Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنتاج البلازما الذاتية الغنية بالصفائح الدموية لتعزيز توسع الخلايا الليفية البشرية في المختبر

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

يقدم هذا البروتوكول جهازا ينتج PRP لتعزيز التوسع في المختبر للخلايا في نظام زراعة الخلايا الليفية الذاتية بنسبة 100٪.

Abstract

يوجد حاليا اهتمام سريري كبير باستخدام الخلايا الليفية الذاتية لإصلاح الجلد. في معظم الحالات ، مطلوب زراعة خلايا الجلد في المختبر. ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا باستخدام وسائط الثقافة الزينوجينية أو الخيفية لها بعض العيوب (أي خطر انتقال العوامل المعدية أو بطء توسع الخلايا). هنا ، تم تطوير نظام زراعة ذاتي لتوسيع خلايا الخلايا الليفية للجلد البشري في المختبر باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخاصة بالمريض (PRP). يتم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية عن المريض أثناء خضوعه لعملية شد البطن. تتم متابعة الثقافات لمدة تصل إلى 7 أيام باستخدام وسط مكمل إما بمصل بقري الجنين (FBS) أو PRP. يتم تقييم محتوى خلايا الدم في الاستعدادات PRP ، والانتشار ، وتمايز الخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول طريقة الحصول على إعداد موحد وغير نشط ل PRP باستخدام جهاز طبي مخصص. يتطلب التحضير فقط جهازا طبيا (CuteCell-PRP) وأجهزة طرد مركزي. هذا الجهاز مناسب في ظل ظروف الممارسة الطبية الكافية وهو نظام مغلق من خطوة واحدة وخالي من الحيوية ومعقم يتطلب طردا مركزيا واحدا ناعما يبلغ 1500 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل مكونات الدم ، ويتم جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية بسهولة. يسمح هذا الجهاز بإعداد سريع ومتسق وموحد ل PRP يمكن استخدامه كمكمل لزراعة الخلايا للتوسع في المختبر للخلايا البشرية. يحتوي PRP الذي تم الحصول عليه هنا على تركيز 1.5 ضعف الصفائح الدموية مقارنة بالدم الكامل معا ، مع إزالة تفضيلية لخلايا الدم الحمراء والبيضاء. تبين أن PRP يقدم تأثيرا معززا في تكاثر الخلايا مقارنة ب FBS (7.7x) وأن الخلايا الليفية يتم تنشيطها عند علاج PRP.

Introduction

يهدف الطب التجديدي إلى شفاء أو استبدال الأنسجة والأعضاء التي تضررت بسبب العمر أو المرض أو الصدمة بالإضافة إلى تصحيح العيوب الخلقية. في العلاج الذاتي ، يتم سحب الخلايا أو الأنسجة من المريض ، أو توسيعها أو تعديلها ، ثم إعادة إدخالها إلى المتبرع. هذا النوع من العلاجات له إمكانات واسعة في مجال الأمراض الجلدية1. في علاج الخلايا الليفية الذاتية ، يتم زراعة الخلايا الليفية للمريض وإعادة حقنها لعلاج التجاعيد أو القوافي أو ندبات حب الشباب. نظرا لأن الخلايا الليفية هي الخلايا الوظيفية الرئيسية في الأدمة ، فقد يكون حقن الخلايا الليفية الذاتية أكثر فائدة من العلاجات الأخرى في تجديد شباب الوجه2.

في الجلد ، تكون الخلايا الليفية مسؤولة عن تخليق وإفراز البروتينات خارج الخلية (مثل الكولاجين والإيلاستين وحمض الهيالورونيك والجليكوزامينوجليكان). كما أنها تطلق عوامل النمو التي تنظم وظيفة الخلية ، والهجرة ، وتفاعلات مصفوفة الخلية / الخلية في توازن الجلد الطبيعي والتئام الجروح3. تم بالفعل إدخال الخلايا الليفية الجلدية كعلاج خلوي سريري محتمل لالتئام جروح الجلد4 ، أو تجديد الأنسجة5 ، أو الحشوات الجلدية في إجراءات الجراحة التجميليةوالتجميلية 6. حتى أن بعض الدراسات تشير إلى أنه في سياق الطب التجديدي ، قد تكون الخلايا الليفية علاجا خلويا أكثر عملية وفعالية من الخلايا الجذعية الوسيطة7.

للحصول على عدد كاف من الخلايا الليفية للتطبيقات السريرية ، عادة ما يكون توسيع الخلايا إلزاميا. تتطلب زراعة الخلايا خارج الجسم الحي / في المختبر وسطا قاعديا مكملا بعوامل النمو والبروتينات والإنزيمات لدعم التصاق الخلايا وتكاثرها. مصل الجنين البقري (FBS) هو مكمل شائع لوسائط زراعة الخلايا ، لأن دم الجنين 1) غني بعوامل النمو مقارنة بدم البالغين و 2) يقدم محتوى منخفض من الأجسام المضادة8. مع تقدم العلاج الخلوي، هناك مخاوف بشأن سلامة ظروف زراعة الخلايا الكلاسيكية التي يضاف فيها FBS إلى وسط الثقافة. وعلاوة على ذلك، هناك الآن ميل إلى الاستعاضة عن FBS بالبدائل9. أظهرت العديد من بدائل FBS نتائج واعدة10.

تم اختيار بديل البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) هنا ، وقمنا بتطوير جهاز طبي لإنتاج مستحضر موحد من PRP ، يسمى CuteCell-PRP. الاستخدام المقصود لهذا الجهاز هو إعداد PRP ذاتي المنشأ لاستخدامه كمكمل وسائط استزراع للتوسع في المختبر للخلايا الذاتية في ظل ظروف GMP.

يعرف PRP بأنه تعليق الصفائح الدموية المركز في البلازما. نظرا لوجود العديد من بروتوكولات التحضير ، والتي تختلف في 1) كمية الدم اللازمة ، 2) أنواع الأجهزة المستخدمة ، و 3) بروتوكول الطرد المركزي ، فإن تركيزات الصفائح الدموية الناتجة تختلف من أعلى قليلا إلى أكثر من 10 أضعاف قيمة خط الأساس للدم. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي مستحضرات PRP على مستويات متغيرة من تلوث خلايا الدم الحمراء والبيضاء. وهكذا يستخدم مصطلح "PRP" لوصف المنتجات التي تختلف اختلافا كبيرا في تكوينها البيولوجي وآثارها العلاجية المحتملة.

في معظم الدراسات ، يتم تحقيق استبدال FBS باستخدام تركيزات مختلفة من PRP التي يتم تنشيطها (بواسطة الثرومبين أو الكالسيوم). يثير هذا التنشيط الاصطناعي إطلاقا فوريا ومهما لعوامل نمو الصفائح الدموية من 15 دقيقة حتى 24 ساعة11. لذلك ، يعتقد أن تنشيط الصفائح الدموية غير مرغوب فيه للتطبيقات في مزارع الخلايا ، حيث يلزم الإطلاق البطيء لعوامل النمو من تحلل الصفائح الدموية التدريجي.

يتضمن علاج PRP تحضير الصفائح الدموية الذاتية في البلازما المركزة12. التركيز الأمثل للصفائح الدموية غير واضح ، وتتوفر مجموعة واسعة من الأجهزة التجارية لإعداد PRP13. ينتج هذا النقص في التوحيد القياسي عن عدم الاتساق بين الدراسات وأدى إلى صندوق أسود فيما يتعلق بجرعة الحقن وتوقيتها. يصف هذا البروتوكول إجراء للحصول على PRP ذاتي المنشأ باستخدام جهاز PRP المخصص هذا لتوسيع الخلايا الليفية الجلدية في نموذج ثقافة خارج الجسم الحي ذاتي المنشأ بنسبة 100٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

امتثل بروتوكول الدراسة لإعلان هلسنكي ، وقدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة. يتم الحصول على عينات الجلد من النساء الأصحاء اللائي يخضعن لعملية شد البطن في قسم الجراحة التجميلية والترميمية والتجميلية في مستشفيات جامعة جنيف (جنيف ، سويسرا). يتوافق الإجراء مع مبادئ إعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية المحلية (البروتوكول # 3126).

1. إعداد PRP

ملاحظة: تم تصميم أنابيب CuteCell-PRP (جدول المواد) للتحضير السريع ل PRP من حجم صغير من دم المريض في نظام دائرة مغلقة.

  1. جمع الدم الكامل
    ملاحظة: حصاد الدم الذاتي من الوريد المحيطي للذراع باستخدام إبرة فراشة متصلة مباشرة بأنبوب PRP ، وفقا لبروتوكول الجمع الخاص بالمعهد الطبي. يمكن سحب الدم مباشرة من خلال القنية الوريدية إذا كان المريض تحت التخدير.
    1. افتح حزمة نفطة الأنبوب. إجراء ثقب وريدي وملء العدد المطلوب من أنابيب PRP بالدم الكامل. سيمكن الفراغ داخل الأنابيب من الجمع التلقائي للحجم الضروري من الدم (~ 10 مل).
    2. اقلب الأنابيب بعناية رأسا على عقب عدة مرات لخلط الدم مع مضادات التخثر.
    3. داخل خزانة السلامة البيولوجية (الفئة 2) ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من إجمالي الدم الكامل باستخدام حقنة 1 مل لمزيد من تعداد عدد خلايا الدم.
  2. الطرد المركزي
    ملاحظة: تأكد من موازنة جهاز الطرد المركزي بشكل صحيح قبل بدء تشغيله.
    1. بمجرد جمع الدم في أنابيب PRP ، إذا لزم الأمر ، قم بإعداد أنبوب موازنة (يتم توفيره بشكل منفصل) بالماء إلى نفس مستوى الدم في أنبوب PRP. ضع الأنابيب المملوءة في جهاز الطرد المركزي مقابل بعضها البعض ، مما يضمن توازن الماكينة.
    2. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: اضبط سرعة عدد الدورات في الدقيقة المقابلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لأجهزة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، سوف يصبح الدم مجزأ. تحاصر خلايا الدم الحمراء والبيضاء تحت الجل ، وتستقر الصفائح الدموية على سطح الجل (الشكل 1).
  3. اقلب أنبوب PRP برفق 20x لإعادة تعليق رواسب الصفائح الدموية في طاف البلازما.
    ملاحظة: تأكد من فصل الصفائح الدموية تماما عن الجل. يجب أن تتغير البلازما من واضحة وشفافة إلى عكرة. في حالة وجود مجاميع الصفائح الدموية ، يجب جمعها مع البلازما.
  4. لجمع PRP ، خذ محلول البلازما من الأنبوب باستخدام جهاز نقل حقنة متصل بحقنة سعة 10 مل.
    ملاحظة: سيتم الحصول على حوالي 5 مل من PRP من كل أنبوب. حل PRP جاهز الآن للخلط في التحضير المتوسط النهائي. يمكن الاحتفاظ بالمحلول في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت خزانة الأمان حتى الخطوات المستقبلية التي تتضمن محلل أمراض الدم واستخدامه.
  5. قبل استخدام PRP ، حدد تركيز الصفائح الدموية ، ومتوسط حجم الصفائح الدموية ، وعدد خلايا الدم الحمراء والبيضاء باستخدام محلل أمراض الدم الآلي (جدول المواد). للقيام بذلك ، اسحب بعناية 100 ميكرولتر من المحلول وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يستخدم PRP كمكمل استزراع ذاتي بتركيز يتراوح بين 5-20٪ v / v. يجب تحديد التركيز الأمثل ل PRP لكل خط خلية. لمنع تكوين جلطة الفيبرين ، يجب استكمال وسائط المزرعة النهائية ب 2 وحدة / مل من الهيبارين.

2. عزل الخلايا الليفية الذاتية والثقافة في الوسائط المكملة ل FBS أو PRP

  1. اغسل عينات الجلد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق رجه برفق في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل.
  2. إذا كانت عينة الجلد كبيرة نسبيا (>10 سم 2) ، ضع العينة على غطاء طبق زراعة الأنسجة 150 سم2 (جانب البشرة لأسفل). إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد باستخدام زوج من ملقط ومقص. لمنع الأنسجة من الجفاف ، اشطف المنديل كل بضع دقائق في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: استخدم طبق زراعة الأنسجة الأصغر للعينات الأصغر.
  3. عند اكتمال تقليم الدهون ، قم بتقطيع الأنسجة إلى شرائح 0.5 سم × 1.5 سم تقريبا باستخدام مشرط معقم.
  4. أضف 5 مل من مزيج كولاجيناز ديسباز (جدول المواد؛ 14 وحدة Wünsch/mL) إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.
  5. انقل الأنسجة المقطوعة إلى الأنبوب ، مع التأكد من غمر قطع الأنسجة في المحلول. قم بتغطية الأنبوب بإحكام.
  6. ضع الأنابيب في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المداري لمدة 150 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة في خزانة السلامة الحيوية.
  7. ضع غطاء طبق استزراع معقم 100 مم رأسا على عقب في خزانة السلامة البيولوجية. انقل محلول الأنسجة المهضومة إلى قاع طبق الثقافة 100 مم ، دون رش. إذا بقيت أي قطع من الأنسجة في الأنبوب ، فاستخدم ماصة معقمة سعة 1 مل أو ملقط معقم لنقل قطع الأنسجة إلى قاع طبق الاستزراع 100 مم.
  8. مع توجيه شريط البشرة لأعلى ، افصل ورقة البشرة السليمة عن الأدمة باستخدام زوجين من الملقط. امسك أدمة شريط الأنسجة بزوج من الملقط وحافة البشرة بزوج آخر من الملقط. قشر الأدمة والبشرة إلى قطعتين ، مع الحفاظ على القطع المنفصلة على نفس الغطاء. حاول تنفيذ هذه الخطوة بسرعة وكرر التلاعب لكل قطعة من الأنسجة.
  9. انقل القطع الجلدية إلى طبق استزراع جديد مقاس 100 مم يحتوي على برنامج تلفزيوني.
  10. باستخدام ملقط المختبر ، ضع القطع الجلدية في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل مع 3 مل من 0.3٪ تربسين / برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10-20 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية وقلب الأنبوب عدة مرات كل 2-3 دقائق.
  11. لإيقاف التفاعل الأنزيمي ، أضف 3-5 مل من وسط النمو الكامل المثلج البارد (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] أو RPMI الذي يحتوي على 10٪ FBS). دوامة الأنبوب بقوة عدة مرات. قم بتصفية تعليق الخلايا الليفية من خلال شبكة نايلون 85 ميكرومتر (موضوعة فوق الجزء العلوي من أنبوب سعة 50 مل) لإزالة الحطام الجلدي.
  12. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 150 × جم ، عند 4 درجات مئوية. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100-1000 ميكرولتر من وسط النمو الكامل.
  13. باستخدام التريبان الأزرق (عامل التخفيف x2) الممزوج بتعليق الخلية ، احسب عدد الخلايا الكلية والقابلة للحياة عن طريق ملء غرفة مقياس الدم.
    ملاحظة: تعتمد صلاحية الخلية على الظروف المستخدمة للهضم الأنزيمي. لزيادة تعافي الخلايا وصلاحيتها ، يمكن تقطيع عينة الجلد إلى قطع أصغر.
  14. لوحة 3−10 × 104 خلايا في 5 مل من وسط نمو FBS الكامل (DMEM ، 10٪ FBS معطل حراريا لمدة 60 دقيقة عند 56 درجة مئوية ، 1٪ 1 M محلول HEPES العازلة ، 1٪ 100x خليط الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1٪ 100x L- الجلوتامين ، 1٪ 100x البنسلين / الستربتومايسين ، 1٪ 100x بيروفات الصوديوم) في دورق زراعة الأنسجة 25 سم2 . احتضان في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: سوف تلتصق الخلايا الليفية القابلة للحياة بالقارورة في غضون 24 ساعة وتبدأ في إظهار شكل المغزل في غضون 2-3 أيام.
  15. في اليوم 2 ، استنشق الوسط الذي يحتوي على خلايا غير ملتصقة وأضف وسطا جديدا.
    ملاحظة: نظرا لأن الخلايا الميتة في وسط المزرعة تؤثر على نمو الخلايا الليفية القابلة للحياة ، يجب إزالة الخلايا الميتة غير الملتصقة من الثقافة.
  16. قم بتغيير الوسيط كل 3-4 أيام حتى تصل الثقافة إلى التقاء 70-80٪.
  17. لحصاد الخلايا الليفية ، يغسل باستخدام برنامج تلفزيوني ويحتضن بمحلول التربسين / EDTA لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
  18. لإيقاف التفاعل ، أضف 3-5 مل من وسط النمو الكامل الدافئ (DMEM أو RPMI يحتوي على 10٪ FBS). خذ حصة من تعليق الخلية لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم. أجهزة الطرد المركزي التعليق لمدة 5 دقائق عند 200 × غرام وإزالة الوسط عن طريق الشفط.
  19. استزرع الخلايا الليفية في وسط PRP (DMEM ، 20٪ PRP ، 1٪ 1 M محلول عازل HEPES ، 1٪ 100x خليط الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1٪ 100x L- الجلوتامين ، 1٪ 100x البنسلين / الستربتومايسين ، 1٪ 100x بيروفات الصوديوم ، 2 U / mL الهيبارين) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الحد الأدنى لكثافة الخلايا الموصى بها هو 4000 خلية قابلة للحياة / سم2.
  20. لتقييم تأثيرات PRP على تكاثر الخلايا الليفية ، الخلايا الليفية البذور (الممر 2) في 24 لوحة بئر بكثافة 8 × 103 خلايا لكل بئر في وسط PRP بتركيزات مختلفة من PRP (1٪ ، 5٪ ، 10٪ ، 20٪ ، 30٪ ، 40٪ ، 50٪) ومع 2 وحدة / مل من الهيبارين أو تحت ظروف متوسطة الثقافة الكلاسيكية (10٪ FBS). بعد 7 أيام من المزرعة ، أضف صبغة حيوية (بنفسجي لتكاثر الخلايا) إلى الخلايا وقم بتقييم الانتشار عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  21. لدراسة إعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، خلايا البذور في 96 صفيحة سوداء / شفافة مسطحة القاع بتركيز 1 × 10 5 خلايا / مل في نمو FBS الكامل DMEM (انظر الخطوة 2.14) مكملة ب0.5 ٪ FBS لمدة 24 ساعة. عالج الخلايا بنسبة 10٪ FBS أو تركيزات PRP مختلفة (1٪ ، 5٪ ، 10٪ ، 20٪ ، 30٪ ، 40٪ ، 50٪) لمدة 7 أيام.
    1. ثبت الخلايا الليفية ب 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق وتخلل بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 5 دقائق في RT. قم بتلطيخ الخلايا الليفية ب 50 مل من 5 وحدة / مل من الفالويدين ، واغسل 2x باستخدام PBS ، وحدد 50 مل من 1 مجم / مل 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق. تم استخدام قارئ التصوير متعدد الأوضاع Cytation 3 (BioTek) لتصور تلطيخ القضيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذه التقنية الحاصلة على براءة اختراع هي جهاز طبي بسيط وسريع وقابل للتكرار يستخدم لإنتاج مستحضرات PRP موحدة. إنه نظام مغلق بالكامل من خطوة واحدة يسمح بإعداد PRP من الدم الكامل الوريدي بعد 5 دقائق من الطرد المركزي عند 1500 × جم (بسبب تقنية الهلام المنفصل). يتم مسح PRP الذي تم الحصول عليه بعد الطرد المركزي من خلايا الدم الحمراء والبيضاء ، والتي تجلس أسفل الجل. بعد عدة انعكاسات أنبوبية ، يتم إعادة تعليق الصفائح الدموية الموجودة أعلى الجل في البلازما ، ويكون PRP جاهزا للاستخدام (الشكل 1).

لتقييم استنساخ محتوى خلايا الدم في التحضير ، تم تحليل عينات الدم الكامل والبلازما الغنية بالصفائح الدموية من 10 مرضى مختلفين باستخدام محلل أمراض الدم. بعد معالجة الدم الكامل بالجهاز ، تمت إزالة غالبية خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وخلايا الدم البيضاء (WBCs). أظهر متوسط تركيز الصفائح الدموية زيادة بمقدار 1.5 ضعف مقارنة بالتركيز الفسيولوجي الموجود في الدم كله (الشكل 2).

في إعداد الثقافة الذاتية ، تمت زراعة الخلايا الليفية المعزولة للمريض في وجود تركيزات متزايدة من PRP (1-50٪) ، مقارنة بحالة وسط الثقافة الكلاسيكية (10٪ FBS). بعد 7 أيام من المزرعة دون تغيير الوسائط ، أظهرت الثقافات المجهزة ب 20٪ PRP عددا أكبر من الخلايا الليفية القابلة للحياة (الشكل 3أ ، ب ؛ 7.7x أعلى مقارنة بحالة التحكم). أثبت تلطيخ Phalloidin أن التغيير المورفولوجي الذي لوحظ عند تنشيط PRP كان مرتبطا بإعادة تنظيم F-actin ، وهو توقيع على تنشيط الخلايا الليفية (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: تحضير PRP ذاتي المنشأ لاستخدامه كمكمل إعلامي للتوسع في المختبر للخلايا الذاتية في ظل ظروف GMP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تعداد خلايا الدم والصفائح الدموية. يعرض PRP المحضر بالجهاز التجاري محتوى خلايا الدم القابل للتكرار بدرجة عالية على الرغم من الاختلافات بين المتبرعين. PLT: الصفائح الدموية (x 105) ؛ كرات الدم البيضاء: خلايا الدم البيضاء (x 103); كرات الدم الحمراء: خلايا الدم الحمراء (x 106) ، n = 10 مرضى. تم تعديل هذا الرقم من Berndt et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم التأثيرات التكاثرية PRP على ثقافة الخلايا الليفية الذاتية. (أ) صور مجهرية تمثيلية لبرايتفيلد توضح التأثيرات المعززة لوسط PRP بنسبة 20٪ المضافة إلى الخلايا الليفية المعزولة من نفس المريض بعد 7 أيام من الثقافة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) تقييم التأثير التكاثري PRP عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام صبغة حيوية. التأثيرات التكاثرية لزيادة تركيزات PRP مقارنة (1-50٪) مع 10٪ FBS (ن = 10 مرضى) على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية (NHDF) لمدة 7 أيام دون تغيير متوسط في نظام ذاتي كامل (الخلايا و PRP من نفس المريض ؛ * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001). تم تعديل هذا الرقم من Berndt et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصور الهيكل الخلوي من خلال تلطيخ F-actin. بعد 7 أيام نمت في 20٪ PRP (اللوحة اليمنى) ، يتم تنشيط الخلايا الليفية وإعادة تنظيم هيكلها الخلوي مقارنة بظروف ثقافة التحكم مع 10٪ FBS (اللوحة اليسرى). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Berndt et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشمل مزايا استخدام الخلايا الليفية الذاتية كبديل طبيعي مقارنة بمواد الحشو الأخرى في علاج خلايا الجرح التوافق الحيوي الجيد ، والحد الأدنى من الآثار الجانبية ، وسهولة الحصاد والاستخدام. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه العلاجات في بيئة سريرية يومية ، من الضروري إجراء دراسات قبل سريرية مناسبة لتحديد ميزات النمو وتقييم الوظيفة البيولوجية وسلامة الخلايا الليفية المعزولة قبل وبعد الزرع. وبالتالي ، مباشرة بعد عملية العزل ، يجب إجراء التوسع في الخلايا في المختبر بسرعة من أجل الحد من عدد انقسامات الخلايا. يجب التحكم بإحكام في ظروف الاستزراع لضمان سلامة وفعالية المنتج البيولوجي الذاتي النهائي.

في الدراسات قبل السريرية المنشورة ، تم اختيار الخلايا في الممرات 3-4 عادة ليتم حقنها ، لأنها الأكثر ملاءمة من حيث كمية الخلية والنشاط التكاثري / الإفرازي15. تم إجراء معظم الأبحاث قبل السريرية باستخدام وسائط الاستزراع التي يكون فيها FBS مصدرا للمغذيات وعوامل النمو16. ومع ذلك ، فإن مكمل النمو الجيني هذا يمثل خطرا محتملا للعدوى والتفاعلات المناعية. نظرا لحدوث اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري (BSE) في القطعان في جميع أنحاء العالم ، هناك قلق تنظيمي كبير بشأن استخدام FBS كمكمل لزراعة الخلايا بسبب خطر إدخال مادة xenogenic في مزارع العلاج الخلوي10.

عادة ، يتم تحقيق تكاثر الخلايا الجذعية الليفية أو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) باستخدام وسائط النمو المكملة FBS. في حين أن FBS كان مصدرا غذائيا كافيا لزراعة الخلايا ، إلا أنه يشكل عوائق إضافية إلى جانب خطر التلوث الحيواني الأنف. أولا، تقدم منتجات FBS تكلفة تصنيع ضخمة مقارنة بالمنتجات المشتقة من الدم البشري، ويرجع ذلك جزئيا إلى انخفاض معدلات الانتشار وفترة التوسع الثقافيالممتدة 9. ثانيا ، FBS هو مصدر للبروتينات الخارجية التي تتفاعل مع الخلايا المعزولة ، مما يزيد من خطر رد الفعل المناعي بسبب ظهور الأجسام المضادة ضد مجمعات البروتين السطحية على الخلايا المزروعة10.

لمعالجة العيوب المحتملة ل FBS كعنصر غذائي للتوسع السريري للخلايا ، تم تقديم المنتجات المشتقة من الدم البشري كبدائل. اقترحت بعض الدراسات استبدال FBS في وسائط الاستزراع بمصل بشري ذاتي لتوسيع الخلايا ، ولكن نظرا لأن تكاثر الخلايا بطيء ، فإنه لا يزال يتطلب وقتا طويلا للمزرعة (3 أسابيع) والعديد من مرور الخلايا قبل الزرع17,18.

استخدمت مجموعات أخرى تحلل الصفائح الدموية (PL) ، وهو طاف خال من الخلايا غني بعوامل النمو التي يتم إطلاقها من الصفائح الدموية بعد تعطيل ذوبان التجميد لمركزات الصفائح الدموية. الميزة الرئيسية ل PL مقارنة ب PRP هي إمكانات التخزين المجمدة. لذلك ، يمكن استخدام نفس الكمية لتطبيقات زراعة الخلايا المتتالية. علاوة على ذلك ، كمنتج جاهز ، يمكن توحيده من خلال تحليل محتوى عامل النمو والميزات البيولوجية الأخرى قبل الاستخدام. بعض العيوب هي أنه خيفي ، ويتم تجميع الدفعات من عدة مانحين. علاوة على ذلك ، نظرا لأن PL لا يحتوي على أي صفائح دموية حية ، والتي يمكن أن تنتج السيتوكينات وعوامل النمو لمدة تصل إلى 10 أيام ، يجب تغيير وسائط الاستزراع التي تحتوي على PL كل 3 أيام (بدلا من 7-10 أيام عندما يتم استكمال الثقافة ب PRP)19. من المؤكد أن توسيع الخلايا في المختبر في مصدرها الخاص لعوامل النمو والمواد المغذية التي يوفرها إعداد PRP هذا مفيد. التحضير خال من أي مكملات xenogenic في ثقافة الخلايا التي يمكن أن تسبب الرفض أو الحساسية أو انتقال الأمراض المعدية.

في الدراسات السابقة ، ثبت أنه يمكن استخدام PRP الذاتي كوسيلة استزراع آمنة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة لتكاثر الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون (ADSC)20. زادت الوسائط المزودة ب 20٪ من PRP الذاتي من تكاثر الخلايا حتى 13 ضعفا دون تغيير النمط الظاهري للخلية. في العيادات ، يعتبر PRP لديه قدرات تجديد وتجديد قوية.

حاليا ، يتم بالفعل استخدام PRP الذي تم الحصول عليه من دم المريض بكفاءة في الإعداد السريري لالتئام الجروح وحدها 21 أو بالاشتراك مع حمض الهيالورونيك 22,23 أو تجديد العظام 24,25 ؛ أو تجديد شباب الجلد وحده26 أو بالاشتراك مع خلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية المشتقة من الدهون27،28،29. دفع هذا إلى التحقيق في استخدام PRP الخاص بالمريض لتعزيز توسع الخلايا الليفية الذاتية.

لهذا الغرض ، ولضمان استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها من خلال إعداد PRP ، قمنا بتطوير جهاز PRP خاص. يسمح هذا النظام المغلق بتوحيد مستحضرات PRP ، وهو شرط أساسي لتقليل التقلبات من متبرع المريض (فيما يتعلق بتركيز الصفائح الدموية والاختلافات المعتمدة على المشغل). أظهر تعداد خلايا الدم الذي تم الحصول عليه من 10 مرضى أن البروتوكول قابل للتكرار بدرجة كبيرة (الشكل 2). علاوة على ذلك ، تبين أن PRP كان له تأثيرات قوية كمعزز للانتشار ، تصل إلى 7.7 أضعاف مقارنة ب FBS (الشكل 3 ب). هذا مهم من أجل تقليل التكاليف والوقت اللازم لعملية التوسع. في دراسة حديثة ، قمنا بتحليل كيفية تأثير PRP على تكاثر الخلايا الليفية وتمايزها. أظهر 20٪ PRP أفضل فعالية دون التأثير على النمط الظاهري للخلية أو النمط الجيني14.

أحد قيود الطريقة هو أنه يجب تحضير الوسط الذي يحتوي على PRP بالهيبارين لمنع تكوين الجلطة. على الرغم من استخدام مضادات التخثر القياسية في البلازما (مضاد تخثر سترات الصوديوم ومخلب الكالسيوم) في هذا الجهاز ، يمكن أن يحدث تكوين جلطات الفيبرين عند إضافة البلازما إلى وسائط الاستزراع التي تحتوي على الكالسيوم30. الهيبارين بالإضافة إلى إعداد PRP يمنع تكوين جلطة الفيبرين. ومع ذلك ، يمكن أن يربط الهيبارين عوامل النمو وقد يتداخل مع نمو الخلايا30. على سبيل المثال ، تبين أن الهيبارين يؤثر سلبا على تكاثر الخلايا الليفية الجلدية31. ومع ذلك ، كانت التركيزات المستخدمة أكثر تركيزا بمقدار 4 مرات مقارنة بالتركيز المستخدم في هذه الدراسة (2 وحدة / مل).

علاوة على ذلك ، يتم تنقية الهيبارين التجاري بشكل أساسي من مصادر الخنازير. لذلك ، بسبب أصله الحيواني ، فإنه يمثل قيدا في تطوير وسط خال تماما من xeno. على الرغم من الموافقة على هيبارين الخنازير للعلاج البشري ، فقد تم الإبلاغ عن فرط الحساسية للجزيء32. قيد آخر هو أنه يجب استخدام PRP كمكمل بيولوجي طازج ولا يمكن تجميده. فيما يتعلق بعمر النصف للصفائح الدموية ، فقد تبين سابقا أنه بعد 10 أيام ، لا يزال نصف الصفائح الدموية الموجودة في PRP قابلة للحياة33. لهذا السبب ، يتم الاحتفاظ PRP في درجة حرارة الغرفة ويستخدم لمدة 10 أيام. علاوة على ذلك ، بالنسبة للعلاجات الخلوية المستقبلية التي تتطلب إنتاج أعداد هائلة من الخلايا ، فإن القيد الرئيسي هو إجمالي كمية الدم التي يمكن سحبها من المريض.

باختصار ، يوضح هذا البروتوكول أن استبدال FBS ب PRP يؤدي إلى توسع سريع في الخلايا الليفية. تطلق الصفائح الدموية الموجودة في PRP ببطء مزيجا منسقا من عوامل النمو خلال مرحلة الاستزراع من التوسع. يتم استخدام الجهاز المقدم أثناء إجراء موحد يقلل من التعقيد والوقت العملي أثناء إعداد PRP. وبالتالي يعتبر هذا النظام طريقة مناسبة عندما تكون هناك حاجة إلى توسع سريع وآمن خارج الجسم الحي لتطبيقات العلاج بالخلايا الذاتية في ظروف GMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تم تمويل هذا المشروع من قبل Regen Lab SA. سارة بيرندت هي مديرة مشروع العلاج الخلوي في Regen Lab وتعمل في Regen Lab SA. أنطوان تورزي هو الرئيس التنفيذي لشركة RegenLab.

Acknowledgments

نشكر السيد غريغوري شنايتر على المساعدة التقنية في بيانات قياس التدفق الخلوي. البروفيسور موريل كوينديت (مختبر العقاقير ، كلية العلوم الصيدلانية ، وجامعة جنيف) للسماح باستخدام مقياس التدفق الخلوي Attune والمجهر عالي الإنتاجية Cytation 3 ؛ البروفيسورة بريجيت بيتيت للنصائح العلمية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

التراجع ، العدد 168 ، البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، PRP ، الخلايا الليفية ، تكاثر الخلايا ، هجرة الخلايا ، التئام الجروح ، زراعة الخلايا ، العلاج بالخلايا
إنتاج البلازما الذاتية الغنية بالصفائح الدموية لتعزيز توسع الخلايا الليفية البشرية في المختبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter