपी प्राप्त किया जाएगा। पीआरपी समाधान अब अंतिम माध्यम की तैयारी में मिश्रण करने के लिए तैयार है। समाधान को सुरक्षा कैबिनेट के तहत कमरे के तापमान (आरटी) पर रखा जा सकता है जब तक कि हेमेटोलॉजी विश्लेषक और उपयोग से जुड़े भविष्य के कदम नहीं होते हैं। - पीआरपी का उपयोग करने से पहले, एक स्वचालित हेमेटोलॉजी विश्लेषक (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्लेटलेट एकाग्रता, औसत प्लेटलेट मात्रा और लाल और सफेद रक्त कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। ऐसा करने के लिए, सावधानीपूर्वक समाधान के 100 μL को निकालें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: पीआरपी का उपयोग 5-20% v / v के बीच एकाग्रता पर एक ऑटोलॉगस संस्कृति पूरक के रूप में किया जाता है। प्रत्येक सेल लाइन के लिए पीआरपी की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने की आवश्यकता है। फाइब्रिन के थक्के के गठन को रोकने के लिए, अंतिम संस्कृति मीडिया को 2 यू / एमएल हेपरिन के साथ पूरक किया जाना चाहिए।
2. एफबीएस- या पीआरपी-पूरक मीडिया में ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट और संस्कृति का अलगाव
- 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में धीरे से हिलाकर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में त्वचा के नमूने धोएं।
- यदि त्वचा का नमूना अपेक्षाकृत बड़ा है (>10 सेमी2), तो नमूने को 150 सेमी2 ऊतक संवर्धन डिश (एपिडर्मल साइड नीचे) के ढक्कन पर रखें। बल और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके चमड़े के नीचे वसा ऊतक को हटा दें। ऊतक को सूखने से रोकने के लिए, पीबीएस में हर कुछ मिनट में ऊतक को कुल्ला करें।
नोट: छोटे नमूने के लिए छोटे ऊतक संस्कृति डिश का उपयोग करें। - जब वसा ट्रिमिंग पूरी हो जाती है, तो बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को लगभग 0.5 सेमी x 1.5 सेमी स्ट्रिप्स में काट लें।
- एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल कोलेजनेज-डिस्पेज़ मिश्रण (सामग्री की तालिका; 14 वुंसच यूनिट / एमएल) जोड़ें।
- कटे हुए ऊतक को ट्यूब में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊतक के टुकड़े समाधान में डूबे हुए हैं। ट्यूब को सुरक्षित रूप से कैप करें।
- ट्यूबों को 150 मिनट के लिए कक्षीय झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक युक्त ट्यूब को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
- बायोसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ 100 मिमी कल्चर डिश के ढक्कन को उल्टा रखें। पचे हुए ऊतक समाधान को 100 मिमी कल्चर डिश के तल पर स्थानांतरित करें, बिना छींटे के। यदि ऊतक का कोई भी टुकड़ा ट्यूब में रहता है, तो ऊतक के टुकड़ों को 100 मिमी कल्चर डिश के तल में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ 1 एमएल पिपेट या बाँझ फोर्स का उपयोग करें।
- एपिडर्मिस पट्टी के सामने होने के साथ, दो जोड़े बल का उपयोग करके डर्मिस से बरकरार एपिडर्मिस शीट को अलग करें। ऊतक पट्टी के डर्मिस को बल की एक जोड़ी के साथ पकड़ें और एपिडर्मिस के किनारे को बल की एक और जोड़ी के साथ पकड़ें। डर्मिस और एपिडर्मिस को दो टुकड़ों में अलग-अलग छीलें, अलग किए गए टुकड़ों को एक ही ढक्कन पर रखें। इस चरण को जल्दी से करने की कोशिश करें और ऊतक के प्रत्येक टुकड़े के लिए हेरफेर दोहराएं।
- त्वचीय टुकड़ों को पीबीएस युक्त एक नए 100 मिमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
- प्रयोगशाला बल का उपयोग करके, त्वचीय टुकड़ों को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 0.3% ट्रिप्सिन / पीबीएस के 3 एमएल के साथ रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और ट्यूब को हर 2-3 मिनट में कई बार उलट दें।
- एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, 3-5 एमएल बर्फ-ठंडा पूर्ण विकास माध्यम जोड़ें (डलबेको का संशोधित ईगल माध्यम [डीएमईएम] या आरपीएमआई जिसमें 10% एफबीएस होता है)। वोर्टेक्स ट्यूब को कई बार जोर से हिलाता है। त्वचीय मलबे को हटाने के लिए फाइब्रोब्लास्ट निलंबन को 85 μm नायलॉन जाल (50 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर रखा गया) के माध्यम से फ़िल्टर करें।
- सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 150 x g पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और पूर्ण विकास माध्यम के 100-1,000 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
- सेल निलंबन के साथ मिश्रित ट्रिपैन ब्लू (एक्स 2 का कमजोर पड़ने वाला कारक) का उपयोग करके, हेमोसाइटोमीटर के कक्ष को भरकर कुल और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
नोट: सेल व्यवहार्यता एंजाइमेटिक पाचन के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों पर निर्भर करती है। सेल रिकवरी और सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, त्वचा के नमूने को छोटे टुकड़ों में काटा जा सकता है। - प्लेट 3-10 x 104 कोशिकाएं 5 एमएल पूर्ण एफबीएस विकास माध्यम (डीएमईएम, 10% एफबीएस गर्मी-56 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए निष्क्रिय, 1% 1 एम एचईपीईएस बफर समाधान, 1% 100 एक्स गैर-अमीनो एसिड मिश्रण, 1% 100 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% 100 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% 100 एक्स सोडियम पाइरूवेट) 25 सेमी2 ऊतक कल्चर फ्लास्क में। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: व्यवहार्य फाइब्रोब्लास्ट 24 घंटे के भीतर फ्लास्क से जुड़ जाएंगे और 2-3 दिनों में स्पिंडल-आकार का प्रदर्शन करना शुरू कर देंगे। - दूसरे दिन, गैर-अनुगामी कोशिकाओं वाले माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा माध्यम जोड़ें।
नोट: चूंकि संस्कृति माध्यम में मृत कोशिकाएं व्यवहार्य फाइब्रोब्लास्ट के विकास को प्रभावित करती हैं, इसलिए गैर-अनुगामी, मृत कोशिकाओं को संस्कृति से हटा दिया जाना चाहिए। - हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें जब तक कि संस्कृति 70-80% सामंजस्य तक नहीं पहुंच जाती।
- फाइब्रोब्लास्ट्स की कटाई के लिए, पीबीएस के साथ धोएं और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
- प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, 3-5 एमएल गर्म पूर्ण विकास माध्यम (डीएमईएम या आरपीएमआई जिसमें 10% एफबीएस होता है) जोड़ें। हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करने के लिए सेल निलंबन का एक एलिकोट लें। 200 x g पर 5 मिनट के लिए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दें।
- पीआरपी माध्यम (डीएमईएम, 20% पीआरपी, 1% 1 एम एचईपीईएस बफर समाधान, 1% 100 एक्स गैर-अमीनो एसिड मिश्रण, 1% 100 एक्स एल-ग्लूटामाइन, 1% 100 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% 100 एक्स सोडियम पाइरूवेट, 2 यू / एमएल हेपरिन) में फाइब्रोब्लास्ट को कल्चर करें।
नोट: अनुशंसित न्यूनतम सेल घनत्व 4,000 व्यवहार्य कोशिकाएं / सेमी2 है। - फाइब्रोब्लास्ट प्रसार पर पीआरपी प्रभावों का आकलन करने के लिए, विभिन्न पीआरपी सांद्रता (1%, 5%, 20%, 30%,40 %, और 50%) के साथ पीआरपी माध्यम में प्रति अच्छी तरह से 8 x 10 3 कोशिकाओं के घनत्व पर 24 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज फाइब्रोब्लास्ट (मार्ग 2) और 2 यू / एमएल हेपरिन या शास्त्रीय संस्कृति मध्यम स्थितियों (10% एफबीएस) के तहत। संस्कृति के 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण डाई (सेल प्रसार बैंगनी) जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रसार का आकलन करें।
- साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए, 96 अच्छी तरह से काले / स्पष्ट फ्लैट बॉटमप्लेटों में बीज कोशिकाएं पूर्ण एफबीएस विकास डीएमईएम (चरण 2.14 देखें) में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर 24 घंटे के लिए 0.5% एफबीएस के साथ पूरक हैं। 7 दिनों के लिए 10% एफबीएस या विभिन्न पीआरपी सांद्रता (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, और 50%) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
- फाइब्रोब्लास्ट्स को 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें और आरटी में 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमेबिलाइज करें। फाइब्रोब्लास्ट्स को 5 यू / एमएल फेलोइडिन के 50 एमएल के साथ दाग दें, पीबीएस के साथ 2 एक्स धोएं, और 5 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल 4', 6-डायमिडिनो -2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के 50 एमएल के साथ चिह्नित करें। साइटेशन 3 सेल इमेजिंग मल्टीमोड रीडर (बायोटेक) का उपयोग फेलोइडिन धुंधला होने की कल्पना करने के लिए किया गया था।
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Representative Results
यह पेटेंट तकनीक एक सरल, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चिकित्सा उपकरण है जिसका उपयोग मानकीकृत पीआरपी तैयारी का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। यह एक-चरण, पूरी तरह से बंद प्रणाली है जो 1,500 x g (अलग जेल तकनीक के कारण) पर सेंट्रीफ्यूजेशन के 5 मिनट के बाद शिरापरक पूरे रक्त से पीआरपी की तैयारी की अनुमति देती है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्राप्त पीआरपी को लाल और सफेद रक्त कोशिकाओं से साफ किया जाता है, जो जेल के नीचे बैठते हैं। कई ट्यूब इनवर्शन के बाद, जेल के शीर्ष पर प्लेटलेट्स प्लाज्मा में फिर से निलंबित हो जाते हैं, और पीआरपी उपयोग करने के लिए तैयार होता है (चित्रा 1)।
तैयारी में रक्त कोशिका सामग्री की प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए, हेमेटोलॉजी विश्लेषक के साथ 10 अलग-अलग रोगियों से पूरे रक्त और पीआरपी नमूनों का विश्लेषण किया गया था। डिवाइस के साथ पूरे रक्त के प्रसंस्करण के बाद, लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और सफेद रक्त कोशिकाओं (डब्ल्यूबीसी) के बहुमत को हटा दिया गया था। पूरे रक्त में पाए जाने वाले शारीरिक एकाग्रता की तुलना में औसत प्लेटलेट एकाग्रता में 1.5 गुना वृद्धि देखी गई (चित्रा 2)।
ऑटोलॉगस कल्चर सेट-अप में, शास्त्रीय संस्कृति मध्यम स्थिति (10% एफबीएस) की तुलना में पीआरपी सांद्रता (1-50%) में वृद्धि की उपस्थिति में एक रोगी के पृथक फाइब्रोब्लास्ट की खेती की गई थी। मीडिया को बदले बिना 7 दिनों की संस्कृति के बाद, 20% पीआरपी के साथ प्रमुख संस्कृतियों ने व्यवहार्य फाइब्रोब्लास्ट्स की अधिक संख्या का प्रदर्शन किया (चित्रा 3ए, बी; नियंत्रण स्थिति की तुलना में 7.7 गुना अधिक)। फेलोइडिन धुंधला होने से पता चला कि पीआरपी सक्रियण पर देखा गया रूपात्मक परिवर्तन एफ-एक्टिन पुनर्गठन से संबंधित था, जो फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का एक हस्ताक्षर है (चित्रा 4)।
चित्रा 1: जीएमपी स्थितियों के तहत ऑटोलॉगस कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार के लिए एक संस्कृति मीडिया पूरक के रूप में उपयोग किए जाने के लिए ऑटोलॉगस पीआरपी की तैयारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: रक्त कोशिका और प्लेटलेट गिनती। वाणिज्यिक उपकरण के साथ तैयार पीआरपी अंतर-दाता विविधताओं के बावजूद अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रक्त कोशिका सामग्री प्रदर्शित करता है। पीएलटी: प्लेटलेट्स (एक्स 105); डब्ल्यूबीसी: सफेद रक्त कोशिकाएं (एक्स 103); आरबीसी: लाल रक्त कोशिकाएं (एक्स 106), एन = 10 रोगी। इस आंकड़े को बर्न्ड एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति पर पीआरपी प्रोलिफेरेटिव प्रभावों का आकलन। (ए) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म चित्र 7 दिनों के कल्चर के बाद एक ही रोगी से अलग फाइब्रोब्लास्ट में जोड़े गए 20% पीआरपी माध्यम के बूस्टिंग प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं। स्केल बार = 100 μm. (B) महत्वपूर्ण डाई का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पीआरपी प्रोलिफेरेटिव प्रभाव का आकलन। एक पूर्ण ऑटोलॉगस सिस्टम (एक ही रोगी से कोशिकाओं और पीआरपी; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001) में मध्यम परिवर्तन के बिना 7 दिनों के लिए सामान्य मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एनएचडीएफ) पर 10% एफबीएस (एन = 10 रोगी) के साथ तुलना में पीआरपी सांद्रता में वृद्धि के प्रोलिफेरेटिव प्रभाव। इस आंकड़े को बर्न्ड एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एफ-एक्टिन धुंधला होने के माध्यम से साइटोस्केलेटन विज़ुअलाइज़ेशन। 20% पीआरपी (दाएं पैनल) में उगाए गए 7 दिनों के बाद, फाइब्रोब्लास्ट सक्रिय होते हैं और 10% एफबीएस (बाएं पैनल) के साथ नियंत्रण संस्कृति स्थितियों की तुलना में अपने साइटोस्केलेटन को पुनर्गठित करते हैं। स्केल बार = 200 μm. इस आंकड़े को बर्न्ड एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
घाव कोशिका चिकित्सा में अन्य भराव सामग्री की तुलना में प्राकृतिक विकल्प के रूप में ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करने के फायदों में अच्छी जैव-अनुकूलता, न्यूनतम दुष्प्रभाव और कटाई और उपयोग की सहजता शामिल है। हालांकि, दैनिक नैदानिक सेटिंग में इन चिकित्सीय का उपयोग करने से पहले, विकास सुविधाओं की पहचान करने और प्रत्यारोपण से पहले और बाद में पृथक फाइब्रोब्लास्ट के जैविक कार्य और सुरक्षा का आकलन करने के लिए उचित प्रीक्लिनिकल अध्ययन आवश्यक हैं। इस प्रकार, अलगाव प्रक्रिया के सीधे बाद, कोशिका विभाजन की संख्या को सीमित करने के लिए कोशिकाओं का इन विट्रो विस्तार जल्दी से किया जाना चाहिए। अंतिम ऑटोलॉगस जैविक उत्पाद की सुरक्षा और प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति की स्थिति को कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए।
प्रकाशित प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में, मार्ग 3-4 पर कोशिकाओं को आमतौर पर इंजेक्शन के लिए चुना गया है, क्योंकि वे सेल मात्रा और प्रोलिफेरेटिव / स्रावी गतिविधि15 के संदर्भ में सबसे उपयुक्त हैं। अधिकांश प्रीक्लिनिकल अनुसंधान संस्कृति मीडिया के साथ किए गएहैं जिसमें एफबीएस पोषक तत्वों और विकास कारकों का स्रोत है। हालांकि, यह ज़ेनोजेनिक विकास पूरक संक्रमण और प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं का संभावित जोखिम प्रस्तुत करता है। दुनिया भर में झुंडों में गोजातीय स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (बीएसई) की घटना के कारण, सेलथेरेपी संस्कृतियों में ज़ेनोजेनिक सामग्री को पेश करने के जोखिम के कारण सेल कल्चर पूरक के रूप में एफबीएस के उपयोग के बारे में काफी नियामक चिंता है।
आमतौर पर, फाइब्रोब्लास्ट या मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का प्रसार एफबीएस-पूरक विकास मीडिया का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। जबकि एफबीएस सेल संस्कृति के लिए पर्याप्त पोषक तत्वों की आपूर्ति रहा है, यह जूनोज संदूषण के जोखिम के अलावा अतिरिक्त बाधाएं पैदा करता है। सबसे पहले, एफबीएस उत्पाद मानव रक्त-व्युत्पन्न उत्पादों की तुलना में भारी विनिर्माण लागत पेश करते हैं, आंशिक रूप से कम प्रसार दर और विस्तारित संस्कृति विस्तार अवधि9 के कारण। दूसरा, एफबीएस ज़ेनोप्रोटीन का एक स्रोत है जो पृथक कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है, जिससे प्रत्यारोपितकोशिकाओं पर सतह प्रोटीन परिसरों के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का खतरा बढ़ जाता है।
कोशिकाओं के नैदानिक विस्तार के लिए एक पोषक तत्व के रूप में एफबीएस की संभावित कमियों को संबोधित करने के लिए, मानव रक्त-व्युत्पन्न उत्पादों को विकल्प के रूप में पेश किया गया है। कुछ अध्ययनों ने सेल विस्तार के लिए ऑटोलॉगस मानव सीरम के साथ संस्कृति मीडिया में एफबीएस को बदलने का प्रस्ताव दिया है, लेकिन चूंकि सेल प्रसार धीमा है, इसलिए इसे अभी भी प्रत्यारोपण से पहले लंबे संस्कृति समय (3 सप्ताह) और कई सेल पासिंगकी आवश्यकता होती है।
अन्य समूहों ने प्लेटलेट लाइसेट (पीएल) का उपयोग किया है, जो विकास कारकों में समृद्ध एक सेल-मुक्त सुपरनैटेंट है जो प्लेटलेट सांद्रता के फ्रीज-पिघलने के व्यवधान के बाद प्लेटलेट्स से जारी होता है। पीआरपी की तुलना में पीएल का मुख्य लाभ इसकी जमी हुई भंडारण क्षमता है। इसलिए, लगातार सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए एक ही लॉट का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, एक ऑफ-द-शेल्फ उत्पाद के रूप में, इसे उपयोग से पहले विकास कारक सामग्री और अन्य जैविक विशेषताओं का विश्लेषण करके मानकीकृत किया जा सकता है। कुछ नुकसान यह हैं कि यह एलोजेनिक है, और बैचों को कई दाताओं से एकत्र किया जाता है। इसके अलावा, चूंकि पीएल में कोई जीवित प्लेटलेट्स नहीं होता है, जो 10 दिनों तक साइटोकिन्स और विकास कारकों का उत्पादन कर सकता है, पीएल युक्त कल्चर मीडिया को हर 3 दिनों में बदलना पड़ता है (7-10 दिनों के बजाय जब संस्कृति को पीआरपी के साथ पूरक किया जाता है) 19। इस पीआरपी तैयारी द्वारा प्रदान किए गए विकास कारकों और पोषक तत्वों के अपने स्रोत में विट्रो में कोशिकाओं का विस्तार करना निश्चित रूप से फायदेमंद है। तैयारी सेल संस्कृति में किसी भी ज़ेनोजेनिक पूरक से मुक्त है जो अस्वीकृति, एलर्जी या संक्रामक रोग के संचरण का कारण बन सकती है।
पिछले अध्ययनों में, यह प्रदर्शित किया गया है कि ऑटोलॉगस पीआरपी का उपयोग वसा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एडीएससी) प्रसार20 के लिए एक सुरक्षित, कुशल और लागत प्रभावी संस्कृति माध्यम के रूप में किया जा सकता है। 20% ऑटोलॉगस पीआरपी के साथ आपूर्ति किए गए मीडिया ने सेल फेनोटाइप को बदलने के बिना सेल प्रसार को 13 गुना तक बढ़ा दिया। क्लीनिकों में, पीआरपी को शक्तिशाली कायाकल्प और पुनर्जनन क्षमता माना जाता है।
वर्तमान में, एक रोगी के रक्त से प्राप्त पीआरपी पहले से ही अकेले घाव भरने के लिए नैदानिक सेटिंग मेंकुशलतापूर्वक उपयोग किया जाता है 21 या हाइलूरोनिक एसिड22,23 या हड्डी पुनर्जनन24,25 के साथ संयोजन में; या अकेले त्वचा कायाकल्प26 या वसा-व्युत्पन्न स्ट्रोमल संवहनी अंश कोशिकाओं के साथ संयोजन में 27,28,29। इसने ऑटोलॉगस फाइब्रोब्लास्ट के विस्तार को बढ़ावा देने के लिए रोगी के अपने पीआरपी का उपयोग करने की जांच को प्रेरित किया।
इस उद्देश्य के लिए, और पीआरपी तैयारी के साथ प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, हमने एक विशेष पीआरपी डिवाइस विकसित किया। यह बंद प्रणाली पीआरपी तैयारी के मानकीकरण की अनुमति देती है, जो रोगी के दाता (प्लेटलेट एकाग्रता और ऑपरेटर-निर्भर विविधताओं के बारे में) से उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए एक शर्त है। 10 रोगियों से प्राप्त रक्त कोशिका की गिनती से पता चला है कि प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (चित्रा 2)। इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि पीआरपी में प्रसार बूस्टर के रूप में शक्तिशाली प्रभाव था, एफबीएस (चित्रा 3 बी) की तुलना में 7.7 गुना तक। विस्तार प्रक्रिया के लिए आवश्यक लागत और समय को कम करने के लिए यह महत्वपूर्ण है। हाल के एक अध्ययन में, हमने आगे विश्लेषण किया कि पीआरपी फाइब्रोब्लास्ट प्रसार और भेदभाव को कैसे प्रभावित करता है। 20% पीआरपी ने सेल फेनोटाइप या जीनोटाइप14 को प्रभावित किए बिना सबसे अच्छी प्रभावकारिता प्रदर्शित की।
विधि की एक सीमा यह है कि थक्के के गठन को रोकने के लिए पीआरपी युक्त माध्यम को हेपरिन के साथ तैयार किया जाना चाहिए। भले ही इस उपकरण में मानक प्लाज्मा एंटीकोआगुलेंट (एक सोडियम साइट्रेट एंटीकोआगुलेंट और कैल्शियम चेलेटर) का उपयोग किया जाता है, फाइब्रिन के थक्कों का गठन तब हो सकता है जब प्लाज्मा को कल्चर मीडिया में जोड़ा जाता है जिसमें कैल्शियम30 होता है। पीआरपी तैयारी के अलावा हेपरिन इस फाइब्रिन थक्के के गठन को रोकता है। हालांकि, हेपरिन विकास कारकों को बांध सकते हैं और सेल विकास 30 में हस्तक्षेप करसकते हैं। उदाहरण के लिए, हेपरिन को त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट प्रसार31 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। हालांकि, इस अध्ययन (2 यू / एमएल) में उपयोग की गई एकाग्रता की तुलना में उपयोग की गई सांद्रता 4 गुना अधिक केंद्रित थी।
इसके अलावा, वाणिज्यिक हेपरिन मुख्य रूप से पोर्सिन स्रोतों से शुद्ध किया जाता है; इसलिए, इसकी पशु उत्पत्ति के कारण, यह पूरी तरह से क्सीन-मुक्त माध्यम के विकास में एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। यद्यपि पोर्सिन हेपरिन को मानव चिकित्सा के लिए अनुमोदित किया गया है, अणु के लिए अतिसंवेदनशीलताकी सूचना दी गई है। एक और सीमा यह है कि पीआरपी को एक ताजा जैविक पूरक के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और इसे फ्रीज नहीं किया जा सकता है। प्लेटलेट्स के आधे जीवन के बारे में, यह पहले दिखाया गया है कि 10 दिनों के बाद, पीआरपी में मौजूद प्लेटलेट्स में से आधे अभीभी व्यवहार्य हैं। इस कारण से, पीआरपी को कमरे के तापमान पर रखा जाता है और 10 दिनों के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, भविष्य के सेल उपचारों के लिए जिन्हें बड़ी संख्या में कोशिकाओं के उत्पादन की आवश्यकता होती है, मुख्य सीमा रक्त की कुल मात्रा है जिसे रोगी से वापस लिया जा सकता है।
सारांश में, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि पीआरपी के साथ एफबीएस को बदलने से फाइब्रोब्लास्ट का तेजी से विस्तार होता है। पीआरपी में मौजूद प्लेटलेट्स धीरे-धीरे विस्तार के संस्कृति चरण के दौरान विकास कारकों का एक योजनाबद्ध मिश्रण जारी करते हैं। प्रस्तुत डिवाइस का उपयोग एक मानकीकृत प्रक्रिया के दौरान किया जाता है जो पीआरपी की तैयारी के दौरान जटिलता और हाथों पर समय को कम करता है। इस प्रणाली को इस प्रकार एक उपयुक्त विधि माना जाता है जब जीएमपी स्थितियों में ऑटोलॉगस सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक त्वरित और सुरक्षित पूर्व विवो विस्तार की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
इस परियोजना को रेगेन लैब एसए द्वारा वित्त पोषित किया गया है। सारा बर्न्ड रेजेन लैब के लिए सेल थेरेपी हेड प्रोजेक्ट मैनेजर हैं और रेजेन लैब एसए द्वारा नियोजित हैं। एंटोनी तुर्जी रेगनलैब के सीईओ हैं।
Acknowledgments
हम फ्लो साइटोमेट्री डेटा के साथ तकनीकी सहायता के लिए श्री ग्रेगोरी श्निटर को धन्यवाद देते हैं; प्रोफेसर मुरील क्यूनडेट (फार्माकोग्नोसी की प्रयोगशाला, स्कूल ऑफ फार्मास्यूटिकल साइंसेज और जिनेवा विश्वविद्यालय) एट्यून फ्लो साइटोमीटर और साइटेशन 3 उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोप के उपयोग की अनुमति देने के लिए; वैज्ञानिक सलाह के लिए प्रोफेसर ब्रिगिट पिटेट।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well black clear flat bottom | BD Falcon | 353219 | 32/case |
| Cell trace Violet Dye | Thermo Fischer Scientific | C34557 | 180 assays |
| CuteCell PRP | Regen Lab SA | CC-PRP-3T | 3 tubes per package |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 mg |
| DMEM | Gibco | 52400-025 | 500 mL |
| FBS | Gibco | 10270106 | 500 mL |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030024 | 100 mL |
| Hematology Counter | Sysmex | KK-21N | |
| Heparin 5000E Liquemine | Drossapharm AG | 0.5 mL | |
| HEPES Buffer Solution 1M | Gibco | 15630-056 | 100 mL |
| Liberase DH | Roche | 5401054001 | 2x 5 mg per package |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140-035 | 100 mL |
| Na Pyruvate 1mg/mL | Gibco | 11360-039 | 100 mL |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 mL |
| Phalloidin alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A12379 | 300 units |
| RPMI | Gibco | 31966-021 | 500 mL |
| Trypsin 1x 0.25% | Gibco | 25050-014 | 100 mL |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | 100 mL |
References
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