Summary
该协议提出了一种产生PRP以促进100%自体成纤维细胞培养系统中细胞体外扩增的装置。
Abstract
目前，临床上对使用自体成纤维细胞进行皮肤修复有很大的兴趣。在大多数情况下，需要在体外培养皮肤细胞。然而，使用异种或同种异体培养基的细胞培养有一些缺点（即感染因子传播或细胞扩增缓慢的风险）。在这里，开发了一种自体培养系统，用于使用患者自身的富血小板血浆（PRP）在体外扩增人类皮肤成纤维细胞。在进行腹部成形术时，从患者身上分离出人真皮成纤维细胞。使用补充有胎牛血清 （FBS） 或 PRP 的培养基随访培养物长达 7 天。评估PRP制剂中的血细胞含量、增殖和成纤维细胞分化。该协议描述了使用专用医疗设备获得标准化，非活化PRP制剂的方法。该制剂只需要一个医疗设备（CuteCell-PRP）和离心机。该装置适用于足够的医疗实践条件，是一种一步法、无热原和无菌封闭系统，需要 1，500 x g 的单次软旋转离心 5 分钟。离心后，血液成分被分离，富血小板血浆很容易收集。该装置可实现快速、一致和标准化的PRP制备，可用作人体细胞体外扩增的细胞培养补充剂。这里获得的PRP含有1.5倍的血小板浓度，与全血相比，优先去除红细胞和白细胞。结果表明，与FBS（7.7x）相比，PRP在细胞增殖中表现出促进作用，并且在PRP处理后成纤维细胞被激活。
Introduction
再生医学旨在治愈或替换因年龄、疾病或创伤而受损的组织和器官，并纠正先天性缺陷。在自体治疗中，从患者身上取出细胞或组织，扩增或修饰，然后重新引入供体。这种形式的疗法在皮肤病学领域具有广泛的潜力1。在自体成纤维细胞治疗中，对患者的成纤维细胞进行培养并重新注射以治疗皱纹、鼻痘或痤疮疤痕。由于成纤维细胞是真皮中的主要功能细胞，因此注射自体成纤维细胞可能比其他疗法更有益于面部年轻化2。
在皮肤中，成纤维细胞负责细胞外蛋白（即胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖胺聚糖）的合成和分泌。它们还释放生长因子，调节正常皮肤稳态和伤口愈合中的细胞功能、迁移和细胞-基质/细胞-细胞相互作用3。皮肤成纤维细胞已被引入为一种潜在的临床细胞疗法，用于皮肤伤口愈合4，组织再生5或美容和整形外科手术中的皮肤填充剂6。一些研究甚至表明，在再生医学的背景下，成纤维细胞可能比间充质干细胞更实用和有效的细胞疗法7。
为了获得足够数量的成纤维细胞用于临床应用，细胞扩增通常是强制性的。体外/体外细胞培养需要补充生长因子、蛋白质和酶的基础培养基来支持细胞粘附和增殖。胎牛血清（FBS）是细胞培养基的常用补充剂，因为胎儿血液1）与成人血液相比富含生长因子，2）抗体含量低8。随着细胞治疗的进展，人们担心将FBS添加到培养基中的经典细胞培养条件的安全性。此外，现在有一种用替代品9取代FBS的趋势。几种FBS替代品已显示出有希望的结果10。
这里选择了富血小板血浆（PRP）替代品，我们开发了一种医疗设备来生产PRP的标准化制剂，名为CuteCell-PRP。该装置的预期用途是制备自体PRP，用作GMP条件下自体细胞体外扩增的培养基补充剂。
PRP被定义为血浆中的浓缩血小板悬浮液。由于有许多制备方案，它们在1）所需的血液量，2）使用的装置类型和3）离心方案方面有所不同，因此所得血小板浓度从略高于血液基线值的10倍到超过10倍不等。此外，PRP制剂含有不同水平的红细胞和白细胞污染。因此，术语“PRP”用于描述其生物成分和潜在治疗效果差异很大的产品。
在大多数研究中，FBS替代是使用不同浓度的PRP激活（通过凝血酶或钙）实现的。这种人工激活引起血小板生长因子从15分钟到24小时11的立即和重要的释放。因此，据信血小板活化对于细胞培养中的应用是不希望的，其中需要从逐渐的血小板脱颗粒中缓慢释放生长因子。
PRP治疗涉及在浓缩血浆中制备自体血小板12。最佳血小板浓度尚不清楚，有多种商业设备可用于制备PRP13。这种缺乏标准化是由于研究之间的不一致造成的，并导致了关于注射剂量和时间的黑匣子。该协议描述了使用这种专用PRP装置获得自体PRP的程序，以在100%自体离体培养模型中扩增皮肤成纤维细胞。
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Protocol
研究方案符合赫尔辛基宣言，所有患者在参与研究前都提供了书面知情同意书。皮肤样本来自在日内瓦大学医院（瑞士日内瓦）整形、重建和美容外科接受腹部整形术的健康女性。该程序符合《赫尔辛基宣言》的原则，并得到了当地机构伦理委员会的批准（协议#3126）。
1. 准备PRP
注意：CuteCell-PRP 管（材料表）设计用于在闭路系统中从少量患者血液中快速制备 PRP。
- 采集全血
注意：根据医疗机构的收集方案，使用直接连接到PRP管的蝶针从手臂的外周静脉收集自体血液。如果患者处于麻醉状态，则可以通过静脉插管直接抽血。- 打开管泡罩包装。进行静脉穿刺并用全血填充所需数量的PRP管。管内的真空将能够自动收集所需体积的血液（~10 mL）。
- 小心地将试管倒置几次，将血液与抗凝剂混合。
- 在生物安全柜（2 类）内，使用 1 mL 注射器取出 100 μL 全血总量，以进行进一步的血细胞数计数。
- 离心
注意： 在启动离心机之前，请确保离心机已正确平衡。- 一旦血液被收集到PRP管中，如有必要，准备一个平衡管（单独供应），其中的水与PRP管中的血液相同。将装满的试管彼此相对地放入离心机中，确保机器平衡。
- 将样品以1，500 x g 离心5分钟。
注意：根据离心机制造商的说明设置相应的转速。离心后，血液将被分馏。红细胞和白细胞被困在凝胶下，血小板沉淀在凝胶表面（图1）。
- 轻轻倒置PRP管20倍，将血小板沉积物重悬于血浆上清液中。
注意：确保血小板与凝胶完全分离。等离子体应从透明变为浑浊。如果存在血小板聚集体，应将其与血浆一起收集。 - 要收集PRP，请使用连接到10mL注射器的注射器转移装置从管中取出血浆溶液。
注意：每个试管将获得约 5 mL 的 PRP。PRP溶液现在可以混合到最终培养基制备中。该溶液可以在室温（RT）下保存在安全柜下，直到将来的步骤涉及血液学分析仪和使用。 - 在使用PRP之前，使用自动血液学分析仪确定血小板浓度，平均血小板体积以及红细胞和白细胞的数量（材料表）。为此，请小心地取出 100 μL 溶液并转移到 1.5 mL 管中。
注意：PRP用作自体培养补充剂，浓度在5-20%v / v之间。需要为每个细胞系确定PRP的最佳浓度。为防止纤维蛋白凝块形成，最终培养基应补充 2 U/mL 肝素。
2. 在补充FBS或PRP的培养基中分离自体成纤维细胞和培养
- 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中轻轻摇动，在 50 mL 聚丙烯管中洗涤皮肤样品。
- 如果皮肤样本相对较大（>10 cm 2），则将样品放在 150 cm2 组织培养皿的盖子上（表皮面朝下）。用一把镊子和剪刀取出皮下脂肪组织。为防止纸巾变干，请每隔几分钟在PBS中冲洗一次纸巾。
注意：对于较小的样品，请使用较小的组织培养皿。 - 脂肪修剪完成后，使用无菌手术刀将组织切成约 0.5 厘米 x 1.5 厘米的条状。
- 将 5 mL 胶原酶分散酶混合物（材料表;14 Wünsch 单位/mL）加入无菌 15 mL 管中。
- 将切割的组织转移到试管中，确保组织碎片浸没在溶液中。盖紧管子。
- 将试管置于37°C的培养箱中，轨道振荡150分钟。孵育后，将装有组织的管放入生物安全柜中。
- 将无菌100毫米培养皿的盖子倒置在生物安全柜中。将消化的组织溶液转移到100mm培养皿的底部，不要飞溅。如果管中残留任何组织碎片，请使用无菌 1 mL 移液管或无菌镊子将组织碎片转移到 100 mm 培养皿的底部。
- 表皮条朝上，使用两对镊子将完整的表皮片与真皮分开。用一对镊子握住组织条的真皮，用另一对镊子握住表皮的边缘。将真皮和表皮撕成两块，将分离的碎片放在同一个盖子上。尝试快速执行此步骤，并对每块组织重复操作。
- 将真皮碎片转移到含有PBS的新100 mm培养皿中。
- 使用实验室镊子，将真皮碎片放入含有 3 mL 0.3% 胰蛋白酶/PBS 的 15 mL 聚丙烯管中。在37°C水浴中孵育10-20分钟，每2-3分钟倒置试管数次。
- 为了停止酶促反应，加入 3−5 mL 冰冷的完全生长培养基（Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 [DMEM] 或含有 10% FBS 的 RPMI）。用力涡旋管子几次。通过 85 μm 尼龙网（放置在 50 mL 管顶部）过滤成纤维细胞悬浮液以去除真皮碎片。
- 在4°C下以150× g离心10分钟。 吸出上清液并将沉淀重悬于100−1，000μL完全生长培养基中。
- 使用台盼蓝（稀释因子x2）与细胞悬液混合，通过填充血细胞计数器的腔室来计数总细胞数和活细胞数。
注意：细胞活力取决于用于酶消化的条件。为了提高细胞回收率和细胞活力，可以将皮肤样品切成更小的碎片。 - 在5mL的完整FBS生长培养基（DMEM，10%FBS在56°C下热灭活60分钟，1%1M HEPES缓冲溶液，1%100x非必需氨基酸混合物，1%100xL-谷氨酰胺，1%100x青霉素/链霉素，1%100x丙酮酸钠）中板3-10x 100x4细胞）在25cm2组织培养瓶中。在37°C孵育。
注意：活的成纤维细胞将在24小时内附着在烧瓶上，并在2-3天内开始呈现纺锤形。 - 在第2天，吸出含有非贴壁细胞的培养基并加入新鲜培养基。
注意：由于培养基中的死细胞会影响活成纤维细胞的生长，因此必须从培养物中去除非贴壁的死细胞。 - 每3-4天更换一次培养基，直到培养物达到70-80%汇合度。
- 为了收获成纤维细胞，用PBS洗涤并在培养箱中与胰蛋白酶/ EDTA溶液在37°C孵育3分钟。
- 要停止反应，加入 3−5 mL 温热的完全生长培养基（含有 10% FBS 的 DMEM 或 RPMI）。取等分试样的细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞。以200× g 离心悬浮液5分钟，并通过抽吸除去培养基。
- 在37°C的培养箱中培养PRP培养基（DMEM，20%PRP，1%1M HEPES缓冲溶液，1%100x非必需氨基酸混合物，1%100xL-谷氨酰胺，1%100x青霉素/链霉素，1%100x丙酮酸钠，2U / mL肝素）。
注意：推荐的最小细胞密度为 4，000 个活细胞/cm2。 - 为了评估PRP对成纤维细胞增殖的影响，在具有不同PRP浓度（1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%）的PRP培养基中以每孔8 x 103个细胞 的密度在24孔板中接种种子成纤维细胞（传代2），并使用2 U / mL肝素或在经典培养基条件下（10%FBS）。培养7天后，向细胞中加入活染料（细胞增殖紫），并通过流式细胞术评估增殖。
- 为了研究细胞骨架重排，在96孔黑色/透明平底板中以1 x 105 个细胞/ mL的浓度在完整的FBS生长DMEM（参见步骤2.14）中接种细胞，补充0.5%FBS24小时。用 10% FBS 或不同 PRP 浓度（1%、5%、10%、20%、30%、40% 和 50%）处理细胞 7 天。
- 用 4% 多聚甲醛固定成纤维细胞 10 分钟，并在室温下用 0.1% Triton X-100 透化 5 分钟。 用 50 mL 的 5 U/mL 鬼笔环肽染色成纤维细胞，用 PBS 洗涤 2 次，并用 50 mL 的 1 mg/mL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 标记 5 分钟。Cytation 3 细胞成像多模式读数仪 （BioTek） 用于可视化鬼笔环肽染色。
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Representative Results
这项专利技术是一种简单、快速且可重复的医疗设备，用于生产标准化的 PRP 制剂。这是一个一步法，全封闭系统，允许在以1，500 x g 离心5分钟后从静脉全血制备PRP（由于分离凝胶技术）。离心后获得的PRP从位于凝胶下方的红细胞和白细胞中清除。经过几次试管倒置后，凝胶顶部的血小板重新悬浮在血浆中，PRP即可使用（图1）。
为了评估制剂中血细胞含量的可重复性，使用血液学分析仪分析了10名不同患者的全血和PRP样品。用该设备处理全血后，去除了大部分红细胞（RBC）和白细胞（WBC）。与全血中的生理浓度相比，平均血小板浓度增加了1.5倍（图2）。
在自体培养设置中，与经典培养基条件（10%FBS）相比，患者的分离成纤维细胞在PRP浓度增加（1-50%）的存在下培养。在不更换培养基的情况下培养7天后，用20%PRP引发的培养物表现出更多数量的活成纤维细胞（图3A，B;与对照条件相比高7.7倍）。鬼笔环肽染色证明，在PRP激活时观察到的形态变化与F-肌动蛋白重组有关，F-肌动蛋白重组是成纤维细胞活化的特征（图4）。
图1：自体PRP的制备，用作GMP条件下自体细胞体外扩增的培养基补充剂。请点击此处查看此图的大图。
图 2：血细胞和血小板计数。 用商业设备制备的PRP显示出高度可重复的血细胞含量，尽管供体之间存在差异。PLT：血小板（x 105）;白细胞：白细胞（x 103）;红细胞：红细胞（x 106），n = 10名患者。这个数字是从Berndt等人14修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：PRP增殖对自体成纤维细胞培养影响的评估。 （A）代表性明场显微镜图像，显示培养7天后将20%PRP培养基添加到从同一患者分离的成纤维细胞中的增强作用。比例尺 = 100 μm。 （B）使用活体染料通过流式细胞术评估PRP增殖效应。与10%FBS（n = 10名患者）相比（1-50%）增加PRP浓度对正常人真皮成纤维细胞（NHDF）7天的增殖作用，在完整的自体系统中没有培养基变化（来自同一患者的细胞和PRP;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。这个数字是从Berndt等人14修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过 F-肌动蛋白染色的细胞骨架可视化。 在20%PRP（右图）中生长7天后，与使用10%FBS的对照培养条件（左图）相比，成纤维细胞被激活并重组其细胞骨架。比例尺 = 200 μm。这个数字是从Berndt等人14修改的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
与伤口细胞治疗中的其他填充材料相比，使用自体成纤维细胞作为天然替代品的优点包括良好的生物相容性、最小的副作用以及易于收获和使用。然而，在日常临床环境中使用这些疗法之前，有必要进行适当的临床前研究，以确定移植前后分离成纤维细胞的生长特征并评估其生物学功能和安全性。因此，在分离过程之后，必须快速进行细胞的体外扩增，以限制细胞分裂的次数。必须严格控制培养条件，以确保最终自体生物制品的安全性和有效性。
在已发表的临床前研究中，通常选择注射第3-4代的细胞，因为它们在细胞数量和增殖/分泌活性方面最合适15。大多数临床前研究都是使用以FBS为营养物质和生长因子来源的培养基进行的16。然而， 这种异种生长补充剂存在感染和免疫反应的可能风险.由于牛海绵状脑病（BSE）在全球畜群中发生，由于将异种物质引入细胞治疗培养物的风险，使用FBS作为细胞培养补充剂存在相当大的监管问题10。
通常，成纤维细胞或间充质干细胞（MSC）的增殖是使用补充FBS的生长培养基实现的。虽然FBS一直是细胞培养的充足营养供应，但它除了人畜共患病污染的风险外，还带来了额外的障碍。首先，与人类血液衍生产品相比，FBS产品的制造成本很高，部分原因是增殖率降低和培养扩增期延长9。其次，FBS是与分离细胞相互作用的异种蛋白的来源，因此由于移植细胞上出现针对表面蛋白复合物的抗体，因此增加了免疫反应的风险10。
为了解决FBS作为细胞临床扩增营养素的潜在缺点，已经引入了人类血液衍生产品作为替代品。一些研究提出用自体人血清代替培养基中的FBS进行细胞扩增，但由于细胞增殖缓慢，在移植前仍需要较长的培养时间（3周）和多次细胞传代17，18。
其他小组使用血小板裂解物（PL），这是一种富含生长因子的无细胞上清液，在血小板浓缩物冻融破坏后从血小板释放。与PRP相比，PL的主要优势在于其冷冻储存潜力。因此，同一批次可用于连续的细胞培养应用。此外，作为一种现成的产品，它可以在使用前通过分析生长因子含量和其他生物学特征来标准化。一些缺点是它是同种异体的，并且批次是从几个供体汇集的。此外，由于PL不含任何活血小板，其可产生细胞因子和生长因子长达10天，因此必须每3天更换一次含有PL的培养基（而不是补充PRP培养物时为7-10天）19。在体外扩大细胞自身生长因子和这种PRP制剂提供的营养物质来源肯定是有利的。该制剂在细胞培养物中不含任何可能导致排斥、过敏或传染病传播的异种补充剂。
在先前的研究中，已经证明自体PRP可用作脂肪来源的间充质干细胞（ADSC）增殖的安全，高效且具有成本效益的培养基20。提供 20% 自体 PRP 的培养基在不改变细胞表型的情况下将细胞增殖提高多达 13 倍。在诊所，PRP被认为具有强大的恢复和再生能力。
目前，从患者血液中获得的PRP已经在临床环境中有效地用于单独的伤口愈合21或与透明质酸22，23或骨再生24，25结合使用;或单独进行皮肤嫩肤26或与脂肪衍生的基质血管组分细胞27、28、29组合。这促使人们研究使用患者自身的PRP来促进自体成纤维细胞的扩增。
为此，为了确保PRP制备获得的结果的可重复性，我们开发了一种特殊的PRP设备。这种封闭系统允许PRP制剂的标准化，这是最大限度地减少患者供体波动（关于血小板浓度和操作者依赖性变化）的先决条件。从10名患者获得的血细胞计数表明该方案具有高度可重复性（图2）。此外，结果表明，PRP作为增殖助推器具有强大的效果，与FBS相比高达7.7倍（图3B）。这对于减少扩展过程所需的成本和时间非常重要。在最近的一项研究中，我们进一步分析了PRP如何影响成纤维细胞的增殖和分化。20%的PRP在不影响细胞表型或基因型14的情况下显示出最佳疗效。
该方法的局限性在于含有PRP的培养基必须用肝素制备以防止凝块形成。即使在该装置中使用了标准的血浆抗凝剂（柠檬酸钠抗凝剂和钙螯合剂），当将血浆添加到含有钙30的培养基中时，也会形成纤维蛋白凝块。除PRP制剂外，肝素可防止这种纤维蛋白凝块形成。然而，肝素可以结合生长因子并可能干扰细胞生长30。例如，肝素被证明对真皮成纤维细胞增殖产生负面影响31。然而，与本研究中使用的浓度（2 U/mL）相比，使用的浓度高出4倍。
此外，商业肝素主要从猪源纯化;因此，由于其动物来源，它代表了完全无异种培养基开发的局限性。尽管猪肝素已被批准用于人类治疗，但据报道对该分子的超敏反应32。另一个限制是PRP必须用作新鲜的生物补充剂，不能冷冻。关于血小板的半衰期，先前已经表明，10天后，PRP中存在的一半血小板仍然存活33。因此，PRP在室温下保存并使用10天。此外，对于未来需要产生大量细胞的细胞疗法，主要限制是可以从患者身上抽取的血液总量。
总之，该协议表明用PRP代替FBS会导致成纤维细胞的快速扩增。PRP中存在的血小板在扩增的培养阶段缓慢释放生长因子的协调混合物。所展示的设备用于标准化程序，可减少制备PRP期间的复杂性和动手时间。因此，当GMP条件下的自体细胞治疗应用需要快速安全的离体扩增时，该系统被认为是一种合适的方法。
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Disclosures
该项目由Regen Lab SA资助。Sarah Berndt是Regen Lab的细胞治疗主管项目经理，受雇于Regen Lab SA。Antoine Turzi是RegenLab的首席执行官。
Acknowledgments
我们感谢Grégory Schneiter先生在流式细胞术数据方面的技术援助;Muriel Cuendet教授（药学院和日内瓦大学生药学实验室）允许使用Atune流式细胞仪和Cytation 3高通量显微镜;Brigitte Pittet教授提供科学建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well black clear flat bottom | BD Falcon | 353219 | 32/case |
| Cell trace Violet Dye | Thermo Fischer Scientific | C34557 | 180 assays |
| CuteCell PRP | Regen Lab SA | CC-PRP-3T | 3 tubes per package |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 mg |
| DMEM | Gibco | 52400-025 | 500 mL |
| FBS | Gibco | 10270106 | 500 mL |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030024 | 100 mL |
| Hematology Counter | Sysmex | KK-21N | |
| Heparin 5000E Liquemine | Drossapharm AG | 0.5 mL | |
| HEPES Buffer Solution 1M | Gibco | 15630-056 | 100 mL |
| Liberase DH | Roche | 5401054001 | 2x 5 mg per package |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140-035 | 100 mL |
| Na Pyruvate 1mg/mL | Gibco | 11360-039 | 100 mL |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 mL |
| Phalloidin alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A12379 | 300 units |
| RPMI | Gibco | 31966-021 | 500 mL |
| Trypsin 1x 0.25% | Gibco | 25050-014 | 100 mL |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | 100 mL |
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