Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Получение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы для усиления экспансии фибробластов человека in vitro

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Этот протокол представляет собой устройство, которое производит PRP для стимулирования экспансии клеток in vitro в 100% аутологичной системе культивирования фибробластов.

Abstract

В настоящее время существует большой клинический интерес к использованию аутологичных фибробластов для восстановления кожи. В большинстве случаев требуется культивирование клеток кожи in vitro. Однако культивирование клеток с использованием ксеногенных или аллогенных питательных сред имеет некоторые недостатки (например, риск передачи инфекционного агента или медленную экспансию клеток). Здесь разрабатывается система аутологичного культивирования для расширения клеток фибробластов кожи человека in vitro с использованием собственной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) пациента. Дермальные фибробласты человека выделяются у пациента во время абдоминопластики. Посевы проводят в течение 7 дней с использованием среды, дополненной либо фетальной бычьей сывороткой (FBS), либо PRP. Оценивают содержание клеток крови в препаратах PRP, пролиферацию и дифференцировку фибробластов. В этом протоколе описан способ получения стандартизированного, неактивированного препарата PRP с использованием специального медицинского изделия. Для приготовления препарата требуется только медицинский прибор (CuteCell-PRP) и центрифуга. Это устройство подходит для достаточных условий медицинской практики и представляет собой одноступенчатую, апирогенную и стерильную закрытую систему, которая требует однократного центрифугирования с мягким вращением 1,500 x g в течение 5 минут. После центрифугирования компоненты крови отделяются, и богатая тромбоцитами плазма легко собирается. Это устройство позволяет быстро, последовательно и стандартизированно получать PRP, который можно использовать в качестве добавки к клеточным культурам для экспансии клеток человека in vitro. PRP, полученный здесь, содержит 1,5-кратную концентрацию тромбоцитов по сравнению с цельной кровью вместе, с преимущественным удалением эритроцитов и лейкоцитов. Показано, что PRP оказывает стимулирующее действие в пролиферации клеток по сравнению с FBS (7,7x) и что фибробласты активируются при лечении PRP.

Introduction

Регенеративная медицина направлена на лечение или замену тканей и органов, поврежденных возрастом, болезнью или травмой, а также на исправление врожденных дефектов. При аутологичной терапии клетки или ткань изымаются у пациента, расширяются или модифицируются, а затем снова вводятся донору. Эта форма терапии имеет широкий потенциал в области дерматологии1. При терапии аутологичными фибробластами фибробласты пациента культивируются и повторно вводятся для лечения морщин, ритид или шрамов от угревой сыпи. Поскольку фибробласты являются основными функциональными клетками дермы, инъекция аутологичных фибробластов может быть более полезной, чем другие методы лечения омоложения лица2.

В коже фибробласты отвечают за синтез и секрецию внеклеточных белков (то есть коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и гликозаминогликанов). Они также высвобождают факторы роста, которые регулируют функцию клеток, миграцию и взаимодействия между клетками и матриксом/клетками при нормальном гомеостазе кожи и заживлении ран3. Дермальные фибробласты уже были введены в качестве потенциальной клинической клеточной терапии для заживления кожных ран4, регенерациитканей 5 или дермальных наполнителей в процедурах эстетической и пластической хирургии6. Некоторые исследования даже предполагают, что в контексте регенеративной медицины фибробласты могут быть более практичной и эффективной клеточной терапией, чем мезенхимальные стволовые клетки7.

Для получения достаточного количества фибробластов для клинического применения обычно обязательна клеточная экспансия. Культура клеток ex vivo / in vitro требует базальной среды, дополненной факторами роста, белками и ферментами для поддержки клеточной адгезии и пролиферации. Фетальная бычья сыворотка (FBS) является распространенной добавкой для сред для культивирования клеток, поскольку кровь плода 1) богата факторами роста по сравнению с кровью взрослого человека и 2) имеет низкое содержание антител8. По мере развития клеточной терапии возникают опасения по поводу безопасности классических условий культивирования клеток, в которых FBS добавляется в питательную среду. Кроме того, в настоящее время наблюдается тенденция к замене FBS альтернативами9. Несколько заменителей FBS показали многообещающие результаты10.

Здесь была выбрана альтернатива обогащенной тромбоцитами плазме (PRP), и мы разработали медицинское устройство для производства стандартизированного препарата PRP под названием CuteCell-PRP. Предполагаемое использование этого устройства заключается в приготовлении аутологичного PRP для использования в качестве добавки питательной среды для экспансии аутологичных клеток in vitro в условиях GMP.

PRP определяется как концентрированная суспензия тромбоцитов в плазме. Поскольку существует множество протоколов подготовки, которые различаются по 1) количеству необходимой крови, 2) типам используемых устройств и 3) протоколу центрифугирования, результирующие концентрации тромбоцитов варьируются от чуть выше до более чем в 10 раз по сравнению с исходным значением крови. Кроме того, препараты PRP содержат различные уровни загрязнения эритроцитов и лейкоцитов. Таким образом, терминология «PRP» используется для описания продуктов, которые сильно различаются по своему биологическому составу и потенциальным терапевтическим эффектам.

В большинстве исследований замещение FBS достигается с использованием различных концентраций PRP, который активируется (тромбином или кальцием). Эта искусственная активация провоцирует немедленное и важное высвобождение факторов роста тромбоцитов от 15 мин до 24 ч11. Поэтому считается, что активация тромбоцитов нежелательна для применений в клеточных культурах, в которых требуется медленное высвобождение факторов роста от постепенной дегрануляции тромбоцитов.

PRP-терапия включает приготовление аутологичных тромбоцитов в концентрированной плазме12. Оптимальная концентрация тромбоцитов неясна, и существует широкий спектр коммерческих устройств для получения PRP13. Это отсутствие стандартизации является результатом несогласованности между исследованиями и привело к черному ящику в отношении дозировки и времени инъекции. Этот протокол описывает процедуру получения аутологичного PRP с использованием этого специального устройства PRP для расширения фибробластов кожи в 100% аутологичной модели культуры ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол исследования соответствовал Хельсинкской декларации, и все пациенты предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании. Образцы кожи берутся у здоровых женщин, перенесших абдоминопластику в отделении пластической, реконструктивной и эстетической хирургии университетских клиник Женевы (Женева, Швейцария). Процедура соответствует принципам Хельсинкской декларации и была одобрена местным институциональным комитетом по этике (протокол #3126).

1. Подготовка PRP

ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки CuteCell-PRP (Таблица материалов) предназначены для быстрого приготовления PRP из небольшого объема крови пациента в системе замкнутого контура.

  1. Сбор цельной крови
    ПРИМЕЧАНИЕ: Забор аутологичной крови из периферической вены руки с помощью иглы-бабочки, непосредственно подключенной к трубке PRP, в соответствии с протоколом сбора медицинского института. Кровь может быть взята непосредственно через венозную канюлю, если пациент находится под наркозом.
    1. Откройте блистерную упаковку тубы. Выполните венозную пункцию и заполните нужное количество PRP-пробирок цельной кровью. Вакуум внутри пробирок позволит автоматически собирать необходимый объем крови (~10 мл).
    2. Осторожно переверните пробирки вверх дном несколько раз, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом.
    3. Внутри шкафа биобезопасности (класс 2) удалите 100 мкл общей цельной крови с помощью шприца объемом 1 мл для дальнейшего подсчета количества клеток крови.
  2. Центрифугирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском убедитесь, что центрифуга правильно сбалансирована.
    1. После того, как кровь собрана в пробирки PRP, при необходимости подготовьте пробирку с противовесом (поставляется отдельно) с водой до того же уровня, что и кровь в пробирке PRP. Поместите заполненные пробирки в центрифугу напротив друг друга, убедившись, что машина сбалансирована.
    2. Центрифужные образцы в дозе 1 500 x g в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите соответствующую частоту вращения в минуту в соответствии с инструкциями производителя центрифуги. После центрифугирования кровь станет фракционированной. Эритроциты и лейкоциты задерживаются под гелем, а тромбоциты оседают на поверхности геля (рис. 1).
  3. Осторожно инвертируйте трубку PRP 20x, чтобы ресуспендировать отложение тромбоцитов в надосадочной жидкости плазмы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тромбоциты полностью отделены от геля. Плазма должна измениться от прозрачной и прозрачной до мутной. Если присутствуют агрегаты тромбоцитов, их следует собрать вместе с плазмой.
  4. Чтобы собрать PRP, возьмите раствор плазмы из пробирки с помощью устройства для переноса шприца, подключенного к шприцу объемом 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из каждой пробирки будет получено около 5 мл PRP. Теперь раствор PRP готов к смешиванию с готовой окончательной средой. Раствор можно хранить при комнатной температуре (RT) под шкафом безопасности до будущих этапов, связанных с гематологическим анализатором и использованием.
  5. Перед использованием PRP определите концентрацию тромбоцитов, средний объем тромбоцитов и количество эритроцитов и лейкоцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора (Таблица материала). Для этого осторожно извлеките 100 мкл раствора и перелейте в пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PRP используется в качестве аутологичной добавки к культуре в концентрации от 5 до 20% по об. Оптимальная концентрация PRP должна быть определена для каждой клеточной линии. Чтобы предотвратить образование фибринового сгустка, конечную питательную среду следует дополнить 2 ЕД/мл гепарина.

2. Выделение аутологичных фибробластов и культуры в средах, дополненных FBS или PRP

  1. Промойте образцы кожи в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), осторожно встряхнув полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
  2. Если образец кожи относительно большой (>10 см 2 ), поместите образец на крышку 150 см2 чашки для культивирования тканей (эпидермальной стороной вниз). Удалите подкожно-жировую клетчатку с помощью щипцов и ножниц. Чтобы предотвратить высыхание ткани, промывайте салфетку каждые несколько минут в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньшую чашку для культивирования тканей для небольших образцов.
  3. Когда обрезка жира будет завершена, разрежьте ткань примерно на полоски размером примерно 0,5 см х 1,5 см с помощью стерильного скальпеля.
  4. Добавьте 5 мл смеси коллагеназы и диспазы (таблица материалов; 14 единиц Вюнша / мл) в стерильную пробирку объемом 15 мл.
  5. Перенесите разрезанную ткань в трубку, убедившись, что кусочки ткани погружены в раствор. Надежно закройте тюбик.
  6. Поместите пробирки в инкубатор при температуре 37 °C с орбитальным встряхиванием в течение 150 мин. После инкубации поместите пробирку, содержащую ткань, в шкаф биобезопасности.
  7. Поместите крышку стерильной чашки для культивирования диаметром 100 мм вверх дном в шкаф биобезопасности. Переложите переваренный тканевый раствор на дно 100-миллиметровой чашки для культуры, не разбрызгивая. Если в пробирке остались какие-либо кусочки ткани, используйте стерильную пипетку объемом 1 мл или стерильные щипцы для переноса кусочков ткани на дно 100-миллиметровой чашки для культивирования.
  8. Полоской эпидермиса лицом вверх отделите неповрежденный лист эпидермиса от дермы с помощью двух пар щипцов. Удерживайте дерму тканевой полоски парой щипцов и край эпидермиса другой парой щипцов. Разделите дерму и эпидермис на две части, держа отдельные кусочки на одном веке. Постарайтесь выполнить этот шаг быстро и повторите манипуляцию для каждого кусочка ткани.
  9. Перенесите кусочки кожи в новую 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую PBS.
  10. Используя лабораторные щипцы, поместите кусочки кожи в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с 3 мл 0,3% трипсина / PBS. Инкубировать 10-20 мин на водяной бане при температуре 37 °С и переворачивать пробирку несколько раз каждые 2−3 мин.
  11. Чтобы остановить ферментативную реакцию, добавьте 3−5 мл ледяной полной питательной среды (модифицированная среда Дульбекко Eagle [DMEM] или RPMI, содержащая 10% FBS). Энергично прокрутите трубку несколько раз. Отфильтруйте суспензию фибробластов через нейлоновую сетку размером 85 мкм (помещенную поверх пробирки объемом 50 мл) для удаления кожного мусора.
  12. Центрифуга в течение 10 мин при 150 x g, при 4 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 100−1000 мкл полной питательной среды.
  13. Используя трипановый синий (коэффициент разведения x2), смешанный с клеточной суспензией, подсчитайте количество общих и жизнеспособных клеток, заполнив камеру гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток зависит от условий, используемых для ферментативного пищеварения. Чтобы увеличить восстановление клеток и жизнеспособность клеток, образец кожи можно разрезать на более мелкие кусочки.
  14. Планшет 3−10 x 104 клетки в 5 мл полной питательной среды FBS (DMEM, 10% FBS, инактивированный теплом в течение 60 мин при 56 °C, 1% 1 М буферного раствора HEPES, 1% 100x смесь заменимых аминокислот, 1% 100x L-глутамин, 1% 100x пенициллин/стрептомицин, 1% 100x пируват натрия) в колбе для культуры тканей 25 см2 . Инкубировать при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные фибробласты прикрепляются к колбе в течение 24 часов и начинают проявлять веретенообразную форму через 2−3 дня.
  15. На 2-й день аспирируйте среду, содержащую неадгезивные клетки, и добавьте свежую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мертвые клетки в питательной среде влияют на рост жизнеспособных фибробластов, неприлипшие, мертвые клетки должны быть удалены из культуры.
  16. Меняйте среду каждые 3−4 дня, пока культура не достигнет 70−80% слияния.
  17. Чтобы собрать фибробласты, промойте PBS и инкубируйте с раствором трипсина/ЭДТА в течение 3 мин при 37 °C в инкубаторе.
  18. Чтобы остановить реакцию, добавляют 3−5 мл теплой полной питательной среды (DMEM или RPMI, содержащей 10% FBS). Возьмите аликвоту клеточной суспензии, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируют суспензию в течение 5 мин при 200 x g и удаляют среду с помощью аспирации.
  19. Культивируют фибробласты в среде PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 М буферного раствора HEPES, 1% 100x смеси заменимых аминокислот, 1% 100x L-глутамина, 1% 100x пенициллина/стрептомицина, 1% 100x пирувата натрия, 2 ЕД/мл гепарина) в инкубаторе при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная рекомендуемая плотность клеток составляет 4,000 жизнеспособных клеток/см2.
  20. Для оценки влияния PRP на пролиферацию фибробластов семенные фибробласты (пассаж 2) в 24 луночных планшетах с плотностью 8 х 103 клеток на лунку в среде PRP с различными концентрациями PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% и 50%) и с 2 ЕД/мл гепарина или в условиях классической культуральной среды (10% FBS). После 7 дней культивирования добавьте в клетки жизненно важный краситель (фиолетовый пролиферат клеток) и оцените пролиферацию с помощью проточной цитометрии.
  21. Для изучения цитоскелетных перестроек семенные клетки в 96 лунках черных/прозрачных пластин с плоским дном в концентрации 1 x 10 5 клеток/мл в полном ДМЭМ роста FBS (см. шаг 2.14) добавляли0,5 % FBS в течение 24 ч. Обрабатывайте клетки 10% FBS или различными концентрациями PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% и 50%) в течение 7 дней.
    1. Зафиксируйте фибробласты 4% параформальдегидом в течение 10 мин и пермеабилизируйте 0,1% Triton X-100 в течение 5 мин при ЛТ. Окрасьте фибробласты 50 мл 5 ЕД / мл фаллоидина, промыть 2 раза PBS и пометить 50 мл 1 мг / мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин. Для визуализации окрашивания фаллоидина использовали многомодовый считыватель изображений клеток Cytation 3 (BioTek).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта запатентованная технология представляет собой простое, быстрое и воспроизводимое медицинское устройство, используемое для производства стандартизированных препаратов PRP. Это одноступенчатая, полностью закрытая система, которая позволяет получать PRP из венозной цельной крови после 5 минут центрифугирования при 1,500 x g (благодаря технологии разделительного геля). PRP, полученный после центрифугирования, очищается от красных и белых кровяных телец, которые находятся под гелем. После нескольких инверсий пробирки тромбоциты, находящиеся поверх геля, ресуспендируют в плазме, и PRP готов к использованию (рис. 1).

Для оценки воспроизводимости содержания клеток крови в препарате анализировали образцы цельной крови и PRP у 10 разных пациентов с помощью гематологического анализатора. После обработки цельной крови с помощью устройства большинство эритроцитов (эритроцитов) и лейкоцитов (лейкоцитов) были удалены. Средняя концентрация тромбоцитов увеличилась в 1,5 раза по сравнению с физиологической концентрацией в цельной крови (рис. 2).

В аутологичной культуральной установке изолированные фибробласты пациента культивировали в присутствии возрастающих концентраций PRP (1−50%) по сравнению с классическими условиями питательной среды (10% FBS). После 7 дней культивирования без смены среды культуры, загрунтованные 20% PRP, показали большее количество жизнеспособных фибробластов (рис. 3 A, B; в 7,7 раза выше по сравнению с контрольным условием). Окрашивание фаллоидином показало, что морфологическое изменение, наблюдаемое при активации PRP, было связано с реорганизацией F-актина, что является признаком активации фибробластов (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка аутологичного PRP для использования в качестве добавки питательной среды для экспансии аутологичных клеток in vitro в условиях GMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Количество клеток крови и тромбоцитов. PRP, приготовленный с помощью коммерческого устройства, демонстрирует высоковоспроизводимое содержание клеток крови, несмотря на различия между донорами. PLT: тромбоциты (x 105); лейкоциты: лейкоциты (x 103); Эритроциты: эритроциты (х 106), n = 10 пациентов. Эта цифра была изменена по сравнению с Berndt et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка пролиферативных эффектов PRP на культуру аутологичных фибробластов. (A) Репрезентативные микроскопические изображения светлого поля, демонстрирующие усиливающие эффекты 20% среды PRP, добавленной к фибробластам, выделенным от того же пациента после 7 дней культивирования. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Оценка пролиферативного эффекта PRP методом проточной цитометрии с использованием витального красителя. Пролиферативные эффекты увеличения концентраций PRP по сравнению (1−50%) с 10% FBS (n = 10 пациентов) на нормальный дермальный фибробласт человека (NHDF) в течение 7 дней без изменения среды в полной аутологичной системе (клетки и PRP от одного и того же пациента; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Эта цифра была изменена по сравнению с Berndt et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Визуализация цитоскелета с помощью окрашивания F-актина. Через 7 дней, выращенных в 20% PRP (правая панель), фибробласты активируются и реорганизуют свой цитоскелет по сравнению с контрольными условиями культивирования с 10% FBS (левая панель). Масштабная линейка = 200 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Berndt et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущества использования аутологичных фибробластов в качестве естественной альтернативы по сравнению с другими наполнителями в терапии раневых клеток включают хорошую биосовместимость, минимальные побочные эффекты и простоту сбора и использования. Однако, прежде чем использовать эти терапевтические средства в повседневных клинических условиях, необходимы надлежащие доклинические исследования для выявления особенностей роста и оценки биологической функции и безопасности изолированных фибробластов как до, так и после трансплантации. Таким образом, сразу после процесса выделения необходимо быстро выполнить экспансию клеток in vitro, чтобы ограничить количество делений клеток. Условия культивирования должны строго контролироваться, чтобы обеспечить безопасность и эффективность конечного аутологичного биологического продукта.

В опубликованных доклинических исследованиях клетки в проходах 3-4 обычно выбирались для инъекции, поскольку они наиболее подходят с точки зрения количества клеток и пролиферативной/секреторной активности15. Большинство доклинических исследований было проведено с питательными средами, в которых FBS является источником питательных веществ и факторов роста16. Тем не менее, эта ксеногенная добавка для роста представляет возможный риск инфекции и иммунологических реакций. В связи с распространенностью губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE) в стадах во всем мире существует серьезная обеспокоенность со стороны регулирующих органов в отношении использования FBS в качестве добавки к клеточным культурам из-за риска введения ксеногенного материала в культуры клеточной терапии10.

Обычно пролиферация фибробластов или мезенхимальных стволовых клеток (МСК) достигается с помощью питательных сред с добавлением FBS. Несмотря на то, что FBS является достаточным источником питательных веществ для клеточных культур, он создает дополнительные препятствия, помимо риска заражения зоонозами. Во-первых, продукты FBS представляют собой огромные производственные затраты по сравнению с продуктами, полученными из крови человека, отчасти из-за снижения скорости пролиферации и длительного периода расширения культивирования9. Во-вторых, FBS является источником ксенопротеинов, которые взаимодействуют с изолированными клетками, тем самым увеличивая риск иммунной реакции из-за появления антител против поверхностных белковых комплексов на трансплантированных клетках10.

Чтобы устранить потенциальные недостатки FBS в качестве питательного вещества для клинической экспансии клеток, в качестве альтернативы были введены продукты, полученные из крови человека. В некоторых исследованиях предлагалось заменить FBS в питательных средах аутологичной сывороткой человека для расширения клеток, но, поскольку пролиферация клеток происходит медленно, все же требуется длительное время культивирования (3 недели) и несколько пассажных клеток перед трансплантацией17,18.

Другие группы использовали лизат тромбоцитов (PL), бесклеточную надосадочную жидкость, богатую факторами роста, которые высвобождаются из тромбоцитов после разрушения концентратов тромбоцитов при замораживании-оттаивании. Основным преимуществом PL по сравнению с PRP является его потенциал хранения в замороженном виде. Следовательно, один и тот же лот можно использовать для последовательных применений клеточных культур. Кроме того, как готовый продукт, он может быть стандартизирован путем анализа содержания фактора роста и других биологических особенностей перед использованием. Некоторые недостатки заключаются в том, что он аллогенный, и партии объединяются от нескольких доноров. Кроме того, поскольку ЛП не содержит живых тромбоцитов, которые могут продуцировать цитокины и факторы роста до 10 дней, питательные среды, содержащие ПЛ, необходимо менять каждые 3 дня (вместо 7−10 дней, когда культура дополняется PRP)19. Расширение клеток in vitro в их собственном источнике факторов роста и питательных веществ, обеспечиваемых этим препаратом PRP, безусловно, выгодно. Препарат не содержит в клеточной культуре каких-либо ксеногенных добавок, которые могут вызвать отторжение, аллергию или передачу инфекционного заболевания.

В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что аутологичный PRP может быть использован в качестве безопасной, эффективной и экономичной питательной среды для пролиферации мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) жирового происхождения (ADSC)20. Среды, снабженные 20% аутологичным PRP, увеличивали пролиферацию клеток до 13 раз без изменения фенотипа клеток. В клиниках считается, что PRP обладает мощными способностями к омоложению и регенерации.

В настоящее время PRP, полученный из крови пациента, уже эффективно используется в клинических условиях только для заживления ран 21 или в сочетании с гиалуроновой кислотой 22,23 или регенерацией кости 24,25; или только омоложение кожи26 или в сочетании с клетками стромально-васкулярной фракциижирового происхождения 27,28,29. Это побудило к исследованию использования собственного PRP пациента для стимулирования экспансии аутологичных фибробластов.

С этой целью, а также для обеспечения воспроизводимости результатов, полученных с помощью препарата PRP, мы разработали специальное устройство PRP. Эта закрытая система позволяет стандартизировать препараты PRP, что является необходимым условием для минимизации колебаний от донора пациента (в отношении концентрации тромбоцитов и вариаций, зависящих от оператора). Количество клеток крови, полученное от 10 пациентов, показало, что протокол обладает высокой воспроизводимостью (рис. 2). Кроме того, было показано, что PRP обладает мощным эффектом в качестве усилителя пролиферации, до 7,7 раза по сравнению с FBS (рис. 3B). Это важно для того, чтобы сократить затраты и время, необходимые для процесса расширения. В недавнем исследовании мы дополнительно проанализировали, как PRP влияет на пролиферацию и дифференцировку фибробластов. 20% PRP показал наилучшую эффективность, не влияя на фенотип клетки или генотип14.

Ограничением метода является то, что среда, содержащая PRP, должна быть приготовлена с гепарином для предотвращения образования сгустка. Несмотря на то, что в этом устройстве используется стандартный плазменный антикоагулянт (антикоагулянт цитрата натрия и хелатор кальция), образование фибриновых сгустков может происходить при добавлении плазмы к питательной среде, содержащей кальций30. Гепарин в дополнение к препарату PRP предотвращает образование этого фибринового сгустка. Однако гепарины могут связывать факторы роста и могут препятствовать росту клеток30. Например, было показано, что гепарин отрицательно влияет на пролиферацию дермальных фибробластов31. Однако используемые концентрации были в 4 раза более концентрированными по сравнению с концентрацией, использованной в этом исследовании (2 Ед / мл).

Кроме того, коммерческий гепарин в основном очищается из свиных источников; Следовательно, из-за своего животного происхождения он представляет собой ограничение в развитии полностью свободной от ксено среды. Хотя свиной гепарин был одобрен для терапии человека, сообщалось о гиперчувствительности к молекуле32. Еще одно ограничение заключается в том, что PRP должен использоваться в качестве свежей биологической добавки и не может быть заморожен. Что касается периода полувыведения тромбоцитов, ранее было показано, что через 10 дней половина тромбоцитов, присутствующих в PRP, все еще жизнеспособна33. По этой причине PRP хранят при комнатной температуре и используют в течение 10 дней. Более того, для будущих клеточных терапий, требующих производства огромного количества клеток, основным ограничением является общее количество крови, которое может быть изъято у пациента.

Таким образом, этот протокол демонстрирует, что замена FBS на PRP приводит к быстрому расширению фибробластов. Тромбоциты, присутствующие в PRP, медленно высвобождают организованную смесь факторов роста во время фазы культивирования экспансии. Представленное устройство используется во время стандартизированной процедуры, что снижает сложность и практическое время при подготовке PRP. Таким образом, эта система считается подходящим методом, когда требуется быстрое и безопасное расширение ex vivo для применения аутологичной клеточной терапии в условиях GMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Этот проект был профинансирован Regen Lab SA. Сара Берндт является главным менеджером проекта клеточной терапии в Regen Lab и работает в Regen Lab SA. Антуан Турци является генеральным директором RegenLab.

Acknowledgments

Мы благодарим г-на Грегори Шнайтера за техническую помощь в предоставлении данных проточной цитометрии; Профессору Мюриэль Куэнде (Лаборатория фармакогнозии, Школа фармацевтических наук и Женевский университет) за разрешение использовать проточный цитометр Attune и высокопроизводительный микроскоп Cytation 3; Профессор Бриджит Питте за научные советы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

Ретракция выпуск 168 обогащенная тромбоцитами плазма PRP фибробласты клеточная пролиферация клеточная миграция заживление ран клеточная культура клеточная терапия
Получение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы для усиления экспансии фибробластов человека in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter