Summary
פרוטוקול זה מציג מכשיר המייצר PRP כדי להגביר את ההתרחבות במבחנה של תאים במערכת תרבית פיברובלסטים אוטולוגית 100%.
Abstract
כיום יש עניין קליני רב בשימוש בפיברובלסטים אוטולוגיים לתיקון העור. ברוב המקרים נדרשת תרבית תאי עור במבחנה. עם זאת, לתרבית תאים באמצעות מדיה של תרבית קסנוגנית או אלוגנית יש כמה חסרונות (כלומר, סיכון להעברת חומרים זיהומיים או התפשטות תאים איטית). כאן, מערכת תרבית אוטולוגית מפותחת להרחבת תאי פיברובלסטים בעור אנושי במבחנה באמצעות פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) של המטופל עצמו. פיברובלסטים עוריים אנושיים מבודדים מהמטופל בזמן שהם עוברים ניתוח בטן. התרביות נמצאות במעקב עד 7 ימים באמצעות מדיום בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) או PRP. תכולת תאי הדם בתכשירי PRP, שגשוג והתמיינות פיברובלסטים מוערכים. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לקבלת תכשיר סטנדרטי ולא מופעל של PRP באמצעות מכשיר רפואי ייעודי. התכשיר דורש רק מכשיר רפואי (CuteCell-PRP) וצנטריפוגה. מכשיר זה מתאים בתנאי פרקטיקה רפואיים מספיקים והוא מערכת סגורה חד-שלבית, אפירוגנית וסטרילית הדורשת צנטריפוגת ספין אחת רכה של 1,500 x גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, מרכיבי הדם מופרדים, ואת פלזמה עשירה טסיות נאסף בקלות. מכשיר זה מאפשר הכנה מהירה, עקבית ומתוקננת של PRP שיכול לשמש כתוסף תרבית תאים להרחבת תאים במבחנה של תאים אנושיים. ה- PRP המתקבל כאן מכיל ריכוז טסיות פי 1.5 בהשוואה לדם שלם יחד, עם הסרה מועדפת של תאי דם אדומים ולבנים. נראה כי PRP מציג השפעה מגבירה בהתפשטות תאים בהשוואה ל- FBS (פי 7.7) וכי פיברובלסטים מופעלים בטיפול PRP.
Introduction
רפואה רגנרטיבית שואפת לרפא או להחליף רקמות ואיברים שניזוקו על ידי גיל, מחלה או טראומה, כמו גם לתקן פגמים מולדים. בטיפול אוטולוגי, תאים או רקמות נסוגים מהמטופל, מורחבים או משתנים, ואז מוצגים מחדש לתורם. לצורה זו של טיפולים יש פוטנציאל רחב בתחום הדרמטולוגיה1. בטיפול אוטולוגי בפיברובלסטים, הפיברובלסטים של המטופל מתורבתים ומוזרקים מחדש לטיפול בקמטים, קמטוטים או צלקות אקנה. מכיוון שפיברובלסטים הם התאים הפונקציונליים העיקריים בדרמיס, הזרקה של פיברובלסטים אוטולוגיים עשויה להיות מועילה יותר מטיפולים אחרים בהצערת הפנים2.
בעור, פיברובלסטים אחראים לסינתזה ולהפרשה של חלבונים חוץ-תאיים (כלומר קולגן, אלסטין, חומצה היאלורונית וגליקוזאמינוגליקנים). הם גם משחררים גורמי גדילה המווסתים את תפקוד התא, נדידה ואינטראקציות בין מטריצת תאים/תאים בהומאוסטזיס עור רגיל ובריפוי פצעים3. פיברובלסטים עוריים כבר הוצגו כטיפול תאי קליני פוטנציאלי לריפוי פצעי עור4, התחדשות רקמות5, או מילוי עורי בהליכים אסתטיים ופלסטיים6. מחקרים מסוימים אף מצביעים על כך שבהקשר של רפואה רגנרטיבית, פיברובלסטים עשויים להיות טיפול תאי מעשי ויעיל יותר מאשר תאי גזע מזנכימליים7.
כדי להשיג מספר מספיק של פיברובלסטים ליישומים קליניים, הרחבת תאים היא בדרך כלל חובה. תרבית תאי Ex vivo/in vitro דורשת תווך בסיסי בתוספת גורמי גדילה, חלבונים ואנזימים לתמיכה בהידבקות ובשגשוג תאים. סרום בקר עוברי (FBS) הוא תוסף נפוץ לתרבית תאים, מכיוון שדם העובר 1) עשיר בגורמי גדילה בהשוואה לדם בוגר 2) מציג תכולת נוגדנים נמוכה8. ככל שהטיפול התאי מתקדם, ישנם חששות לגבי הבטיחות של תנאי תרבית תאים קלאסיים שבהם FBS מתווסף למדיום התרבית. יתר על כן, יש כיום נטייה להחליף את FBS בחלופות9. מספר תחליפים של FBS הראו תוצאות מבטיחות10.
חלופת הפלזמה העשירה בטסיות דם (PRP) נבחרה כאן, ופיתחנו מכשיר רפואי לייצור תכשיר סטנדרטי של PRP, בשם CuteCell-PRP. השימוש המיועד במכשיר זה הוא הכנת PRP אוטולוגי שישמש כתוסף מדיה לתרבית להרחבת תאים אוטולוגיים בתנאי GMP.
PRP מוגדר כתרחיף טסיות מרוכז בפלזמה. מכיוון שישנם פרוטוקולי הכנה רבים, הנבדלים זה מזה ב-1) כמות הדם הדרושה, 2) סוגי המכשירים שבהם נעשה שימוש, ו-3) פרוטוקול צנטריפוגה, ריכוזי טסיות הדם המתקבלים משתנים מעט מעל ליותר מפי 10 מערך הבסיס של הדם. בנוסף, תכשירי PRP מכילים רמות משתנות של זיהום תאי דם אדומים ולבנים. המינוח "PRP" משמש אפוא לתיאור מוצרים השונים מאוד בהרכבם הביולוגי ובהשפעות הטיפוליות האפשריות שלהם.
ברוב המחקרים, החלפת FBS מושגת באמצעות ריכוזים שונים של PRP המופעל (על ידי טרומבין או סידן). הפעלה מלאכותית זו מעוררת שחרור מיידי וחשוב של גורמי גדילה טסיות מ 15 דקות עד 24 שעות11. לכן, הוא האמין כי הפעלת טסיות אינו רצוי עבור יישומים בתרביות תאים, שבו שחרור איטי של גורמי גדילה מ degranulation טסיות הדרגתי נדרש.
טיפול PRP כרוך בהכנת טסיות דם אוטולוגיות בפלזמה מרוכזת12. ריכוז הטסיות האופטימלי אינו ברור, ומגוון רחב של מכשירים מסחריים זמינים להכנת PRP13. חוסר סטנדרטיזציה זה נובע מחוסר עקביות בין מחקרים והוביל לקופסה שחורה לגבי מינון ועיתוי ההזרקה. פרוטוקול זה מתאר הליך להשגת PRP אוטולוגי באמצעות מכשיר PRP ייעודי זה להרחבת פיברובלסטים בעור במודל תרבית אקס ויו אוטולוגי 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המחקר תואם את הצהרת הלסינקי, וכל החולים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני שהשתתפו במחקר. דגימות עור מתקבלות מנשים בריאות העוברות ניתוח בטן במחלקה לכירורגיה פלסטית, משחזרת ואסתטית בבתי החולים האוניברסיטאיים בז'נבה (ז'נבה, שוויץ). הנוהל תואם את עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית המקומית (פרוטוקול #3126).
1. הכנת PRP
הערה: צינורות CuteCell-PRP (טבלת חומרים) מיועדים להכנה מהירה של PRP מנפח קטן של דם המטופל במערכת מעגל סגור.
- איסוף דם שלם
הערה: קצירת דם אוטולוגי מווריד היקפי של הזרוע באמצעות מחט פרפר המחוברת ישירות לצינור PRP, על פי פרוטוקול האיסוף של המכון הרפואי. דם יכול להיות נסוג ישירות דרך צינורית ורידי אם החולה נמצא תחת הרדמה.- פתח את חבילת שלפוחית הצינור. בצע את ניקוב ורידי ולמלא את המספר הרצוי של צינורות PRP עם דם שלם. הוואקום בתוך הצינורות יאפשר איסוף אוטומטי של נפח הדם הדרוש (~ 10 מ"ל).
- בזהירות להפוך את צינורות הפוך כמה פעמים כדי לערבב את הדם עם נוגדי קרישה.
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית (Class 2), הסר 100 μL של דם מלא הכולל באמצעות מזרק 1 מ"ל לספירה נוספת של מספר תאי הדם.
- צנטריפוגה
הערה: ודא שהצנטריפוגה מאוזנת כראוי לפני הפעלתה.- לאחר איסוף הדם בצינורות PRP, במידת הצורך, להכין צינור איזון (מסופק בנפרד) עם מים באותה רמה כמו הדם בצינור PRP. הניחו את הצינורות המלאים בצנטריפוגה זה מול זה, וודאו שהמכונה מאוזנת.
- דגימות צנטריפוגות בגודל 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
הערה: הגדר את מהירות הסל"ד המתאימה בהתאם להוראות יצרן הצנטריפוגות. לאחר הצנטריפוגה, הדם יהפוך מקוטע. תאי הדם האדומים והלבנים לכודים מתחת לג'ל, וטסיות הדם מתיישבות על פני השטח של הג'ל (איור 1).
- הפוך בעדינות את צינור PRP 20x כדי להשעות מחדש את שקע טסיות הדם בפלזמה supernatant.
הערה: ודא שהטסיות מנותקות לחלוטין מהג'ל. הפלזמה צריכה להשתנות משקופה ושקופה לעכורה. אם קיימים אגרגטים טסיות, יש לאסוף אותם עם הפלזמה. - כדי לאסוף PRP, קח את פתרון הפלזמה מהצינור באמצעות מכשיר העברת מזרק המחובר מזרק 10 מ"ל.
הערה: כ-5 מ"ל של PRP יתקבלו מכל צינור. פתרון ה- PRP מוכן כעת לערבב את ההכנה הסופית במדיום. ניתן לשמור את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT) מתחת לארון הבטיחות עד לשלבים עתידיים הכוללים מנתח המטולוגי ושימוש. - לפני השימוש ב- PRP, קבע את ריכוז טסיות הדם, נפח טסיות ממוצע ומספר תאי דם אדומים ולבנים באמצעות מנתח המטולוגי אוטומטי (טבלה של חומר). כדי לעשות זאת, בזהירות למשוך 100 μL של הפתרון ולהעביר לתוך צינור 1.5 מ"ל.
הערה: PRP משמש כתוסף תרבית אוטולוגית בריכוז שבין 5-20% v/v. יש לקבוע את הריכוז האופטימלי של PRP עבור כל קו תא. כדי למנוע היווצרות קריש פיברין, יש להוסיף לתרבית הסופית 2 U/mL הפרין.
2. בידוד של פיברובלסטים אוטולוגיים ותרבית במדיה עם תוספת FBS או PRP
- יש לשטוף דגימות עור במי מלח חוצצי פוספט (PBS) על ידי ניעור עדין בצינור פוליפרופילן בנפח 50 מ"ל.
- אם דגימת העור גדולה יחסית (>10 ס"מ2), הניחו את הדגימה על מכסה צלחת תרבית רקמהבגודל 150 ס"מ (צד אפידרמיס כלפי מטה). הסר את רקמת השומן התת עורית באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כדי למנוע מהרקמה להתייבש, שטפו את הרקמה כל כמה דקות ב-PBS.
הערה: השתמש בתרבית רקמה קטנה יותר עבור דגימות קטנות יותר. - כאשר חיתוך השומן הושלם, חתכו את הרקמה לרצועות בגודל של כ-0.5X1.5 ס"מ באמצעות אזמל סטרילי.
- יש להוסיף 5 מ"ל תערובת קולגן-דיספאז (טבלת חומרים; 14 יחידות Wünsch/מ"ל) לצינור סטרילי בנפח 15 מ"ל.
- העבר את הרקמה החתוכה לצינור, וודא כי חתיכות הרקמה שקועות בתמיסה. יש לסגור את הצינור היטב.
- מניחים את הצינורות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות במשך 150 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור המכיל את הרקמה בארון הבטיחות הביולוגית.
- הניחו את המכסה של צלחת תרבית סטרילית בקוטר 100 מ"מ הפוכה בארון הבטיחות הביולוגית. מעבירים את תמיסת הרקמה המעוכלת לתחתית צלחת התרבית בקוטר 100 מ"מ, מבלי להתיז. אם נותרו חתיכות רקמה כלשהן בצינור, השתמש בפיפט סטרילי של 1 מ"ל או במלקחיים סטריליים כדי להעביר את חתיכות הרקמה לתחתית צלחת התרבית של 100 מ"מ.
- כאשר רצועת האפידרמיס פונה כלפי מעלה, יש להפריד את יריעת האפידרמיס השלמה מהדרמיס באמצעות שני זוגות מלקחיים. החזיקו את הדרמיס של רצועת הרקמה עם זוג מלקחיים ואת קצה האפידרמיס עם זוג מלקחיים נוסף. מקלפים את הדרמיס והאפידרמיס לשני חלקים, ושומרים את החתיכות המופרדות על אותו מכסה. נסה לבצע שלב זה במהירות ולחזור על המניפולציה עבור כל פיסת רקמה.
- מעבירים את חתיכות העור לצלחת תרבית חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה PBS.
- באמצעות מלקחיים מעבדתיים, מניחים את חתיכות העור בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל עם 3 מ"ל של 0.3% טריפסין/PBS. יש לדגור במשך 10-20 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולהפוך את הצינור מספר פעמים כל 2-3 דקות.
- כדי לעצור את התגובה האנזימטית, יש להוסיף 3-5 מ"ל של מדיום גידול שלם קר כקרח (מדיום הנשר השונה של דולבקו [DMEM] או RPMI המכיל 10% FBS). מערבלים את הצינור במרץ מספר פעמים. סנן את מתלה הפיברובלסט דרך רשת ניילון 85 מיקרומטר (ממוקם מעל החלק העליון של צינור 50 מ"ל) כדי להסיר פסולת עורית.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 150 x גרם, ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-100-1,000 מיקרוליטר של מצע צמיחה שלם.
- באמצעות טריפאן כחול (גורם דילול של x2) מעורבב עם השעיית התא, לספור את מספר התאים הכולל קיימא על ידי מילוי החדר של המוציטומטר.
הערה: כדאיות התא תלויה בתנאים המשמשים לעיכול אנזימטי. כדי להגביר את התאוששות התאים ואת כדאיות התא, דגימת העור עשויה להיחתך לחתיכות קטנות יותר. - צלחת 3-10 x 104 תאים ב-5 מ"ל של מצע גידול FBS מלא (DMEM, 10% FBS מנוטרל בחום למשך 60 דקות ב-56°C, 1% 1 M תמיסת חיץ HEPES, 1% 100x תערובת חומצות אמינו לא חיוניות, 1% 100x L-גלוטמין, 1% 100x פניצילין/סטרפטומיצין, 1% 100x נתרן פירובט) בצלוחית תרביתרקמה בגודל 25 ס"מ. לדגור ב 37 °C (77 °F).
הערה: פיברובלסטים קיימא יתחברו לבקבוק תוך 24 שעות ויתחילו להציג את צורת הציר תוך 2-3 ימים. - ביום השני, שואפים את המדיום המכיל תאים שאינם דבקים ומוסיפים מדיום טרי.
הערה: מכיוון שתאים מתים במדיום התרבית משפיעים על הצמיחה של פיברובלסטים בני קיימא, יש להסיר תאים מתים שאינם דבקים בתרבית. - שנה את המדיום כל 3-4 ימים עד שהתרבות מגיעה למפגש של 70-80%.
- כדי לקצור פיברובלסטים, יש לשטוף עם PBS ולדגור עם תמיסת טריפסין/EDTA למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.
- כדי לעצור את התגובה, הוסף 3-5 מ"ל של מדיום צמיחה מלא חם (DMEM או RPMI המכיל 10% FBS). קח aliquot של השעיית התא כדי לספור את התאים עם המוציטומטר. צנטריפוגה את המתלה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ולהסיר את המדיום על ידי שאיפה.
- תרבית את הפיברובלסט בתווך PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M תמיסת חיץ HEPES, 1% 100x תערובת חומצות אמינו לא חיוניות, 1% 100x L-גלוטמין, 1% 100x פניצילין/סטרפטומיצין, 1% 100x נתרן פירובט, 2 U/mL הפרין) באינקובטור ב 37 ° C.
הערה: צפיפות התאים המינימלית המומלצת היא 4,000 תאים בני קיימא/ס"מ2. - כדי להעריך את השפעות PRP על התפשטות פיברובלסטים, פיברובלסטים זרעים (מעבר 2) ב -24 צלחות באר בצפיפות של 8 x 103 תאים לכל באר בתווך PRP עם ריכוזי PRP שונים (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ו -50%) ועם 2 U/mL הפרין או בתנאים בינוניים של תרבות קלאסית (10% FBS). לאחר 7 ימים של תרבית, להוסיף צבע חיוני (התפשטות תאים סגול) לתאים ולהעריך את ההתרבות על ידי ציטומטריית זרימה.
- כדי לחקור סידורים מחדש של שלד ציטו-שלד, תאי זרע ב-96 לוחות תחתונים שטוחים שחורים/שקופים היטב בריכוז של 1 x 10 5 תאים/מ"ל ב-DMEM מלא של צמיחת FBS (ראה שלב 2.14) בתוספת FBS של0.5 % למשך 24 שעות. יש לטפל בתאים עם 10% FBS או ריכוזי PRP שונים (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ו-50%) במשך 7 ימים.
- תקן את הפיברובלסטים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות וחדיר עם 0.1% Triton X-100 למשך 5 דקות ב- RT. הכתימו את הפיברובלסטים עם 50 מ"ל של 5 U/mL phalloidin, שטפו 2x עם PBS, וסמנו עם 50 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 5 דקות. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) שימש כדי להמחיש צביעת phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכנולוגיה זו, המוגנת בפטנט, היא מכשיר רפואי פשוט, מהיר וניתן לשכפול המשמש לייצור תכשירי PRP סטנדרטיים. זוהי מערכת חד שלבית, סגורה לחלוטין המאפשרת הכנת PRP מדם שלם ורידי לאחר 5 דקות של צנטריפוגה ב 1,500 x גרם (בשל טכנולוגיית ג'ל ההפרדה). ה- PRP המתקבל לאחר ניקוי הצנטריפוגה מתאי דם אדומים ולבנים, היושבים מתחת לג'ל. לאחר כמה היפוכי צינור, טסיות הדם שנמצאות מעל הג'ל מושעות מחדש בפלזמה, וה-PRP מוכן לשימוש (איור 1).
כדי להעריך את יכולת השחזור של תכולת תאי הדם בהכנה, דגימות דם שלמות ו- PRP נותחו מ -10 חולים שונים עם מנתח המטולוגי. לאחר עיבוד של כל הדם עם המכשיר, רוב תאי הדם האדומים (RBCs) ותאי הדם הלבנים (WBCs) הוסרו. ריכוז הטסיות הממוצע הראה עלייה של פי 1.5 בהשוואה לריכוז הפיזיולוגי שנמצא בכל הדם (איור 2).
במערך התרבית האוטולוגית, הפיברובלסטים המבודדים של המטופל טופחו בנוכחות עלייה בריכוזי PRP (1-50%), בהשוואה למצב הבינוני בתרבית הקלאסית (10% FBS). לאחר 7 ימים של תרבית מבלי לשנות את המדיה, התרביות עם PRP של 20% הציגו מספר גבוה יותר של פיברובלסטים בני קיימא (איור 3A,B; גבוה פי 7.7 בהשוואה למצב הביקורת). צביעת פלואדין הראתה כי השינוי המורפולוגי שנצפה בהפעלת PRP היה קשור לארגון מחדש של F-actin, שהוא חתימה של הפעלת פיברובלסטים (איור 4).
איור 1: הכנת PRP אוטולוגי שישמש כתוסף מדיה לתרבית להרחבה חוץ גופית של תאים אוטולוגיים בתנאי GMP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספירת תאי דם וטסיות דם. PRP שהוכן עם המכשיר המסחרי מציג תכולת תאי דם הניתנת לשחזור גבוהה למרות שינויים בין תורמים. PLT: טסיות (x 105); WBCs: תאי דם לבנים (x 103); RBCs: תאי דם אדומים (x 106), n = 10 חולים. נתון זה שונה מ- Berndt et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת ההשפעות השגשוגיות של PRP על תרבית פיברובלסטים אוטולוגית. (A) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של שדה בהיר המדגימות את ההשפעות המגבירות של 20% מדיום PRP שנוסף לפיברובלסטים שבודדו מאותו מטופל לאחר 7 ימי תרבית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) הערכת ההשפעה השגשוגית של PRP על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צבע חיוני. השפעות שגשוג של הגדלת ריכוזי PRP בהשוואה (1-50%) עם 10% FBS (n = 10 חולים) על פיברובלסט עורי אנושי רגיל (NHDF) במשך 7 ימים ללא שינוי בינוני במערכת אוטולוגית מלאה (תאים ו- PRP מאותו חולה; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). נתון זה שונה מ- Berndt et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה של שלד ציטוסקלטון באמצעות צביעת F-אקטין (F-actin). לאחר 7 ימים שגדלו ב-20% PRP (פאנל ימני), הפיברובלסטים מופעלים ומארגנים מחדש את השלד הציטו-שלד שלהם בהשוואה לתנאי תרבית הבקרה עם 10% FBS (פאנל שמאלי). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Berndt et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרונות של שימוש בפיברובלסטים אוטולוגיים כחלופה טבעית בהשוואה לחומרי מילוי אחרים בטיפול בתאי פצע כוללים תאימות ביולוגית טובה, תופעות לוואי מינימליות וקלות הקציר והשימוש. עם זאת, לפני השימוש בטיפולים אלה במסגרת קלינית יומיומית, יש צורך במחקרים פרה-קליניים נאותים כדי לזהות את תכונות הגידול ולהעריך את התפקוד הביולוגי והבטיחות של פיברובלסטים מבודדים לפני ואחרי ההשתלה. לכן, מיד לאחר תהליך הבידוד, הרחבה חוץ גופית של התאים חייבת להתבצע במהירות על מנת להגביל את מספר חלוקות התא. תנאי התרבית חייבים להיות מבוקרים היטב כדי להבטיח את הבטיחות והיעילות של המוצר הביולוגי האוטולוגי הסופי.
במחקרים פרה-קליניים שפורסמו, תאים במעברים 3-4 נבחרו בדרך כלל להזרקה, מכיוון שהם המתאימים ביותר מבחינת כמות התאים ופעילות שגשוג/הפרשה15. רוב המחקרים הפרה-קליניים בוצעו עם מדיה תרבותית שבה FBS הוא המקור של חומרים מזינים וגורמי גדילה16. עם זאת, תוסף גדילה קסנוגני זה מציג סיכון אפשרי לזיהום ותגובות אימונולוגיות. בשל התרחשותה של אנצפלופתיה ספוגית בקר (BSE) בעדרים ברחבי העולם, קיים חשש רגולטורי ניכר לגבי השימוש ב- FBS כתוסף לתרבית תאים בגלל הסיכון של החדרת חומר קסנוגני לתרביות תרפיה תאית10.
בדרך כלל, התפשטות של תאי גזע פיברובלסטים או מזנכימליים (MSC) מושגת באמצעות מצע גדילה בתוספת FBS. בעוד FBS כבר אספקה תזונתית נאותה עבור תרבית תאים, זה מהווה מכשולים נוספים מלבד הסיכון של זיהום zoonose. ראשית, מוצרי FBS מציגים עלות ייצור עצומה בהשוואה למוצרים שמקורם בדם אנושי, בין היתר בשל שיעורי התפשטות מופחתים ותקופת הרחבת תרבית ממושכת9. שנית, FBS הוא מקור לקסנופרוטאינים המקיימים אינטראקציה עם התאים המבודדים, ובכך מגדילים את הסיכון לתגובה חיסונית בגלל הופעת נוגדנים כנגד קומפלקסים חלבוניים על פני השטח על תאים מושתלים10.
כדי להתמודד עם החסרונות הפוטנציאליים של FBS כחומר מזין להרחבה קלינית של תאים, מוצרים שמקורם בדם אנושי הוצגו כחלופות. כמה מחקרים הציעו להחליף FBS במדיה תרבית עם סרום אנושי אוטולוגי עבור הרחבת תאים, אבל מאז התפשטות התאים היא איטית, זה עדיין דורש זמן תרבית ארוך (3 שבועות) וכמה תאים עובר לפני ההשתלה17,18.
קבוצות אחרות השתמשו בליזט טסיות (PL), סופרנאטנט נטול תאים עשיר בגורמי גדילה המשתחררים מטסיות הדם לאחר הפרעה בהפשרת הקפאה של תרכיזי הטסיות. היתרון העיקרי של PL בהשוואה ל- PRP הוא פוטנציאל האחסון הקפוא שלו. לכן, אותה כמות יכולה לשמש ליישומי תרבית תאים עוקבים. יתר על כן, כמוצר מדף, ניתן לתקנן אותו על ידי ניתוח תכולת גורם הגדילה ותכונות ביולוגיות אחרות לפני השימוש. כמה חסרונות הם שזה allogenic, אצוות הם איגום ממספר תורמים. יתר על כן, מאחר ש-PL אינו מכיל טסיות דם חיות, אשר יכולות לייצר ציטוקינים וגורמי גדילה למשך עד 10 ימים, יש לשנות את מדיית התרבית המכילה PL כל 3 ימים (במקום 7-10 ימים כאשר מוסיפים תרבית עם PRP)19. הרחבת התאים במבחנה במקור שלהם של גורמי גדילה וחומרים מזינים המסופקים על ידי הכנת PRP זו היא בהחלט יתרון. התכשיר אינו מכיל תוספים קסנוגניים בתרבית התאים שעלולים לגרום לדחייה, אלרגיה או העברת מחלות זיהומיות.
במחקרים קודמים הוכח כי PRP אוטולוגי יכול לשמש כמדיום תרבית בטוח, יעיל וחסכוני לשגשוג תאי גזע מזנכימליים (ADSC) שמקורם בשומן20. מדיה שסופקה עם PRP אוטולוגי של 20% הגבירה את התפשטות התאים עד פי 13 מבלי לשנות את פנוטיפ התא. במרפאות, PRP נחשב בעל יכולות התחדשות והתחדשות חזקות.
כיום, PRP המתקבל מדם המטופל כבר משמש ביעילות במסגרת הקלינית לריפוי פצעים בלבד 21 או בשילוב עם חומצה היאלורונית 22,23 או התחדשות עצם 24,25; או הצערת העור בלבד26 או בשילוב עם תאי שבר כלי דם סטרומה שמקורם בשומן27,28,29. זה הניע את החקירה של שימוש PRP של המטופל עצמו כדי לקדם הרחבה של פיברובלסטים אוטולוגיים.
למטרה זו, וכדי להבטיח שחזור של התוצאות שהושגו עם הכנת PRP, פיתחנו מכשיר PRP מיוחד. מערכת סגורה זו מאפשרת סטנדרטיזציה של תכשירי PRP, המהווים תנאי מוקדם למזעור תנודות מהתורם של המטופל (לגבי ריכוז טסיות הדם ושינויים תלויי מפעיל). ספירות תאי הדם שהתקבלו מ-10 מטופלים הראו שהפרוטוקול ניתן לשחזור גבוה (איור 2). יתר על כן, הוכח של-PRP היו השפעות חזקות כמאיץ התפשטות, עד פי 7.7 בהשוואה ל-FBS (איור 3B). זה חשוב על מנת להפחית את העלויות ואת הזמן הנדרש לתהליך ההרחבה. במחקר שנערך לאחרונה, ניתחנו עוד יותר כיצד PRP משפיע על התפשטות והתמיינות פיברובלסטים. PRP של 20% הציג את היעילות הטובה ביותר מבלי להשפיע על פנוטיפ התא או גנוטיפ14.
מגבלה של השיטה היא כי המדיום המכיל PRP חייב להיות מוכן עם הפרין כדי למנוע היווצרות קריש. למרות שבמכשיר זה נעשה שימוש בנוגד קרישה סטנדרטי בפלזמה (נוגד קרישה נתרן ציטראט וכלטור סידן), היווצרות קרישי פיברין יכולה להתרחש כאשר מוסיפים פלזמה לתרבית המכילה סידן30. הפרין בנוסף להכנת PRP מונע היווצרות קריש פיברין זה. עם זאת, הפרינים יכולים לקשור גורמי גדילה ועלולים להפריע לצמיחת תאים30. לדוגמה, הפרין הוכח להשפיע לרעה על התפשטות פיברובלסטים עוריים31. עם זאת, הריכוזים ששימשו היו מרוכזים פי 4 בהשוואה לריכוז ששימש במחקר זה (2 U/mL).
יתר על כן, הפרין מסחרי מטוהר בעיקר ממקורות חזיריים; לכן, בגלל מוצאו מן החי, הוא מייצג מגבלה בהתפתחות של מדיום נטול קסנו לחלוטין. למרות שהפרין חזירי אושר לטיפול בבני אדם, רגישות יתר למולקולה דווחה32. מגבלה נוספת היא שיש להשתמש ב-PRP כתוסף ביולוגי טרי ולא ניתן להקפיא אותו. לגבי מחצית החיים של טסיות הדם, הוכח בעבר כי לאחר 10 ימים, מחצית הטסיות הנוכחים PRP הם עדיין קיימא33. מסיבה זו, PRP נשמר בטמפרטורת החדר בשימוש במשך 10 ימים. יתר על כן, עבור טיפולים תאיים עתידיים הדורשים ייצור של מספר עצום של תאים, המגבלה העיקרית היא כמות הדם הכוללת שניתן למשוך מהמטופל.
לסיכום, פרוטוקול זה מדגים כי החלפת FBS עם PRP גורמת להתרחבות מהירה של פיברובלסטים. הטסיות הקיימות ב- PRP משחררות לאט תערובת מתוזמרת של גורמי גדילה במהלך שלב התרבות של ההתרחבות. המכשיר המוצג משמש במהלך הליך סטנדרטי המפחית את המורכבות ואת הזמן המעשי במהלך הכנת PRP. מערכת זו נחשבת לפיכך לשיטה מתאימה כאשר נדרשת הרחבה מהירה ובטוחה של ex vivo עבור יישומי טיפול תאי אוטולוגיים בתנאי GMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
פרויקט זה מומן על ידי Regen Lab SA. שרה ברנדט היא מנהלת הפרויקט הראשי של תרפיה תאית במעבדת Regen ומועסקת על ידי Regen Lab SA. אנטואן טורזי הוא מנכ"ל RegenLab.
Acknowledgments
אנו מודים למר גרגורי שנייטר על הסיוע הטכני בנתוני ציטומטריית זרימה; פרופ' מיוריאל קונדט (מעבדת הפרמקוגנוזיה, בית הספר למדעי התרופות ואוניברסיטת ז'נבה) על התרת השימוש בציטומטר זרימת Attune ובמיקרוסקופ Cytation 3 בעל תפוקה גבוהה; פרופסור בריג'יט פיטט לייעוץ מדעי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well black clear flat bottom | BD Falcon | 353219 | 32/case |
| Cell trace Violet Dye | Thermo Fischer Scientific | C34557 | 180 assays |
| CuteCell PRP | Regen Lab SA | CC-PRP-3T | 3 tubes per package |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 mg |
| DMEM | Gibco | 52400-025 | 500 mL |
| FBS | Gibco | 10270106 | 500 mL |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030024 | 100 mL |
| Hematology Counter | Sysmex | KK-21N | |
| Heparin 5000E Liquemine | Drossapharm AG | 0.5 mL | |
| HEPES Buffer Solution 1M | Gibco | 15630-056 | 100 mL |
| Liberase DH | Roche | 5401054001 | 2x 5 mg per package |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140-035 | 100 mL |
| Na Pyruvate 1mg/mL | Gibco | 11360-039 | 100 mL |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 mL |
| Phalloidin alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A12379 | 300 units |
| RPMI | Gibco | 31966-021 | 500 mL |
| Trypsin 1x 0.25% | Gibco | 25050-014 | 100 mL |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | 100 mL |
References
- Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A.
- Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
- Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
- Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
- Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
- Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
- Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
- Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
- Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
- van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
- Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
- Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
- Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
- Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
- Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
- Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
- Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
- Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
- Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
- Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
- Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
- Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
- Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
- Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
- Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
- Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
- Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
- Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
- Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
- Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J.
- Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).
