Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produksjon av autologt blodplaterikt plasma for å øke ekspansjon av human fibroblast in vitro

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Denne protokollen presenterer en enhet som produserer PRP for å øke in vitro-utvidelsen av celler i et 100% autologt fibroblastkultursystem.

Abstract

Det er for tiden stor klinisk interesse for bruk av autologe fibroblaster for hudreparasjon. I de fleste tilfeller er dyrkning av hudceller in vitro nødvendig. Imidlertid har cellekultur ved bruk av xenogene eller allogene kulturmedier noen ulemper (dvs. risiko for overføring av smittestoff eller langsom celleutvidelse). Her utvikles et autologt dyrkningssystem for utvidelse av humane hudfibroblastceller in vitro ved bruk av pasientens eget blodplaterike plasma (PRP). Humane dermale fibroblaster isoleres fra pasienten mens de gjennomgår bukplastikk. Kulturer følges i opptil 7 dager ved bruk av et medium supplert med enten føtalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodcelleinnhold i PRP-preparater, proliferasjon og fibroblastdifferensiering vurderes. Denne protokollen beskriver metoden for å oppnå et standardisert, ikke-aktivert preparat av PRP ved bruk av et dedikert medisinsk utstyr. Preparatet krever bare en medisinsk enhet (CuteCell-PRP) og sentrifuge. Denne enheten er egnet under tilstrekkelige medisinske praksisforhold og er et ett-trinns, apyrogent og sterilt lukket system som krever en enkelt, myk sentrifugering på 1,500 x g i 5 minutter. Etter sentrifugering separeres blodkomponentene, og det blodplaterike plasmaet samles lett. Denne enheten tillater en rask, konsistent og standardisert fremstilling av PRP som kan brukes som et cellekulturtilskudd for in vitro-utvidelse av humane celler. PRP oppnådd her inneholder en 1,5 ganger blodplatekonsentrasjon sammenlignet med fullblod sammen, med en fortrinnsvis fjerning av røde og hvite blodlegemer. Det er vist at PRP gir en forsterkende effekt i celleproliferasjon sammenlignet med FBS (7.7x) og at fibroblaster aktiveres ved PRP-behandling.

Introduction

Regenerativ medisin tar sikte på å helbrede eller erstatte vev og organer som er skadet av alder, sykdom eller traumer, samt korrigere medfødte defekter. Ved autolog behandling blir celler eller vev trukket fra en pasient, utvidet eller modifisert, og deretter gjeninnført til donoren. Denne formen for terapi har bredt potensial innen dermatologi1. I autolog fibroblastbehandling blir pasientens fibroblaster dyrket og reinjisert for å behandle rynker, rim eller akne arr. Siden fibroblaster er de viktigste funksjonelle cellene i dermis, kan injeksjon av autologe fibroblaster være mer fordelaktig enn andre terapier i ansiktsforyngelse2.

I huden er fibroblaster ansvarlige for syntese og sekresjon av ekstracellulære proteiner (dvs. kollagen, elastin, hyaluronsyre og glykosaminoglykaner). De frigjør også vekstfaktorer som regulerer cellefunksjon, migrasjon og cellematrise / celle-celle-interaksjoner i normal hudhomeostase og sårheling3. Dermale fibroblaster har allerede blitt introdusert som en potensiell klinisk celleterapi for hudsårheling4, vevregenerering5 eller dermale fyllstoffer i estetiske og plastikkirurgiske prosedyrer6. Noen studier tyder til og med på at fibroblaster i sammenheng med regenerativ medisin kan være en mer praktisk og effektiv celleterapi enn mesenkymale stamceller7.

For å oppnå et tilstrekkelig antall fibroblaster for kliniske anvendelser, er celleutvidelse vanligvis obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellekultur krever basalmedium supplert med vekstfaktorer, proteiner og enzymer for å støtte celleadhesjon og proliferasjon. Fetal bovine serum (FBS) er et vanlig supplement for cellekulturmedier, fordi fosterblod 1) er rik på vekstfaktorer sammenlignet med voksent blod og 2) presenterer et lavt antistoffinnhold8. Etter hvert som celleterapi utvikler seg, er det bekymringer om sikkerheten til klassiske cellekulturforhold der FBS legges til kulturmediet. Videre er det nå en tendens til å erstatte FBS med alternativer9. Flere FBS-innbyttere har vist lovende resultater10.

Det blodplaterike plasma (PRP) alternativet er valgt her, og vi har utviklet et medisinsk utstyr for å produsere et standardisert preparat av PRP, kalt CuteCell-PRP. Den tiltenkte bruken av denne enheten er fremstilling av autolog PRP som skal brukes som et kulturmedietilskudd for in vitro-ekspansjon av autologe celler under GMP-betingelser.

PRP er definert som en konsentrert platesuspensjon i plasma. Fordi det er mange forberedelsesprotokoller, som varierer i 1) mengden blod som trengs, 2) typer enheter som brukes, og 3) sentrifugeringsprotokoll, varierer de resulterende blodplatekonsentrasjonene fra litt over til mer enn 10x blodutgangsverdien. I tillegg inneholder PRP-preparater variable nivåer av forurensning av røde og hvite blodlegemer. Terminologien "PRP" brukes dermed til å beskrive produkter som varierer sterkt i sin biologiske sammensetning og potensielle terapeutiske effekter.

I de fleste studier oppnås FBS-substitusjon ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av PRP som aktiveres (av trombin eller kalsium). Denne kunstige aktiveringen provoserer en umiddelbar og viktig frigjøring av blodplatevekstfaktorer fra 15 minutter til 24 timer11. Derfor antas det at blodplateaktivering er uønsket for anvendelser i cellekulturer, hvor langsom frigjøring av vekstfaktorer fra gradvis blodplatedegranulering er nødvendig.

PRP-terapi innebærer fremstilling av autologe blodplater i konsentrert plasma12. Den optimale blodplatekonsentrasjonen er uklar, og et bredt spekter av kommersielle enheter er tilgjengelig for å forberede PRP13. Denne mangelen på standardisering skyldes inkonsekvens blant studier og har ført til en svart boks angående dosering og tidspunkt for injeksjon. Denne protokollen beskriver en prosedyre for å oppnå autolog PRP ved hjelp av denne dedikerte PRP-enheten for å utvide hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo kulturmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studieprotokollen var i samsvar med Helsinkideklarasjonen, og alle pasientene ga skriftlig informert samtykke før de deltok i studien. Hudprøver er tatt fra friske kvinner som gjennomgår bukplastikk ved avdelingen for plastisk, rekonstruktiv og estetisk kirurgi ved universitetssykehusene i Genève (Genève, Sveits). Prosedyren er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av den lokale institusjonelle etiske komiteen (protokoll #3126).

1. Forberedelse av PRP

MERK: CuteCell-PRP-rørene (materialfortegnelse) er designet for rask fremstilling av PRP fra et lite volum av pasientens blod i et lukket kretssystem.

  1. Samling av fullblod
    MERK: Høst autologt blod fra en perifer vene i armen ved hjelp av en sommerfuglnål direkte koblet til PRP-røret, i henhold til innsamlingsprotokollen til medisinsk institutt. Blod kan trekkes direkte gjennom venekanylen hvis pasienten er under anestesi.
    1. Åpne tubeblisterpakningen. Utfør venøs punktering og fyll ønsket antall PRP-rør med fullblod. Vakuumet i rørene vil muliggjøre automatisk oppsamling av det nødvendige volumet blod (~10 ml).
    2. Skru forsiktig rørene opp ned flere ganger for å blande blodet med antikoagulant.
    3. Inne i et biosikkerhetskabinett (klasse 2), fjern 100 μL totalt fullblod ved hjelp av en 1 ml sprøyte for ytterligere antall blodceller.
  2. Sentrifugering
    MERK: Forsikre deg om at sentrifugen er riktig balansert før du starter den.
    1. Når blodet er samlet i PRP-rørene, må du om nødvendig lage et motvektsrør (leveres separat) med vann til samme nivå som blodet i PRP-røret. Plasser de fylte rørene i sentrifugen motsatt hverandre, og sørg for at maskinen er balansert.
    2. Sentrifugeprøver ved 1,500 x g i 5 minutter.
      MERK: Still inn tilsvarende turtallshastighet i henhold til sentrifugeprodusentens instruksjoner. Etter sentrifugering vil blodet bli fraksjonert. De røde og hvite blodcellene fanges under geleen, og blodplatene legger seg på overflaten av gelen (figur 1).
  3. Snu PRP-røret forsiktig 20x for å resuspendere blodplateavleiringen i plasmasupernatanten.
    MERK: Forsikre deg om at blodplatene er helt løsnet fra gelen. Plasmaet bør skifte fra klart og gjennomsiktig til uklart. Hvis blodplateaggregater er tilstede, bør de samles med plasma.
  4. For å samle PRP, ta plasmaoppløsningen fra røret ved hjelp av en sprøyteoverføringsenhet koblet til en 10 ml sprøyte.
    MERK: Omtrent 5 ml PRP vil bli oppnådd fra hvert rør. PRP-løsningen er nå klar til å blandes i det endelige mediet forberedelse. Løsningen kan oppbevares ved romtemperatur (RT) under sikkerhetsskapet inntil fremtidige trinn involverer hematologisk analysator og bruk.
  5. Før du bruker PRP, må du bestemme blodplatekonsentrasjonen, gjennomsnittlig blodplatevolum og antall røde og hvite blodlegemer ved hjelp av en automatisert hematologisk analysator (materialfortegnelse). For å gjøre det, trekk forsiktig ut 100 μL av løsningen og overfør til et 1,5 ml rør.
    MERK: PRP brukes som et autologt kulturtilskudd i en konsentrasjon mellom 5-20% v / v. Den optimale konsentrasjonen av PRP må bestemmes for hver cellelinje. For å hindre fibrindannelse bør det endelige dyrkningsmediet suppleres med 2 E/ml heparin.

2. Isolering av autologe fibroblaster og kultur i FBS- eller PRP-supplerte medier

  1. Vask hudprøver i fosfatbufret saltvann (PBS) ved å riste forsiktig i et 50 ml polypropylenrør.
  2. Hvis hudprøven er relativt stor (>10 cm 2), legg prøven på lokket på en 150 cm2 vevskulturskål (epidermal side ned). Fjern det subkutane fettvevet ved hjelp av en tang og saks. For å forhindre at vevet tørker ut, skyll vevet noen få minutter i PBS.
    MERK: Bruk mindre vevskulturskål for mindre prøver.
  3. Når fetttrimmingen er fullført, kutt vevet i ca. 0,5 cm x 1,5 cm strimler ved hjelp av en steril skalpell.
  4. Tilsett 5 ml kollagenase-dispaseblanding (materialfortegnelse; 14 Wünsch-enheter/ml) til et sterilt 15 ml rør.
  5. Overfør det kuttede vevet til røret, slik at vevstykkene er nedsenket i løsningen. Sett lokk på røret forsvarlig.
  6. Plasser rørene i en kuvøse ved 37 °C med orbital risting i 150 min. Etter inkubering, plasser røret som inneholder vevet i biosikkerhetsskapet.
  7. Plasser lokket på en steril 100 mm kulturskål opp ned i biosikkerhetsskapet. Overfør den fordøyde vevsoppløsningen til bunnen av 100 mm kulturfatet, uten sprut. Hvis det er noen vevsbiter igjen i røret, bruk en steril 1 ml pipette eller steril tang for å overføre vevsbitene til bunnen av 100 mm kulturfatet.
  8. Med epidermisstripen vendt opp, skille det intakte epidermisarket fra dermis ved å bruke to par tang. Hold dermis av vevstrimmelen med et par tang og kanten av epidermis med et annet par tang. Skrell dermis og epidermis fra hverandre i to stykker, og hold de adskilte stykkene på samme lokk. Prøv å utføre dette trinnet raskt og gjenta manipulasjonen for hvert stykke vev.
  9. Overfør de dermale bitene til en ny 100 mm kulturskål som inneholder PBS.
  10. Bruk laboratorietang til å plassere hudbitene i et 15 ml polypropylenrør med 3 ml 0,3 % trypsin/PBS. Inkuber i 10-20 minutter i et vannbad på 37 °C og snu røret flere ganger hvert 2-3 min.
  11. For å stoppe den enzymatiske reaksjonen, tilsett 3-5 ml iskaldt komplett vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium [DMEM] eller RPMI som inneholder 10% FBS). Virv røret kraftig flere ganger. Filtrer fibroblastsuspensjonen gjennom et 85 μm nylonnett (plassert over toppen av et 50 ml rør) for å fjerne dermale rusk.
  12. Sentrifuge i 10 minutter ved 150 x g, ved 4 °C. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 100-1000 μL komplett vekstmedium.
  13. Bruk trypanblått (fortynningsfaktor på x2) blandet med cellesuspensjonen, tell antall totale og levedyktige celler ved å fylle kammeret til hemocytometeret.
    MERK: Cellens levedyktighet avhenger av forholdene som brukes til enzymatisk fordøyelse. For å øke celleutvinning og celle levedyktighet, kan hudprøven kuttes i mindre biter.
  14. Plate 3-10 x 104 celler i 5 ml komplett FBS vekstmedium (DMEM, 10% FBS varmeinaktivert i 60 minutter ved 56 ° C, 1% 1 M HEPES bufferløsning, 1% 100x ikke-essensiell aminosyreblanding, 1% 100x L-glutamin, 1% 100x penicillin / streptomycin, 1% 100x natriumpyruvat) i en 25 cm2 vevskulturkolbe. Inkuber ved 37 °C.
    MERK: Levedyktige fibroblaster vil feste seg til kolben innen 24 timer og begynne å vise spindelformen om 2-3 dager.
  15. På dag 2, aspirer mediet som inneholder ikke-adherente celler og tilsett friskt medium.
    MERK: Siden døde celler i kulturmediet påvirker veksten av levedyktige fibroblaster, må ikke-adherente, døde celler fjernes fra kulturen.
  16. Bytt medium hver 3-4 dag til kulturen når 70-80% sammenløp.
  17. For å høste fibroblaster, vask med PBS og inkuber med trypsin / EDTA-oppløsning i 3 minutter ved 37 ° C i inkubatoren.
  18. For å stoppe reaksjonen, tilsett 3-5 ml varmt, komplett vekstmedium (DMEM eller RPMI inneholdende 10% FBS). Ta en alikot av cellesuspensjonen for å telle cellene med hemocytometeret. Sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 200 x g og fjern mediet ved aspirasjon.
  19. Dyrkning av fibroblast i PRP-medium (DMEM, 20 % PRP, 1 % 1 M HEPES-bufferløsning, 1 % 100x ikke-essensiell aminosyreblanding, 1 % 100x L-glutamin, 1 % 100x penicillin/streptomycin, 1 % 100x natriumpyruvat, 2 U/ml heparin) i inkubatoren ved 37 °C.
    MERK: Den minste anbefalte celletettheten er 4,000 levedyktige celler / cm2.
  20. For å vurdere PRP-effekter på fibroblastproliferasjon, frøfibroblaster (passasje 2) i 24 brønnplater med en tetthet på 8 x 103 celler per brønn i PRP-medium med forskjellige PRP-konsentrasjoner (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% og 50%) og med 2 U / ml heparin eller under klassisk kultur middels forhold (10% FBS). Etter 7 dager med kultur, tilsett et vitalt fargestoff (celleproliferasjonsfiolett) til celler og vurder proliferasjonen ved flowcytometri.
  21. For å studere cytoskjelettrearrangementer, frøceller i 96 godt svarte / klare flate bunnplater i en konsentrasjon på 1 x 10 5 celler / ml i komplett FBS vekst DMEM (se trinn 2.14) supplert med0.5 % FBS i 24 timer. Behandle celler med 10% FBS eller forskjellige PRP-konsentrasjoner (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% og 50%) i 7 dager.
    1. Fest fibroblastene med 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabiliser med 0,1% Triton X-100 i 5 minutter ved RT. Beis fibroblastene med 50 ml 5 U / ml falloidin, vask 2x med PBS, og merk med 50 ml 1 mg / ml 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter. Cytasjon 3 celle imaging multimode reader (BioTek) ble brukt til å visualisere falloidinfarging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne patenterte teknologien er en enkel, rask og reproduserbar medisinsk enhet som brukes til å produsere standardiserte PRP-preparater. Det er et ett-trinns, helt lukket system som tillater fremstilling av PRP fra venøst fullblod etter 5 min sentrifugering ved 1,500 x g (på grunn av separasjonsgelteknologien). PRP oppnådd etter sentrifugering fjernes fra røde og hvite blodlegemer, som sitter under gelen. Etter flere tubeinversjoner resuspenderes blodplatene som ligger på toppen av gelen i plasma, og PRP er klar til bruk (figur 1).

For å vurdere reproduserbarheten av blodcelleinnholdet i preparatet ble fullblod- og PRP-prøver analysert fra 10 forskjellige pasienter med hematologisk analysator. Etter behandling av fullblod med enheten, ble flertallet av røde blodlegemer (RBC) og hvite blodlegemer (WBC) fjernet. Gjennomsnittlig trombocyttkonsentrasjon viste en økning på 1,5 ganger sammenlignet med den fysiologiske konsentrasjonen i fullblod (figur 2).

I det autologe kulturoppsettet ble en pasients isolerte fibroblaster dyrket i nærvær av økende PRP-konsentrasjoner (1-50%), sammenlignet med klassisk kulturmedium tilstand (10% FBS). Etter 7 dager med kultur uten å endre media, viste kulturene primet med 20% PRP et høyere antall levedyktige fibroblaster (figur 3A, B; 7,7x høyere sammenlignet med kontrolltilstanden). Falloidinfarging viste at den morfologiske endringen observert på-PRP-aktivering var relatert til F-aktinreorganisering, som er en signatur for fibroblastaktivering (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av autolog PRP til bruk som kulturmedietilskudd for in vitro-ekspansjon av autologe celler under GMP-betingelser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Blodceller og trombocytter. PRP fremstilt med den kommersielle enheten viser svært reproduserbart blodcelleinnhold til tross for variasjoner mellom donorer. PLT: blodplater (x 105); WBC: hvite blodlegemer (x 103); RBC: røde blodlegemer (x 106), n = 10 pasienter. Denne figuren er modifisert fra Berndt et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av PRP-proliferative effekter på autolog fibroblastkultur. (A) Representative brightfield mikroskopiske bilder som demonstrerer den forsterkende effekten av 20% PRP-medium tilsatt fibroblaster isolert fra samme pasient etter 7 dager med kultur. Skala bar = 100 μm. (B) Vurdering av PRP proliferativ effekt ved flowcytometri ved bruk av vitalt fargestoff. Proliferative effekter av økende PRP-konsentrasjoner sammenlignet (1-50%) med 10% FBS (n = 10 pasienter) på normal human dermal fibroblast (NHDF) i 7 dager uten middels endring i et komplett autologt system (celler og PRP fra samme pasient; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Denne figuren er modifisert fra Berndt et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cytoskjelettvisualisering ved F-aktinfarging. Etter 7 dager vokst i 20% PRP (høyre panel), aktiveres fibroblaster og omorganiserer cytoskjelettet sammenlignet med kontrollkulturforhold med 10% FBS (venstre panel). Skala bar = 200 μm. Denne figuren er modifisert fra Berndt et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene ved å bruke autologe fibroblaster som et naturlig alternativ sammenlignet med andre fyllmaterialer i sårcelleterapi inkluderer god biokompatibilitet, minimale bivirkninger og enkel høsting og bruk. Før du bruker disse terapiene i en daglig klinisk setting, er det imidlertid nødvendig med riktige prekliniske studier for å identifisere vekstfunksjonene og vurdere den biologiske funksjonen og sikkerheten til isolerte fibroblaster både før og etter transplantasjon. Således, rett etter isolasjonsprosessen, må in vitro ekspansjon av cellene utføres raskt for å begrense antall celledelinger. Dyrkningsbetingelsene må kontrolleres nøye for å sikre sikkerheten og effekten av det endelige autologe biologiske produktet.

I publiserte prekliniske studier har celler i passasje 3-4 typisk blitt valgt til å injiseres, da de er best egnet med tanke på cellemengde og proliferativ/sekretorisk aktivitet15. Det meste av preklinisk forskning har blitt utført med kulturmedier der FBS er kilden til næringsstoffer og vekstfaktorer16. Imidlertid presenterer dette xenogene veksttilskuddet en mulig risiko for infeksjon og immunologiske reaksjoner. På grunn av forekomsten av bovin spongiform encefalopati (BSE) i besetninger over hele verden, er det betydelig regulatorisk bekymring angående bruk av FBS som cellekulturtilskudd på grunn av risikoen for å introdusere xenogent materiale i celleterapikulturer10.

Vanligvis oppnås spredning av fibroblast eller mesenkymale stamceller (MSC) ved bruk av FBS-supplert vekstmedium. Mens FBS har vært en tilstrekkelig næringstilførsel for cellekultur, utgjør det ytterligere hindringer i tillegg til risikoen for zoonoseforurensning. For det første presenterer FBS-produkter enorme produksjonskostnader sammenlignet med humane blodavledede produkter, delvis på grunn av reduserte spredningsrater og en utvidet kulturutvidelsesperiode9. For det andre er FBS en kilde til xenoproteiner som interagerer med de isolerte cellene, og øker dermed risikoen for immunreaksjon på grunn av utseendet av antistoffer mot overflateproteinkomplekser på transplanterte celler10.

For å løse de potensielle ulempene med FBS som næringsstoff for klinisk ekspansjon av celler, har humane blodavledede produkter blitt introdusert som alternativer. Noen studier har foreslått å erstatte FBS i kulturmedier med autologt humant serum for celleutvidelse, men siden celleproliferasjon er langsom, krever det fortsatt lang kulturtid (3 uker) og flere cellepasseringer før transplantasjon17,18.

Andre grupper har brukt blodplatelysat (PL), en cellefri supernatant rik på vekstfaktorer som frigjøres fra blodplater etter frysetining av blodplatekonsentratene. Den største fordelen med PL sammenlignet med PRP er dens frosne lagringspotensial. Derfor kan det samme partiet brukes til påfølgende cellekulturapplikasjoner. Videre, som et hylleprodukt, kan det standardiseres ved å analysere vekstfaktorinnholdet og andre biologiske egenskaper før bruk. Noen ulemper er at det er allogent, og batcher er samlet fra flere givere. Siden PL ikke inneholder levende blodplater, som kan produsere cytokiner og vekstfaktorer i opptil 10 dager, må dyrkningsmedier som inneholder PL skiftes hver 3. dag (i stedet for 7-10 dager når dyrkning suppleres med PRP)19. Å utvide cellene in vitro i sin egen kilde til vekstfaktorer og næringsstoffer fra dette PRP-preparatet er absolutt fordelaktig. Preparatet er fri for eventuelle xenogene kosttilskudd i cellekulturen som kan forårsake avvisning, allergi eller overføring av smittsomme sykdommer.

I tidligere studier er det vist at autolog PRP kan brukes som et trygt, effektivt og kostnadseffektivt dyrkningsmedium for adipose-avledet mesenkymal stamcelleproliferasjon (ADSC)20. Media levert med 20% autolog PRP økte celleproliferasjonen opptil 13 ganger uten å endre cellefenotypen. I klinikker anses PRP å ha kraftig foryngelses- og regenereringskapasitet.

For tiden er PRP oppnådd fra pasientens blod allerede brukt effektivt i klinisk setting for sårheling alene21 eller i kombinasjon med hyaluronsyre 22,23 eller benregenerering 24,25; eller hudforyngelse alene26 eller i kombinasjon med fettderiverte stromale vaskulære fraksjonsceller27,28,29. Dette førte til undersøkelsen av å bruke pasientens egen PRP for å fremme utvidelse av autologe fibroblaster.

For dette formålet, og for å sikre reproduserbarhet av resultatene oppnådd med PRP-preparatet, utviklet vi en spesiell PRP-enhet. Dette lukkede systemet tillater standardisering av PRP-preparatene, noe som er en forutsetning for å minimere svingninger fra pasientens donor (angående blodplatekonsentrasjon og operatøravhengige variasjoner). Blodcelletall fra 10 pasienter viste at protokollen er sterkt reproduserbar (figur 2). Videre ble det vist at PRP hadde sterke effekter som en spredningsbooster, opptil 7,7 ganger sammenlignet med FBS (figur 3B). Dette er viktig for å redusere kostnadene og tiden som kreves for utvidelsesprosessen. I en nylig studie analyserte vi videre hvordan PRP påvirker fibroblastproliferasjon og differensiering. 20% PRP viste den beste effekten uten å påvirke cellefenotypen eller genotype14.

En begrensning ved metoden er at PRP-preparatet må fremstilles med heparin for å hindre koagulasjonsdannelse. Selv om standard plasma antikoagulant (en natriumsitrat antikoagulant og kalsium chelator) brukes i denne enheten, kan fibrin blodpropp dannelse oppstå når plasma er tilsatt til kultur media som inneholder kalsium30. Heparin i tillegg til PRP-preparatet forhindrer denne fibrinkoagulasjonsdannelsen. Imidlertid kan hepariner binde vekstfaktorer og kan forstyrre cellevekst30. For eksempel ble heparin vist å påvirke dermal fibroblastproliferasjon31 negativt. Imidlertid var konsentrasjonene som ble brukt 4 ganger mer konsentrert sammenlignet med konsentrasjonen som ble brukt i denne studien (2 E/ml).

Videre er kommersielt heparin hovedsakelig renset fra svinekilder; Derfor, på grunn av sin animalske opprinnelse, representerer den en begrensning i utviklingen av helt xenofritt medium. Selv om heparin hos svin er godkjent for behandling hos mennesker, er overfølsomhet overfor molekylet rapportert32. En annen begrensning er at PRP må brukes som et ferskt biologisk tilskudd og ikke kan fryses. Når det gjelder halveringstiden til blodplatene, er det tidligere vist at etter 10 dager er halvparten av blodplatene som er tilstede i PRP fortsatt levedyktige33. Av denne grunn holdes PRP ved romtemperatur og brukes i 10 dager. Videre, for fremtidige celleterapier som krever produksjon av massive antall celler, er hovedbegrensningen den totale mengden blod som kan trekkes ut av pasienten.

Oppsummert viser denne protokollen at erstatning av FBS med PRP resulterer i en rask utvidelse av fibroblaster. Blodplatene som er tilstede i PRP frigjør sakte en orkestrert blanding av vekstfaktorer i kulturfasen av ekspansjon. Den presenterte enheten brukes under en standardisert prosedyre som reduserer kompleksiteten og praktisk tid under forberedelsen av PRP. Dette systemet anses derfor som en passende metode når en rask og sikker ex vivo-ekspansjon er nødvendig for autologe celleterapiapplikasjoner under GMP-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette prosjektet er finansiert av Regen Lab SA. Sarah Berndt er prosjektleder for celleterapi for Regen Lab og ansatt i Regen Lab SA. Antoine Turzi er administrerende direktør i RegenLab.

Acknowledgments

Vi takker Grégory Schneiter for teknisk assistanse med flowcytometridata; Professor Muriel Cuendet (Laboratorium for farmakognosi, School of Pharmaceutical Sciences, og Universitetet i Genève) for å tillate bruk av Attune flow cytometer og Cytation 3 high-throughput mikroskop; Professor Brigitte Pittet for vitenskapelige råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

Retraksjon utgave 168 blodplaterikt plasma PRP fibroblaster celleproliferasjon cellemigrasjon sårtilheling cellekultur celleterapi
Produksjon av autologt blodplaterikt plasma for å øke ekspansjon av human fibroblast in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter