Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Bu protokol, %100 otolog fibroblast kültür sisteminde hücrelerin in vitro genişlemesini artırmak için PRP üreten bir cihaz sunar.

Abstract

Günümüzde otolog fibroblastların cilt onarımı için kullanımına büyük klinik ilgi vardır. Çoğu durumda, in vitro cilt hücrelerinin kültürü gereklidir. Bununla birlikte, ksenojenik veya allojenik kültür ortamını kullanan hücre kültürünün bazı dezavantajları vardır (yani, enfeksiyöz ajan iletimi veya yavaş hücre genişlemesi riski). Burada, bir hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması (PRP) kullanılarak insan derisi fibroblast hücrelerinin in vitro genişlemesi için otolog bir kültür sistemi geliştirilmiştir. İnsan dermal fibroblastları abdominoplasti yapılırken hastadan izole edilir. Kültürler, fetal sığır serumu (FBS) veya PRP ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak 7 güne kadar takip edilir. PRP preparatlarında kan hücresi içeriği, proliferasyonu ve fibroblast farklılaşması değerlendirilir. Bu protokol, özel bir tıbbi cihaz kullanarak standartlaştırılmış, aktive edilmemiş bir PRP preparatı elde etme yöntemini açıklamaktadır. Hazırlık sadece bir tıbbi cihaz (CuteCell-PRP) ve santrifüj gerektirir. Bu cihaz, yeterli tıbbi uygulama koşulları altında uygundur ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'lık tek, yumuşak bir spin santrifüjleme gerektiren tek adımlı, aprilojenik ve steril bir kapalı sistemdir. Santrifüjlemeden sonra, kan bileşenleri ayrılır ve trombosit bakımından zengin plazma kolayca toplanır. Bu cihaz, insan hücrelerinin in vitro genişlemesi için bir hücre kültürü takviyesi olarak kullanılabilecek hızlı, tutarlı ve standartlaştırılmış bir PRP preparatına izin verir. Burada elde edilen PRP, kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin tercihli olarak uzaklaştırılmasıyla, birlikte tam kana kıyasla 1.5 kat trombosit konsantrasyonu içerir. PRP'nin FBS'ye (7.7x) kıyasla hücre proliferasyonunda artırıcı bir etki gösterdiği ve PRP tedavisi üzerine fibroblastların aktive olduğu gösterilmiştir.

Introduction

Rejeneratif tıp, yaş, hastalık veya travma nedeniyle hasar gören doku ve organları iyileştirmeyi veya değiştirmeyi ve konjenital kusurları düzeltmeyi amaçlar. Otolog tedavide, hücreler veya dokular bir hastadan çekilir, genişletilir veya değiştirilir, daha sonra donöre yeniden verilir. Bu terapötik form, dermatoloji alanında geniş bir potansiyele sahiptir1. Otolog fibroblast tedavisinde, bir hastanın fibroblastları kırışıklıkları, ritidleri veya akne izlerini tedavi etmek için kültürlenir ve yeniden enjekte edilir. Fibroblastlar dermisteki ana fonksiyonel hücreler olduğundan, otolog fibroblastların enjeksiyonu yüz gençleştirmede diğer tedavilerden daha faydalı olabilir2.

Deride, fibroblastlar hücre dışı proteinlerin (yani kollajen, elastin, hyaluronik asit ve glikozaminoglikanlar) sentezinden ve salgılanmasından sorumludur. Ayrıca normal cilt homeostazında ve yara iyileşmesinde hücre fonksiyonunu, göçünü ve hücre-matriks/hücre-hücre etkileşimlerini düzenleyen büyüme faktörlerini serbest bırakırlar3. Dermal fibroblastlar, estetik ve plastik cerrahi prosedürlerinde cilt yara iyileşmesi4, doku rejenerasyonu5 veya dermal dolgu maddeleri için potansiyel bir klinik hücre tedavisi olarak tanıtılmıştır6. Bazı çalışmalar, rejeneratif tıp bağlamında, fibroblastların mezenkimal kök hücrelerden daha pratik ve etkili bir hücre tedavisi olabileceğini düşündürmektedir7.

Klinik uygulamalar için yeterli sayıda fibroblast elde etmek için, hücre genişlemesi genellikle zorunludur. Ex vivo / in vitro hücre kültürü, hücre yapışmasını ve çoğalmasını desteklemek için büyüme faktörleri, proteinler ve enzimlerle desteklenmiş bazal ortam gerektirir. Fetal sığır serumu (FBS), hücre kültürü ortamı için yaygın bir takviyedir, çünkü fetal kan 1) yetişkin kanına kıyasla büyüme faktörleri bakımından zengindir ve 2) düşük antikor içeriği sunar8. Hücre tedavisi ilerledikçe, FBS'nin kültür ortamına eklendiği klasik hücre kültürü koşullarının güvenliği konusunda endişeler vardır. Ayrıca, şimdi FBS'yi alternatif9 ile değiştirme eğilimi var. Birkaç FBS yedeği umut verici sonuçlar göstermiştir10.

Burada trombositten zengin plazma (PRP) alternatifi seçildi ve PRP'nin CuteCell-PRP adlı standart bir preparatını üretmek için tıbbi bir cihaz geliştirdik. Bu cihazın kullanım amacı, GMP koşulları altında otolog hücrelerin in vitro genişlemesi için bir kültür ortamı takviyesi olarak kullanılmak üzere otolog PRP'nin hazırlanmasıdır.

PRP, plazmada konsantre trombosit süspansiyonu olarak tanımlanır. 1) ihtiyaç duyulan kan miktarı, 2) kullanılan cihaz türleri ve 3) santrifüjleme protokolünde farklılık gösteren çok sayıda hazırlık protokolü olduğundan, ortaya çıkan trombosit konsantrasyonları kan bazal değerinin biraz üstünden 10 katından fazlasına kadar değişir. Ek olarak, PRP preparatları değişken seviyelerde kırmızı ve beyaz kan hücresi kontaminasyonu içerir. Bu nedenle "PRP" terminolojisi, biyolojik bileşimlerinde ve potansiyel terapötik etkilerinde büyük farklılıklar gösteren ürünleri tanımlamak için kullanılır.

Çoğu çalışmada, FBS ikamesi, aktive edilen farklı PRP konsantrasyonları kullanılarak (trombin veya kalsiyum ile) elde edilir. Bu yapay aktivasyon, trombosit büyüme faktörlerinin 15 dakikadan 24 saate kadar11 saate kadar derhal ve önemli bir şekilde salınmasına neden olur. Bu nedenle, trombosit aktivasyonunun, kademeli trombosit degranülasyonundan büyüme faktörlerinin yavaş salınımının gerekli olduğu hücre kültürlerindeki uygulamalar için istenmeyen bir durum olduğuna inanılmaktadır.

PRP tedavisi, konsantre plazma12'de otolog trombositlerin hazırlanmasını içerir. Optimal trombosit konsantrasyonu belirsizdir ve PRP13'ü hazırlamak için çok çeşitli ticari cihazlar mevcuttur. Bu standardizasyon eksikliği, çalışmalar arasındaki tutarsızlıktan kaynaklanmaktadır ve enjeksiyonun dozu ve zamanlaması ile ilgili bir kara kutuya yol açmıştır. Bu protokol, %100 otolog ex vivo kültür modelinde cilt fibroblastlarını genişletmek için bu özel PRP cihazını kullanarak otolog PRP elde etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çalışma protokolü Helsinki Deklarasyonu'na uyuyordu ve tüm hastalar çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Cenevre Üniversitesi Hastaneleri (Cenevre, İsviçre) Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Bölümü'nde abdominoplasti uygulanan sağlıklı kadınlardan deri örnekleri alınmaktadır. Prosedür, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygundur ve yerel kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol #3126).

1. PRP hazırlanması

NOT: CuteCell-PRP tüpleri (Malzeme Tablosu), kapalı devre sistemde hastanın kanının küçük bir hacminden PRP'nin hızlı bir şekilde hazırlanması için tasarlanmıştır.

  1. Tam kan toplanması
    NOT: Tıp enstitüsünün toplama protokolüne göre, PRP tüpüne doğrudan bağlı bir kelebek iğnesi kullanarak kolun periferik damarından otolog kan toplayın. Hasta anestezi altındaysa kan doğrudan venöz kanülden çekilebilir.
    1. Tüp blister paketini açın. Venöz ponksiyonu gerçekleştirin ve istediğiniz sayıda PRP tüpünü tam kanla doldurun. Tüplerin içindeki vakum, gerekli kan hacminin (~ 10 mL) otomatik olarak toplanmasını sağlayacaktır.
    2. Kanı antikoagülanla karıştırmak için tüpleri dikkatlice birkaç kez baş aşağı çevirin.
    3. Bir biyogüvenlik kabininin içinde (sınıf 2), daha fazla kan hücresi sayısı sayımı için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 100 μL toplam tam kanı çıkarın.
  2. Santrifüjleme
    NOT: Çalıştırmadan önce santrifüjün doğru şekilde dengelendiğinden emin olun.
    1. PRP tüplerinde kan toplandıktan sonra, gerekirse, PRP tüpündeki kanla aynı seviyeye kadar su ile bir karşı denge tüpü (ayrı olarak verilir) hazırlayın. Doldurulmuş tüpleri birbirinin karşısındaki santrifüje yerleştirin ve makinenin dengelendiğinden emin olun.
    2. Numuneleri 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj edin.
      NOT: İlgili rpm hızını santrifüj üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, kan fraksiyone olur. Kırmızı ve beyaz kan hücreleri jelin altında sıkışır ve trombositler jelin yüzeyine yerleşir (Şekil 1).
  3. Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kat ters çevirin.
    NOT: Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından emin olun. Plazma berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmelidir. Trombosit agregaları varsa, plazma ile toplanmalıdır.
  4. PRP toplamak için, 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir şırınga transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten alın.
    NOT: Her tüpten yaklaşık 5 mL PRP elde edilecektir. PRP çözeltisi artık son ortam hazırlığında karıştırılmaya hazırdır. Çözelti, hematoloji analizörü ve kullanımını içeren gelecekteki adımlara kadar güvenlik kabininin altında oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.
  5. PRP'yi kullanmadan önce, otomatik bir hematoloji analizörü kullanarak trombosit konsantrasyonunu, ortalama trombosit hacmini ve kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin sayısını belirleyin (Malzeme tablosu). Bunu yapmak için, çözeltinin 100 μL'sini dikkatlice geri çekin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    NOT: PRP,% 5-20 v / v arasındaki bir konsantrasyonda otolog bir kültür takviyesi olarak kullanılır. PRP'nin optimal konsantrasyonu her hücre hattı için belirlenmelidir. Fibrin pıhtı oluşumunu önlemek için, son kültür ortamına 2 U / mL heparin eklenmelidir.

2. FBS veya PRP takviyeli ortamlarda otolog fibroblastların ve kültürün izolasyonu

  1. Cilt numunelerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 50 mL'lik bir polipropilen tüpte hafifçe çalkalayarak yıkayın.
  2. Cilt örneği nispeten büyükse (>10 cm2), numuneyi 150cm2'lik bir doku kültürü kabının kapağına (epidermal yan aşağı) yerleştirin. Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın.
    NOT: Daha küçük numuneler için daha küçük doku kültürü kabı kullanın.
  3. Yağ kesme işlemi tamamlandığında, steril bir neşter kullanarak dokuyu yaklaşık 0,5 cm x 1,5 cm'lik şeritler halinde kesin.
  4. Steril 15 mL'lik bir tüpe 5 mL kollajenaz-dispaz karışımı (Malzeme Tablosu; 14 Wünsch ünitesi/mL) ekleyin.
  5. Kesilen dokuyu tüpe aktarın, doku parçalarının çözeltiye batırılmasını sağlayın. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın.
  6. Tüpleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin ve 150 dakika boyunca orbital sallantıya sahip olun. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
  7. Steril 100 mm'lik bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin. Sindirilmiş doku çözeltisini sıçramadan 100 mm'lik kültür kabının dibine aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, doku parçalarını 100 mm'lik kültür kabının altına aktarmak için steril 1 mL'lik bir pipet veya steril forseps kullanın.
  8. Epidermis şeridi yukarı bakacak şekilde, sağlam epidermis tabakasını iki çift forseps kullanarak dermisten ayırın. Doku şeridinin dermisini bir çift forseps ile ve epidermisin kenarını başka bir çift forseps ile tutun. Dermis ve epidermisi iki parça halinde soyun, ayrılan parçaları aynı kapakta tutun. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmeye çalışın ve her doku parçası için manipülasyonu tekrarlayın.
  9. Dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 mm kültür kabına aktarın.
  10. Laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları 3 mL% 0.3 tripsin / PBS içeren 15 mL'lik bir polipropilen tüpe yerleştirin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-20 dakika inkübe edin ve tüpü her 2-3 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
  11. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL buz gibi soğuk tam büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı [DMEM] veya% 10 FBS içeren RPMI) ekleyin. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin. Dermal kalıntıları gidermek için fibroblast süspansiyonunu 85 μm'lik bir naylon ağdan (50 mL'lik bir tüpün üstüne yerleştirilmiş) filtreleyin.
  12. 150 x g'de, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 100−1.000 μL tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.
  13. Hücre süspansiyonu ile karıştırılmış tripan mavisi (x2 seyreltme faktörü) kullanarak, hemositometrenin odasını doldurarak toplam ve canlı hücrelerin sayısını sayın.
    NOT: Hücre canlılığı, enzimatik sindirim için kullanılan koşullara bağlıdır. Hücre iyileşmesini ve hücre canlılığını arttırmak için, cilt örneği daha küçük parçalara ayrılabilir.
  14. 25cm2'lik bir doku kültürü şişesinde 5 mL tam FBS büyüme ortamında (DMEM, 56 ° C'de 60 dakika boyunca inaktive edilmiş% 10 FBS,% 1 1 M HEPES tampon çözeltisi,% 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı,% 100x L-glutamin,% 100x penisilin / streptomisin,% 1 100x sodyum piruvat plakası 3−10 x 10 x4 hücre. 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Canlı fibroblastlar 24 saat içinde şişeye yapışacak ve 2-3 gün içinde iğ şeklini sergilemeye başlayacaktır.
  15. 2. günde, yapışkan olmayan hücreler içeren ortamı aspire edin ve taze ortam ekleyin.
    NOT: Kültür ortamındaki ölü hücreler canlı fibroblastların büyümesini etkilediğinden, yapışkan olmayan, ölü hücreler kültürden uzaklaştırılmalıdır.
  16. Kültür% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
  17. Fibroblastları hasat etmek için, PBS ile yıkayın ve inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika boyunca tripsin / EDTA çözeltisi ile inkübe edin.
  18. Reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL sıcak tam büyüme ortamı (% 10 FBS içeren DMEM veya RPMI) ekleyin. Hemositometre ile hücreleri saymak için hücre süspansiyonunun bir alikotunu alın. Süspansiyonu 200 x g'de 5 dakika santrifüj edin ve ortamı aspirasyonla çıkarın.
  19. PRP besiyerindeki fibroblastın (DMEM, %20 PRP, %1 1 M HEPES tampon çözeltisi, %1 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı, %1 100x L-glutamin, %1 100x penisilin/streptomisin, %1 100x sodyum piruvat, 2 U/mL heparin) inkübatörde 37 °C'de kültürlenmesi.
    NOT: Önerilen minimum hücre yoğunluğu 4.000 canlı hücre/cm2'dir.
  20. PRP'nin fibroblast proliferasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, farklı PRP konsantrasyonlarına (%1, %5, %10, %20, %30, %40 ve %50) ve 2 U/mL heparin veya klasik kültür ortamı koşullarında (%10 FBS) PRP besiyerinde kuyu başına 8 x 103 hücre yoğunluğunda 24 kuyucuk plakasında tohum fibroblastları (pasaj 2). 7 günlük kültürden sonra, hücrelere hayati bir boya (hücre proliferasyon menekşesi) ekleyin ve proliferasyonu akış sitometrisi ile değerlendirin.
  21. Sitoiskelet yeniden düzenlemelerini incelemek için, tam FBS büyüme DMEM'inde 1 x 10 5 hücre / mL konsantrasyonunda 96 kuyu siyah / berrak düz taban plakasındaki tohum hücreleri (bkz. adım 2.14) 24 saat boyunca%0.5 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri 7 gün boyunca% 10 FBS veya farklı PRP konsantrasyonları (% 1,% 5,% 10,% 20,% 30,% 40 ve% 50) ile tedavi edin.
    1. Fibroblastları 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirin. fibroblastları 50 mL 5 U / mL faloidin ile lekeleyin, PBS ile 2 kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 50 mL 1 mg / mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile işaretleyin. Sitasyon 3 hücreli görüntüleme multimod okuyucu (BioTek) kullanılarak faloidin boyanması görüntülendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu patentli teknoloji, standartlaştırılmış PRP preparatları üretmek için kullanılan basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir tıbbi cihazdır. 1.500 x g'de 5 dakikalık santrifüjlemeden sonra (ayırıcı jel teknolojisi nedeniyle) PRP'nin venöz tam kandan hazırlanmasını sağlayan tek adımlı, tamamen kapalı bir sistemdir. Santrifüjleme sonrası elde edilen PRP, jelin altına oturan kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden temizlenir. Birkaç tüp inversiyonundan sonra jelin üstünde bulunan trombositler plazmada tekrar askıda tutulur ve PRP kullanıma hazır hale gelir (Şekil 1).

Preparattaki kan hücresi içeriğinin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, hematoloji analizörü ile 10 farklı hastadan tam kan ve PRP örnekleri analiz edildi. Tam kanın cihazla işlenmesinden sonra, kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) ve beyaz kan hücrelerinin (WBC'ler) çoğunluğu çıkarıldı. Ortalama trombosit konsantrasyonu, tam kanda bulunan fizyolojik konsantrasyona kıyasla 1.5 kat artış göstermiştir (Şekil 2).

Otolog kültür kurulumunda, bir hastanın izole fibroblastları, klasik kültür ortamı durumuna (% 10 FBS) kıyasla artan PRP konsantrasyonlarının (% 1-50) varlığında yetiştirildi. Medyayı değiştirmeden 7 günlük kültürden sonra,% 20 PRP ile astarlanan kültürler daha fazla sayıda canlı fibroblast sergiledi (Şekil 3A, B; kontrol durumuna kıyasla 7.7 kat daha yüksek). Phalloidin boyaması, PRP aktivasyonunda gözlenen morfolojik değişikliğin, fibroblast aktivasyonunun bir imzası olan F-aktin reorganizasyonu ile ilişkili olduğunu kanıtladı (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: GMP koşulları altında otolog hücrelerin in vitro genişlemesi için bir kültür ortamı takviyesi olarak kullanılmak üzere otolog PRP'nin hazırlanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kan hücresi ve trombosit sayımları. Ticari cihazla hazırlanan PRP, vericiler arası varyasyonlara rağmen yüksek oranda tekrarlanabilir kan hücresi içeriği gösterir. PLT: trombositler (x 105); WBC'ler: beyaz kan hücreleri (x 103); RBC'ler: kırmızı kan hücreleri (x 106), n = 10 hasta. Bu rakam Berndt ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: PRP proliferatif etkilerinin otolog fibroblast kültürü üzerine değerlendirilmesi. (A) 7 günlük kültürden sonra aynı hastadan izole edilen fibroblastlara eklenen %20 PRP ortamının artırıcı etkilerini gösteren temsili parlak alan mikroskobik görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) PRP proliferatif etkisinin vital boya kullanılarak akım sitometrisi ile değerlendirilmesi. PRP konsantrasyonlarının artmasının (%1-50) %10 FBS (n=10 hasta) ile karşılaştırıldığında, tam otolog bir sistemde orta değişiklik olmaksızın 7 gün boyunca normal insan dermal fibroblastı (NHDF) üzerine proliferatif etkileri (aynı hastadan alınan hücreler ve PRP; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). Bu rakam Berndt ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: F-aktin boyama yoluyla sitoiskelet görüntüleme. %20 PRP'de (sağ panel) büyütülen 7 gün sonra, fibroblastlar aktive edilir ve %10 FBS (sol panel) ile kontrol kültürü koşullarına kıyasla hücre iskeletlerini yeniden düzenler. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakam Berndt ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Otolog fibroblastların yara hücresi tedavisinde diğer dolgu maddelerine kıyasla doğal bir alternatif olarak kullanılmasının avantajları arasında iyi biyouyumluluk, minimal yan etkiler ve hasat ve kullanım kolaylığı sayılabilir. Bununla birlikte, bu terapötikleri günlük klinik ortamda kullanmadan önce, büyüme özelliklerini tanımlamak ve transplantasyondan önce ve sonra izole fibroblastların biyolojik fonksiyonunu ve güvenliğini değerlendirmek için uygun klinik öncesi çalışmalar gereklidir. Bu nedenle, izolasyon işleminden hemen sonra, hücre bölünmelerinin sayısını sınırlamak için hücrelerin in vitro genişlemesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Nihai otolog biyolojik ürünün güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için kültür koşulları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir.

Yayınlanmış preklinik çalışmalarda, 3-4 pasajlarındaki hücreler, hücre miktarı ve proliferatif / salgı aktivitesi açısından en uygun oldukları için tipik olarak enjekte edilmek üzere seçilmiştir15. Klinik öncesi araştırmaların çoğu, FBS'nin besin ve büyüme faktörlerinin kaynağı olduğu kültür ortamı ile gerçekleştirilmiştir16. Bununla birlikte, bu ksenojenik büyüme takviyesi, olası bir enfeksiyon ve immünolojik reaksiyon riski sunar. Dünya çapında sürülerde sığır süngerimsi ensefalopatisinin (BSE) ortaya çıkması nedeniyle, ksenojenik materyalin hücre tedavisi kültürlerine girme riski nedeniyle FBS'nin hücre kültürü takviyesi olarak kullanılmasıyla ilgili önemli düzenleyici kaygılar vardır10.

Genellikle, fibroblast veya mezenkimal kök hücrelerin (MSC) proliferasyonu, FBS takviyeli büyüme ortamı kullanılarak elde edilir. FBS, hücre kültürü için yeterli bir besin kaynağı olmasına rağmen, zoonoz kontaminasyonu riskinin yanı sıra ek engeller de oluşturmaktadır. İlk olarak, FBS ürünleri, kısmen azalan çoğalma oranları ve uzatılmış bir kültür genişleme süresi nedeniyle insan kanından türetilen ürünlere kıyasla büyük bir üretim maliyeti sunmaktadır9. İkincisi, FBS, izole edilmiş hücrelerle etkileşime giren bir ksenoprotein kaynağıdır, böylece nakledilen hücrelerdeki yüzey protein komplekslerine karşı antikorların ortaya çıkması nedeniyle bağışıklık reaksiyonu riskini arttırır10.

FBS'nin hücrelerin klinik genişlemesi için bir besin maddesi olarak potansiyel dezavantajlarını ele almak için, insan kanından türetilmiş ürünler alternatif olarak tanıtılmıştır. Bazı çalışmalar, hücre genişlemesi için kültür ortamındaki FBS'nin otolog insan serumu ile değiştirilmesini önermiştir, ancak hücre proliferasyonu yavaş olduğundan, transplantasyondan önce hala uzun bir kültür süresi (3 hafta) ve birkaç hücre geçişi gerektirir17,18.

Diğer gruplar, trombosit konsantrelerinin dondurularak çözülmesinden sonra trombositlerden salınan büyüme faktörleri bakımından zengin, hücresiz bir süpernatant olan trombosit lizatı (PL) kullanmışlardır. PL'nin PRP'ye kıyasla en büyük avantajı dondurulmuş depolama potansiyelidir. Bu nedenle, aynı parti ardışık hücre kültürü uygulamaları için kullanılabilir. Ayrıca, kullanıma hazır bir ürün olarak, kullanımdan önce büyüme faktörü içeriği ve diğer biyolojik özellikler analiz edilerek standartlaştırılabilir. Bazı dezavantajları, allojenik olması ve partilerin birkaç bağışçıdan toplanmasıdır. Ayrıca, PL, 10 güne kadar sitokinler ve büyüme faktörleri üretebilen herhangi bir canlı trombosit içermediğinden, PL içeren kültür ortamının her 3 günde bir değiştirilmesi gerekir (kültür PRP ile desteklendiğinde 7-10 gün yerine)19. Hücreleri in vitro olarak kendi büyüme faktörleri ve bu PRP preparatı tarafından sağlanan besin maddeleri kaynağında genişletmek kesinlikle avantajlıdır. Preparat, hücre kültüründe reddedilmeye, alerjiye veya bulaşıcı hastalığın bulaşmasına neden olabilecek herhangi bir ksenojenik takviye içermez.

Önceki çalışmalarda, otolog PRP'nin yağ kaynaklı mezenkimal kök hücre (ADSC) proliferasyonu için güvenli, verimli ve uygun maliyetli bir kültür ortamı olarak kullanılabileceği gösterilmiştir20. %20 otolog PRP ile beslenen besiyer, hücre fenotipini değiştirmeden hücre proliferasyonunu 13 kata kadar arttırmıştır. Kliniklerde PRP'nin güçlü gençleştirme ve rejenerasyon kapasitesine sahip olduğu düşünülmektedir.

Şu anda, bir hastanın kanından elde edilen PRP, klinik ortamda tek başına yara iyileşmesi için21 veya hyaluronik asit 22,23 veya kemik rejenerasyonu24,25 ile kombinasyon halinde zaten etkili bir şekilde kullanılmaktadır; veya tek başına cilt gençleştirme26 veya yağ kaynaklı stromal vasküler fraksiyon hücreleri ile kombinasyon halinde27,28,29. Bu, otolog fibroblastların genişlemesini teşvik etmek için bir hastanın kendi PRP'sini kullanmanın araştırılmasına neden oldu.

Bu amaçla ve PRP preparatı ile elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için özel bir PRP cihazı geliştirdik. Bu kapalı sistem, hastanın donöründen kaynaklanan dalgalanmaları en aza indirmek için bir ön koşul olan PRP preparatlarının standardizasyonuna izin verir (trombosit konsantrasyonu ve operatöre bağlı varyasyonlar ile ilgili olarak). 10 hastadan elde edilen kan hücresi sayımları, protokolün yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir (Şekil 2). Ayrıca, PRP'nin FBS'ye kıyasla 7.7 kata kadar proliferasyon arttırıcı olarak güçlü etkileri olduğu gösterilmiştir (Şekil 3B). Bu, genişletme işlemi için gereken maliyetleri ve zamanı azaltmak için önemlidir. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, PRP'nin fibroblast proliferasyonunu ve farklılaşmasını nasıl etkilediğini daha fazla analiz ettik. %20 PRP, hücre fenotipini veya genotip14'ü etkilemeden en iyi etkinliği göstermiştir.

Yöntemin bir sınırlaması, PRP içeren ortamın pıhtı oluşumunu önlemek için heparin ile hazırlanması gerektiğidir. Bu cihazda standart plazma antikoagülanı (sodyum sitrat antikoagülanı ve kalsiyum şelatör) kullanılsa da, kalsiyum30 içeren kültür ortamına plazma eklendiğinde fibrin pıhtılaşması meydana gelebilir. PRP preparatına ek olarak heparin de bu fibrin pıhtı oluşumunu engeller. Bununla birlikte, heparinler büyüme faktörlerini bağlayabilir ve hücre büyümesine müdahale edebilir30. Örneğin, heparinin dermal fibroblast proliferasyonunu olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir31. Bununla birlikte, kullanılan konsantrasyonlar, bu çalışmada kullanılan konsantrasyona kıyasla 4 kat daha konsantreydi (2 U / mL).

Ayrıca, ticari heparin esas olarak domuz kaynaklarından arındırılır; Bu nedenle, hayvansal kökeni nedeniyle, tamamen ksenosuz ortamın gelişiminde bir sınırlamayı temsil eder. Domuz heparini insan tedavisi için onaylanmış olmasına rağmen, moleküle aşırı duyarlılık bildirilmiştir32. Diğer bir sınırlama, PRP'nin taze bir biyolojik takviye olarak kullanılması ve dondurulmamasıdır. Trombositlerin yarı ömrü ile ilgili olarak, 10 gün sonra, PRP'de bulunan trombositlerin yarısının hala canlı olduğu daha önce gösterilmiştir33. Bu nedenle PRP oda sıcaklığında tutulur ve 10 gün boyunca kullanılır. Dahası, çok sayıda hücrenin üretilmesini gerektiren gelecekteki hücre tedavileri için ana sınırlama, hastadan çekilebilecek toplam kan miktarıdır.

Özetle, bu protokol FBS'nin PRP ile değiştirilmesinin fibroblastların hızlı bir şekilde genişlemesine neden olduğunu göstermektedir. PRP'de bulunan trombositler, genişlemenin kültür aşamasında organize edilmiş bir büyüme faktörleri karışımını yavaşça serbest bırakır. Sunulan cihaz, PRP'nin hazırlanması sırasında karmaşıklığı ve uygulamalı süreyi azaltan standartlaştırılmış bir prosedür sırasında kullanılır. Bu nedenle GMP koşullarında otolog hücre tedavisi uygulamaları için hızlı ve güvenli bir ex vivo genişlemeye ihtiyaç duyulduğunda bu sistem uygun bir yöntem olarak kabul edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu proje Regen Lab SA tarafından finanse edilmiştir. Sarah Berndt, Regen Lab'ın hücre terapisi baş proje yöneticisidir ve Regen Lab SA tarafından istihdam edilmektedir. Antoine Turzi, RegenLab'ın CEO'sudur.

Acknowledgments

Akış sitometrisi verileriyle ilgili teknik yardım için Sayın Grégory Schneiter'e teşekkür ederiz; Profesör Muriel Cuendet (Farmakognozi Laboratuvarı, Farmasötik Bilimler Fakültesi ve Cenevre Üniversitesi), Attune akış sitometresinin ve Cytation 3 yüksek verimli mikroskobun kullanımına izin verdiği için; Profesör Brigitte Pittet bilimsel tavsiyeler için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

Retraksiyon Sayı 168 trombositten zengin plazma PRP fibroblastlar hücre proliferasyonu hücre göçü yara iyileşmesi hücre kültürü hücre tedavisi
In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter