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Bioengineering

Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Este protocolo presenta un dispositivo que produce PRP para impulsar la expansión in vitro de las células en un sistema de cultivo de fibroblastos 100% autólogo.

Abstract

Actualmente existe un gran interés clínico en el uso de fibroblastos autólogos para la reparación de la piel. En la mayoría de los casos, se requiere el cultivo de células de la piel in vitro. Sin embargo, el cultivo celular que utiliza medios de cultivo xenogénicos o alogénicos tiene algunas desventajas (es decir, riesgo de transmisión de agentes infecciosos o expansión celular lenta). Aquí, se desarrolla un sistema de cultivo autólogo para la expansión de células de fibroblastos de la piel humana in vitro utilizando el propio plasma rico en plaquetas (PRP) del paciente. Los fibroblastos dérmicos humanos se aíslan del paciente mientras se somete a una abdominoplastia. Los cultivos se siguen durante un máximo de 7 días utilizando un medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) o PRP. Se evalúa el contenido de células sanguíneas en las preparaciones de PRP, la proliferación y la diferenciación de fibroblastos. Este protocolo describe el método para obtener una preparación estandarizada y no activada de PRP utilizando un dispositivo médico dedicado. La preparación requiere solo un dispositivo médico (CuteCell-PRP) y una centrífuga. Este dispositivo es adecuado en condiciones de práctica médica suficientes y es un sistema cerrado de un solo paso, apirogénico y estéril que requiere una sola centrifugación de centrifugación de centrifugación suave de 1.500 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, los componentes sanguíneos se separan y el plasma rico en plaquetas se recoge fácilmente. Este dispositivo permite una preparación rápida, consistente y estandarizada de PRP que se puede utilizar como un suplemento de cultivo celular para la expansión in vitro de células humanas. El PRP obtenido aquí contiene una concentración de plaquetas de 1,5 veces en comparación con la sangre total junta, con una eliminación preferencial de glóbulos rojos y blancos. Está demostrado que el PRP presenta un efecto potenciador en la proliferación celular en comparación con FBS (7.7x) y que los fibroblastos se activan con el tratamiento con PRP.

Introduction

La medicina regenerativa tiene como objetivo curar o reemplazar tejidos y órganos dañados por la edad, enfermedad o trauma, así como corregir defectos congénitos. En la terapia autóloga, las células o tejidos se extraen de un paciente, se expanden o modifican, y luego se vuelven a introducir al donante. Esta forma de terapéutica tiene un amplio potencial en el campo de la dermatología1. En la terapia con fibroblastos autólogos, los fibroblastos de un paciente se cultivan y se reinyectan para tratar arrugas, arrugas o cicatrices de acné. Como los fibroblastos son las principales células funcionales de la dermis, la inyección de fibroblastos autólogos puede ser más beneficiosa que otras terapias en el rejuvenecimiento facial2.

En la piel, los fibroblastos son responsables de la síntesis y secreción de proteínas extracelulares (es decir, colágeno, elastina, ácido hialurónico y glicosaminoglicanos). También liberan factores de crecimiento que regulan la función celular, la migración y las interacciones célula-matriz / célula-célula en la homeostasis normal de la piel y la cicatrización de heridas3. Los fibroblastos dérmicos ya se han introducido como una terapia celular clínica potencial para la cicatrización de heridas cutáneas4, la regeneración tisular5 o los rellenos dérmicos en procedimientos estéticos y de cirugía plástica6. Algunos estudios incluso sugieren que, en el contexto de la medicina regenerativa, los fibroblastos pueden ser una terapia celular más práctica y efectiva que las células madre mesenquimales7.

Para obtener un número suficiente de fibroblastos para aplicaciones clínicas, la expansión celular suele ser obligatoria. El cultivo celular ex vivo/in vitro requiere un medio basal suplementado con factores de crecimiento, proteínas y enzimas para apoyar la adhesión y proliferación celular. El suero fetal bovino (FBS) es un suplemento común para medios de cultivo celular, porque la sangre fetal 1) es rica en factores de crecimiento en comparación con la sangre adulta y 2) presenta un bajo contenido de anticuerpos8. A medida que avanza la terapia celular, existen preocupaciones sobre la seguridad de las condiciones clásicas de cultivo celular en las que se agrega FBS al medio de cultivo. Además, ahora hay una tendencia a reemplazar FBS con alternativas9. Varios sustitutos de FBS han mostrado resultados prometedores10.

La alternativa de plasma rico en plaquetas (PRP) ha sido seleccionada aquí, y hemos desarrollado un dispositivo médico para producir una preparación estandarizada de PRP, llamado CuteCell-PRP. El uso previsto de este dispositivo es la preparación de PRP autólogo para ser utilizado como un suplemento de medios de cultivo para la expansión in vitro de células autólogas en condiciones GMP.

El PRP se define como una suspensión plaquetaria concentrada en plasma. Debido a que existen numerosos protocolos de preparación, que difieren en 1) la cantidad de sangre necesaria, 2) los tipos de dispositivos utilizados y 3) el protocolo de centrifugación, las concentraciones de plaquetas resultantes varían de ligeramente por encima a más de 10 veces el valor basal de la sangre. Además, las preparaciones de PRP contienen niveles variables de contaminación de glóbulos rojos y blancos. Por lo tanto, la terminología "PRP" se utiliza para describir productos que varían mucho en su composición biológica y posibles efectos terapéuticos.

En la mayoría de los estudios, la sustitución de FBS se logra utilizando diferentes concentraciones de PRP que se activa (por trombina o calcio). Esta activación artificial provoca una liberación inmediata e importante de factores de crecimiento plaquetario desde 15 min hasta 24 h11. Por lo tanto, se cree que la activación plaquetaria es indeseable para aplicaciones en cultivos celulares, en los que se requiere la liberación lenta de factores de crecimiento a partir de la desgranulación plaquetaria gradual.

La terapia PRP implica la preparación de plaquetas autólogas en plasma concentrado12. La concentración óptima de plaquetas no está clara, y hay una amplia gama de dispositivos comerciales disponibles para preparar PRP13. Esta falta de estandarización se debe a la inconsistencia entre los estudios y ha llevado a una caja negra con respecto a la dosis y el momento de la inyección. Este protocolo describe un procedimiento para obtener PRP autólogo utilizando este dispositivo PRP dedicado para expandir fibroblastos de la piel en un modelo de cultivo ex vivo 100% autólogo.

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Protocol

El protocolo del estudio cumplió con la Declaración de Helsinki, y todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Se obtienen muestras de piel de mujeres sanas sometidas a abdominoplastia en el Departamento de Cirugía Plástica, Reconstructiva y Estética de los Hospitales Universitarios de Ginebra (Ginebra, Suiza). El procedimiento se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética institucional local (protocolo #3126).

1. Preparación del PRP

NOTA: Los tubos CuteCell-PRP (Tabla de materiales) están diseñados para la preparación rápida de PRP a partir de un pequeño volumen de sangre del paciente en un sistema de circuito cerrado.

  1. Recolección de sangre total
    NOTA: Recolecte sangre autóloga de una vena periférica del brazo utilizando una aguja de mariposa conectada directamente al tubo PRP, de acuerdo con el protocolo de recolección del instituto médico. La sangre se puede extraer directamente a través de la cánula venosa si el paciente está bajo anestesia.
    1. Abra el blíster tubular. Realice la punción venosa y llene el número deseado de tubos de PRP con sangre entera. El vacío dentro de los tubos permitirá la recolección automática del volumen necesario de sangre (~ 10 ml).
    2. Gire cuidadosamente los tubos boca abajo varias veces para mezclar la sangre con anticoagulante.
    3. Dentro de un gabinete de bioseguridad (clase 2), extraiga 100 μL de sangre total total usando una jeringa de 1 ml para obtener más recuentos de células sanguíneas.
  2. Centrifugación
    NOTA: Asegúrese de que la centrífuga esté correctamente equilibrada antes de iniciarla.
    1. Una vez que la sangre se recoge en los tubos de PRP, si es necesario, prepare un tubo de contrapeso (suministrado por separado) con agua al mismo nivel que la sangre en el tubo de PRP. Coloque los tubos llenos en la centrífuga uno frente al otro, asegurándose de que la máquina esté equilibrada.
    2. Centrifugar muestras a 1.500 x g durante 5 min.
      NOTA: Ajuste la velocidad de rpm correspondiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la centrífuga. Después de la centrifugación, la sangre se fraccionará. Los glóbulos rojos y blancos quedan atrapados debajo del gel, y las plaquetas se depositan en la superficie del gel (Figura 1).
  3. Invierta suavemente el tubo de PRP 20x para resuspender el depósito de plaquetas en el sobrenadante plasmático.
    NOTA: Asegúrese de que las plaquetas estén completamente separadas del gel. El plasma debe cambiar de claro y transparente a turbio. Si hay agregados plaquetarios, deben recogerse con el plasma.
  4. Para recolectar PRP, tome la solución plasmática del tubo usando un dispositivo de transferencia de jeringa conectado a una jeringa de 10 ml.
    NOTA: Se obtendrán aproximadamente 5 ml de PRP de cada tubo. La solución PRP ahora está lista para mezclar en la preparación final del medio. La solución se puede mantener a temperatura ambiente (RT) debajo del gabinete de seguridad hasta los pasos futuros que involucran el analizador de hematología y el uso.
  5. Antes de usar el PRP, determine la concentración de plaquetas, el volumen medio de plaquetas y el número de glóbulos rojos y blancos utilizando un analizador hematológico automatizado (Tabla de materiales). Para ello, retire con cuidado 100 μL de la solución y transfiérala a un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: El PRP se utiliza como suplemento de cultivo autólogo a una concentración entre 5-20% v/v. La concentración óptima de PRP debe determinarse para cada línea celular. Para prevenir la formación de coágulos de fibrina, los medios de cultivo finales deben complementarse con 2 U/ml de heparina.

2. Aislamiento de fibroblastos autólogos y cultivo en medios suplementados con FBS o PRP

  1. Lave las muestras de piel en solución salina tamponada con fosfato (PBS) agitando suavemente en un tubo de polipropileno de 50 ml.
  2. Si la muestra de piel es relativamente grande (>10 cm 2), coloque la muestra en la tapa de una placa de cultivo de tejido de 150 cm2 (lado epidérmico hacia abajo). Retire el tejido graso subcutáneo con un par de fórceps y tijeras. Para evitar que el tejido se seque, enjuague el tejido cada pocos minutos en PBS.
    NOTA: Utilice una placa de cultivo de tejidos más pequeña para muestras más pequeñas.
  3. Cuando se complete el recorte de grasa, corte el tejido en tiras de aproximadamente 0,5 cm x 1,5 cm con un bisturí estéril.
  4. Agregue 5 ml de mezcla de colagenasa-dispasa (tabla de materiales; 14 unidades de Wünsch/ml) a un tubo estéril de 15 ml.
  5. Transfiera el tejido cortado al tubo, asegurándose de que las piezas de tejido se sumerjan en la solución. Tapa el tubo de forma segura.
  6. Colocar los tubos en una incubadora a 37 °C con agitación orbital durante 150 min. Después de la incubación, coloque el tubo que contiene el tejido en el gabinete de bioseguridad.
  7. Coloque la tapa de una placa de cultivo estéril de 100 mm boca abajo en el gabinete de bioseguridad. Transfiera la solución de tejido digerido al fondo de la placa de cultivo de 100 mm, sin salpicaduras. Si queda algún pedazo de tejido en el tubo, use una pipeta estéril de 1 ml o pinzas estériles para transferir las piezas de tejido al fondo de la placa de cultivo de 100 mm.
  8. Con la tira de la epidermis hacia arriba, separe la hoja de epidermis intacta de la dermis usando dos pares de fórceps. Sostenga la dermis de la tira de tejido con un par de fórceps y el borde de la epidermis con otro par de fórceps. Separe la dermis y la epidermis en dos piezas, manteniendo las piezas separadas en la misma tapa. Intente realizar este paso rápidamente y repita la manipulación para cada pieza de tejido.
  9. Transfiera las piezas dérmicas a una nueva placa de cultivo de 100 mm que contenga PBS.
  10. Usando pinzas de laboratorio, coloque las piezas dérmicas en un tubo de polipropileno de 15 ml con 3 ml de tripsina/PBS al 0,3%. Incubar durante 10-20 min en un baño maría a 37 °C e invertir el tubo varias veces cada 2-3 min.
  11. Para detener la reacción enzimática, agregue 3-5 ml de medio de crecimiento completo helado (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] o RPMI que contiene 10% de FBS). Vortex el tubo vigorosamente varias veces. Filtre la suspensión de fibroblastos a través de una malla de nylon de 85 μm (colocada sobre la parte superior de un tubo de 50 ml) para eliminar los residuos dérmicos.
  12. Centrifugar durante 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100−1.000 μL de medio de crecimiento completo.
  13. Usando azul de tripano (factor de dilución de x2) mezclado con la suspensión celular, contar el número de células totales y viables llenando la cámara del hemocitómetro.
    NOTA: La viabilidad celular depende de las condiciones utilizadas para la digestión enzimática. Para aumentar la recuperación celular y la viabilidad celular, la muestra de piel se puede cortar en trozos más pequeños.
  14. Placa 3−10 x 104 células en 5 ml de medio de cultivo completo de FBS (DMEM, 10% FBS inactivado térmicamente durante 60 min a 56 °C, solución tampón HEPES 1% 1 M, mezcla de aminoácidos no esenciales 100x 100x, 1% L-glutamina 100x, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% piruvato sódico 100x) en un matraz de cultivo tisular de 25 cm2 . Incubar a 37 °C.
    NOTA: Los fibroblastos viables se adherirán al matraz dentro de las 24 h y comenzarán a exhibir la forma del huso en 2-3 días.
  15. En el día 2, aspirar el medio que contiene células no adherentes y añadir medio fresco.
    NOTA: Como las células muertas en el medio de cultivo afectan el crecimiento de fibroblastos viables, las células muertas no adherentes deben eliminarse del cultivo.
  16. Cambiar el medio cada 3−4 días hasta que el cultivo alcance el 70−80% de confluencia.
  17. Para cosechar fibroblastos, lavar con PBS e incubar con solución de tripsina/EDTA durante 3 min a 37 °C en la incubadora.
  18. Para detener la reacción, agregue 3-5 ml de medio de crecimiento completo caliente (DMEM o RPMI que contiene 10% de FBS). Tomar una alícuota de la suspensión celular para contar las células con el hemocitómetro. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 200 x g y retirar el medio por aspiración.
  19. Cultivar el fibroblasto en medio PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M solución tampón HEPES, 1% 100x mezcla de aminoácidos no esenciales, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% 100x piruvato de sodio, 2 U/ml de heparina) en la incubadora a 37 °C.
    NOTA: La densidad celular mínima recomendada es de 4.000 células viables/cm2.
  20. Evaluar los efectos del PRP sobre la proliferación de fibroblastos, fibroblastos de semilla (paso 2) en 24 placas de pocillos a una densidad de 8 x 103 células por pocillo en medio de PRP con diferentes concentraciones de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% y 50%) y con 2 U/ml de heparina o en condiciones de medio de cultivo clásico (10% FBS). Después de 7 días de cultivo, añadir un colorante vital (proliferación celular violeta) a las células y evaluar la proliferación por citometría de flujo.
  21. Para estudiar los reordenamientos citoesqueléticos, las células semilla en 96 placas de fondo plano bien negro/claro a una concentración de 1 x 10 5 células/ml en DMEM de crecimiento FBS completo (ver paso 2.14) suplementadas con FBS al0,5 % durante 24 h. Trate las células con 10% de FBS o diferentes concentraciones de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% y 50%) durante 7 días.
    1. Fijar los fibroblastos con paraformaldehído al 4% durante 10 min y permeabilizar con Triton X-100 al 0,1% durante 5 min en RT. Colorear los fibroblastos con 50 mL de faloidina 5 U/mL, lavar 2x con PBS y marcar con 50 mL de 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min. Se utilizó el lector multimodo de imágenes celulares de 3 células de citación (BioTek) para visualizar la tinción de faloidina.

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Representative Results

Esta tecnología patentada es un dispositivo médico simple, rápido y reproducible utilizado para producir preparaciones estandarizadas de PRP. Es un sistema de un solo paso, totalmente cerrado, que permite la preparación de PRP a partir de sangre total venosa después de 5 min de centrifugación a 1.500 x g (debido a la tecnología de gel separador). El PRP obtenido después de la centrifugación se elimina de los glóbulos rojos y blancos, que se encuentran debajo del gel. Después de varias inversiones del tubo, las plaquetas que están en la parte superior del gel se resuspenden en el plasma y el PRP está listo para usar (Figura 1).

Para evaluar la reproducibilidad del contenido de células sanguíneas en la preparación, se analizaron muestras de sangre total y PRP de 10 pacientes diferentes con un analizador de hematología. Después del procesamiento de toda la sangre con el dispositivo, se eliminaron la mayoría de los glóbulos rojos (RBC) y los glóbulos blancos (WBC). La concentración media de plaquetas mostró un aumento de 1,5 veces en comparación con la concentración fisiológica encontrada en la sangre total (Figura 2).

En la configuración de cultivo autólogo, los fibroblastos aislados de un paciente se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de PRP (1-50%), en comparación con la condición de medio de cultivo clásico (10% FBS). Después de 7 días de cultivo sin cambiar el medio, los cultivos cebados con PRP al 20% exhibieron un mayor número de fibroblastos viables (Figura 3A, B; 7,7 veces mayor en comparación con la condición de control). La tinción de faloidina evidenció que el cambio morfológico observado en la activación del PRP estaba relacionado con la reorganización de la actina F, que es una firma de la activación de fibroblastos (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Preparación de PRP autólogo para ser utilizado como suplemento de medios de cultivo para la expansión in vitro de células autólogas en condiciones GMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Recuentos de células sanguíneas y plaquetas. El PRP preparado con el dispositivo comercial muestra un contenido de células sanguíneas altamente reproducible a pesar de las variaciones entre donantes. PLT: plaquetas (x 105); glóbulos blancos: glóbulos blancos (x 103); RBC: glóbulos rojos (x 106), n = 10 pacientes. Esta cifra ha sido modificada de Berndt et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de los efectos proliferativos del PRP en el cultivo autólogo de fibroblastos. (A) Imágenes microscópicas representativas de campo claro que demuestran los efectos estimulantes del medio de PRP al 20% agregado a fibroblastos aislados del mismo paciente después de 7 días de cultivo. Barra de escala = 100 μm. (B) Evaluación del efecto proliferativo del PRP mediante citometría de flujo utilizando colorante vital. Efectos proliferativos del aumento de las concentraciones de PRP en comparación (1-50%) con FBS al 10% (n = 10 pacientes) en fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) durante 7 días sin cambio medio en un sistema autólogo completo (células y PRP del mismo paciente; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Esta cifra ha sido modificada de Berndt et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Visualización del citoesqueleto mediante tinción de actina F. Después de 7 días cultivados en PRP al 20% (panel derecho), los fibroblastos se activan y reorganizan su citoesqueleto en comparación con las condiciones de cultivo de control con FBS al 10% (panel izquierdo). Barra de escala = 200 μm. Esta cifra ha sido modificada de Berndt et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las ventajas de usar fibroblastos autólogos como una alternativa natural en comparación con otros materiales de relleno en la terapia celular de heridas incluyen una buena biocompatibilidad, efectos secundarios mínimos y facilidad de recolección y uso. Sin embargo, antes de usar estas terapias en un entorno clínico diario, se necesitan estudios preclínicos adecuados para identificar las características de crecimiento y evaluar la función biológica y la seguridad de los fibroblastos aislados tanto antes como después del trasplante. Por lo tanto, inmediatamente después del proceso de aislamiento, la expansión in vitro de las células debe realizarse rápidamente para limitar el número de divisiones celulares. Las condiciones de cultivo deben controlarse estrictamente para garantizar la seguridad y eficacia del producto biológico autólogo final.

En estudios preclínicos publicados, las células en los pasajes 3-4 han sido típicamente elegidas para ser inyectadas, ya que son las más adecuadas en términos de cantidad celular y actividad proliferativa/secretora15. La mayoría de las investigaciones preclínicas se han realizado con medios de cultivo en los que el FBS es la fuente de nutrientes y factores de crecimiento16. Sin embargo, este suplemento de crecimiento xenogénico presenta un posible riesgo de infección y reacciones inmunológicas. Debido a la aparición de encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en rebaños de todo el mundo, existe una considerable preocupación regulatoria con respecto al uso de FBS como suplemento de cultivo celular debido al riesgo de introducir material xenogénico en cultivos de terapia celular10.

Por lo general, la proliferación de fibroblastos o células madre mesenquimales (MSC) se logra utilizando medios de crecimiento suplementados con FBS. Si bien FBS ha sido un suministro adecuado de nutrientes para el cultivo celular, plantea obstáculos adicionales además del riesgo de contaminación por zoonosis. En primer lugar, los productos FBS presentan un enorme costo de fabricación en comparación con los productos derivados de la sangre humana, en parte debido a la reducción de las tasas de proliferación y un período prolongado de expansión del cultivo9. En segundo lugar, el FBS es una fuente de xenoproteínas que interactúan con las células aisladas, aumentando así el riesgo de reacción inmune debido a la aparición de anticuerpos contra complejos proteicos de superficie en células trasplantadas10.

Para abordar los posibles inconvenientes del FBS como nutriente para la expansión clínica de las células, se han introducido productos derivados de la sangre humana como alternativas. Algunos estudios han propuesto reemplazar FBS en medios de cultivo con suero humano autólogo para la expansión celular, pero como la proliferación celular es lenta, todavía requiere un largo tiempo de cultivo (3 semanas) y varios pases celulares antes del trasplante17,18.

Otros grupos han utilizado lisado de plaquetas (PL), un sobrenadante libre de células rico en factores de crecimiento que se liberan de las plaquetas después de la interrupción de la congelación y descongelación de los concentrados de plaquetas. La principal ventaja de PL en comparación con PRP es su potencial de almacenamiento congelado. Por lo tanto, el mismo lote se puede utilizar para aplicaciones consecutivas de cultivo celular. Además, como producto estándar, se puede estandarizar analizando el contenido del factor de crecimiento y otras características biológicas antes de su uso. Algunas desventajas son que es alogénico y se agrupan lotes de varios donantes. Además, dado que la PL no contiene plaquetas vivas, que pueden producir citoquinas y factores de crecimiento hasta por 10 días, los medios de cultivo que contienen PL deben cambiarse cada 3 días (en lugar de 7-10 días cuando el cultivo se complementa con PRP)19. Expandir las células in vitro en su propia fuente de factores de crecimiento y nutrientes proporcionados por esta preparación de PRP es ciertamente ventajoso. La preparación está libre de cualquier suplemento xenogénico en el cultivo celular que pueda causar rechazo, alergia o transmisión de enfermedades infecciosas.

En estudios previos, se ha demostrado que el PRP autólogo puede ser utilizado como un medio de cultivo seguro, eficiente y rentable para la proliferación de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADSC)20. Los medios suministrados con PRP autólogo al 20% aumentaron la proliferación celular hasta 13 veces sin cambiar el fenotipo celular. En las clínicas, se considera que el PRP tiene poderosas capacidades de rejuvenecimiento y regeneración.

Actualmente, el PRP obtenido de la sangre de un paciente ya se utiliza eficientemente en el entorno clínico para la cicatrización de heridas solo 21 o en combinación con ácido hialurónico 22,23 o regeneración ósea 24,25; o rejuvenecimiento cutáneo solo26 o en combinación con células de fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo27,28,29. Esto impulsó la investigación del uso del propio PRP de un paciente para promover la expansión de fibroblastos autólogos.

Para ello, y para garantizar la reproducibilidad de los resultados obtenidos con la preparación de PRP, desarrollamos un dispositivo especial de PRP. Este sistema cerrado permite la estandarización de las preparaciones de PRP, que es un requisito previo para minimizar las fluctuaciones del donante de un paciente (con respecto a la concentración de plaquetas y las variaciones dependientes del operador). Los recuentos de células sanguíneas obtenidos de 10 pacientes mostraron que el protocolo es altamente reproducible (Figura 2). Además, se demostró que el PRP tenía efectos potentes como refuerzo de la proliferación, hasta 7,7 veces en comparación con el FBS (Figura 3B). Esto es importante para reducir los costos y el tiempo requerido para el proceso de expansión. En un estudio reciente, analizamos más a fondo cómo el PRP afecta la proliferación y diferenciación de fibroblastos. El 20% de PRP mostró la mejor eficacia sin afectar el fenotipo celular o genotipo14.

Una limitación del método es que el medio que contiene PRP debe prepararse con heparina para prevenir la formación de coágulos. Aunque en este dispositivo se utiliza anticoagulante plasmático estándar (un anticoagulante de citrato de sodio y quelante de calcio), la formación de coágulos de fibrina puede ocurrir cuando se agrega plasma a medios de cultivo que contienen calcio30. La heparina además de la preparación de PRP previene la formación de este coágulo de fibrina. Sin embargo, las heparinas pueden unirse a factores de crecimiento y pueden interferir con el crecimiento celular30. Por ejemplo, se demostró que la heparina afecta negativamente la proliferación de fibroblastos dérmicos31. Sin embargo, las concentraciones utilizadas fueron 4 veces más concentradas en comparación con la concentración utilizada en este estudio (2 U/mL).

Además, la heparina comercial se purifica principalmente a partir de fuentes porcinas; Por lo tanto, debido a su origen animal, representa una limitación en el desarrollo de un medio completamente libre de xeno. Aunque la heparina porcina ha sido aprobada para la terapia humana, la hipersensibilidad a la molécula ha sido reportada32. Otra limitación es que el PRP debe usarse como un suplemento biológico fresco y no se puede congelar. En cuanto a la vida media de las plaquetas, se ha demostrado previamente que después de 10 días, la mitad de las plaquetas presentes en el PRP siguen siendoviables 33. Por esta razón, el PRP se mantiene a temperatura ambiente y se utiliza durante 10 días. Además, para futuras terapias celulares que requieren la producción de un número masivo de células, la principal limitación es la cantidad total de sangre que se puede extraer del paciente.

En resumen, este protocolo demuestra que reemplazar FBS con PRP resulta en una rápida expansión de fibroblastos. Las plaquetas presentes en el PRP liberan lentamente una mezcla orquestada de factores de crecimiento durante la fase de cultivo de la expansión. El dispositivo presentado se utiliza durante un procedimiento estandarizado que reduce la complejidad y el tiempo práctico durante la preparación de PRP. Por lo tanto, este sistema se considera un método apropiado cuando se necesita una expansión ex vivo rápida y segura para aplicaciones de terapia celular autóloga en condiciones GMP.

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Disclosures

Este proyecto ha sido financiado por Regen Lab SA. Sarah Berndt es la gerente de proyectos de terapia celular para Regen Lab y es empleada de Regen Lab SA. Antoine Turzi es el CEO de RegenLab.

Acknowledgments

Damos las gracias al Sr. Grégory Schneiter por su asistencia técnica con los datos de citometría de flujo; la profesora Muriel Cuendet (Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Universidad de Ginebra) por permitir el uso del citómetro de flujo Attune y el microscopio de alto rendimiento Citation 3; Profesora Brigitte Pittet para consejos científicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Retracción Número 168 plasma rico en plaquetas PRP fibroblastos proliferación celular migración celular cicatrización de heridas cultivo celular terapia celular
Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos
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Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

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