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Bioengineering

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Abstract

Atualmente, há grande interesse clínico no uso de fibroblastos autólogos para reparação cutânea. Na maioria dos casos, a cultura de células da pele in vitro é necessária. No entanto, a cultura celular usando meios de cultura xenogênicos ou alogênicos tem algumas desvantagens (i.e., risco de transmissão de agentes infecciosos ou expansão celular lenta). Aqui, um sistema de cultura autóloga é desenvolvido para a expansão de células de fibroblastos da pele humana in vitro usando o plasma rico em plaquetas (PRP) do próprio paciente. Os fibroblastos dérmicos humanos são isolados do paciente durante a abdominoplastia. As culturas são acompanhadas por até 7 dias usando um meio suplementado com soro fetal bovino (SFB) ou PRP. O conteúdo de células sanguíneas em preparações de PRP, proliferação e diferenciação de fibroblastos são avaliados. Este protocolo descreve o método para obter uma preparação padronizada e não ativada de PRP usando um dispositivo médico dedicado. A preparação requer apenas um dispositivo médico (CuteCell-PRP) e centrífuga. Este dispositivo é adequado sob condições de prática médica suficientes e é um sistema fechado de uma etapa, apirogênico e estéril que requer uma centrifugação única e suave de rotação de 1.500 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, os componentes sanguíneos são separados e o plasma rico em plaquetas é facilmente coletado. Este dispositivo permite uma preparação rápida, consistente e padronizada de PRP que pode ser usado como um suplemento de cultura celular para expansão in vitro de células humanas. O PRP obtido aqui contém uma concentração plaquetária de 1,5 vezes em comparação com o sangue total em conjunto, com uma remoção preferencial de glóbulos vermelhos e brancos. Demonstrou-se que o PRP apresenta um efeito potencializador na proliferação celular em comparação com a SFB (7,7x) e que os fibroblastos são ativados no tratamento com PRP.

Introduction

A medicina regenerativa visa curar ou substituir tecidos e órgãos danificados pela idade, doença ou trauma, bem como corrigir defeitos congênitos. Na terapia autóloga, células ou tecidos são retirados de um paciente, expandidos ou modificados e, em seguida, reintroduzidos no doador. Essa forma terapêutica tem amplo potencial no campo da dermatologia1. Na terapia autóloga de fibroblastos, os fibroblastos de um paciente são cultivados e reinjetados para tratar rugas, rítides ou cicatrizes de acne. Como os fibroblastos são as principais células funcionais da derme, a injeção de fibroblastos autólogos pode ser mais benéfica do que outras terapias no rejuvenescimentofacial2.

Na pele, os fibroblastos são responsáveis pela síntese e secreção de proteínas extracelulares (colágeno, elastina, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos). Eles também liberam fatores de crescimento que regulam a função celular, migração e interações célula-matriz/célula-célula na homeostase normal da pele e cicatrização de feridas3. Os fibroblastos dérmicos já foram introduzidos como potencial terapia celular clínica para cicatrização de feridascutâneas4, regeneração tecidual5 ou preenchimentos dérmicos em procedimentos estéticos e de cirurgiaplástica6. Alguns estudos até sugerem que, no contexto da medicina regenerativa, os fibroblastos podem ser uma terapia celular mais prática e eficaz do que as células-tronco mesenquimais7.

Para obter um número suficiente de fibroblastos para aplicações clínicas, a expansão celular é geralmente obrigatória. A cultura de células ex vivo/in vitro requer meio basal suplementado com fatores de crescimento, proteínas e enzimas para apoiar a adesão e proliferação celular. O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento comum para meios de cultura celular, pois o sangue fetal 1) é rico em fatores de crescimento em comparação com o sangue adulto e 2) apresenta baixo conteúdo de anticorpos8. À medida que a terapia celular progride, há preocupações sobre a segurança das condições clássicas de cultura de células nas quais a SFB é adicionada ao meio de cultura. Além disso, há uma tendência de substituir a SFB por alternativas9. Vários substitutos de FBS têm mostrado resultados promissores10.

A alternativa de plasma rico em plaquetas (PRP) foi selecionada aqui, e desenvolvemos um dispositivo médico para produzir uma preparação padronizada de PRP, denominada CuteCell-PRP. O uso pretendido deste dispositivo é a preparação de PRP autólogo para ser usado como um suplemento de meio de cultura para expansão in vitro de células autólogas sob condições de GMP.

O PRP é definido como uma suspensão concentrada de plaquetas no plasma. Como existem inúmeros protocolos de preparação, que diferem em 1) a quantidade de sangue necessária, 2) os tipos de dispositivos usados e 3) o protocolo de centrifugação, as concentrações plaquetárias resultantes variam de um pouco acima a mais de 10x o valor basal do sangue. Além disso, as preparações de PRP contêm níveis variáveis de contaminação de glóbulos vermelhos e brancos. A terminologia "PRP" é, portanto, usada para descrever produtos que variam muito em sua composição biológica e potenciais efeitos terapêuticos.

Na maioria dos estudos, a substituição da SFB é obtida usando diferentes concentrações de PRP que é ativado (por trombina ou cálcio). Essa ativação artificial provoca uma liberação imediata e importante de fatores de crescimento plaquetário de 15 min até 24 h11. Portanto, acredita-se que a ativação plaquetária seja indesejável para aplicações em culturas celulares, nas quais a liberação lenta de fatores de crescimento a partir da degranulação plaquetária gradual é necessária.

A terapia com PRP envolve a preparação de plaquetas autólogas em plasma concentrado12. A concentração plaquetária ideal não é clara, e uma ampla gama de dispositivos comerciais está disponível para preparar o PRP13. Essa falta de padronização decorre da inconsistência entre os estudos e levou a uma caixa preta em relação à dosagem e ao momento da injeção. Este protocolo descreve um procedimento para obtenção de PRP autólogo usando este dispositivo de PRP dedicado para expandir fibroblastos da pele em um modelo de cultura ex vivo 100% autóloga.

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Protocol

O protocolo do estudo seguiu a Declaração de Helsinque, e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de participarem do estudo. As amostras de pele são obtidas de mulheres saudáveis submetidas à abdominoplastia no Departamento de Cirurgia Plástica, Reconstrutiva e Estética dos Hospitais Universitários de Genebra (Genebra, Suíça). O procedimento está em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética institucional local (protocolo #3126).

1. Elaboração do PRP

NOTA: Os tubos CuteCell-PRP (Tabela de Materiais) são projetados para a rápida preparação de PRP a partir de um pequeno volume de sangue do paciente em um sistema de circuito fechado.

  1. Coleta de sangue total
    OBS: Colher sangue autólogo de uma veia periférica do braço utilizando agulha borboleta conectada diretamente ao tubo de PRP, conforme protocolo de coleta do instituto médico. O sangue pode ser retirado diretamente através da cânula venosa se o paciente estiver sob anestesia.
    1. Abra a embalagem blister do tubo. Realizar a punção venosa e preencher o número desejado de tubos de PRP com sangue total. O vácuo dentro dos tubos permitirá a coleta automática do volume necessário de sangue (~10 mL).
    2. Vire cuidadosamente os tubos de cabeça para baixo várias vezes para misturar o sangue com anticoagulante.
    3. Dentro de um gabinete de biossegurança (classe 2), remova 100 μL de sangue total usando uma seringa de 1 mL para contagens adicionais do número de células sanguíneas.
  2. Centrifugação
    NOTA: Certifique-se de que a centrífuga está correctamente equilibrada antes de a iniciar.
    1. Uma vez que o sangue é coletado nos tubos de PRP, se necessário, prepare um tubo de contrapeso (fornecido separadamente) com água no mesmo nível que o sangue no tubo de PRP. Coloque os tubos cheios na centrífuga opostos uns aos outros, garantindo que a máquina esteja equilibrada.
    2. Centrifugar amostras a 1.500 x g por 5 min.
      NOTA: Defina a velocidade de rotação correspondente de acordo com as instruções do fabricante da centrífuga. Após a centrifugação, o sangue será fracionado. Os glóbulos vermelhos e brancos ficam presos sob o gel, e as plaquetas se depositam na superfície do gel (Figura 1).
  3. Inverter suavemente o tubo de PRP 20x para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático.
    NOTA: Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel. O plasma deve mudar de claro e transparente para turvo. Se houver agregados plaquetários, eles devem ser coletados com o plasma.
  4. Para coletar o PRP, retire a solução de plasma do tubo usando um dispositivo de transferência de seringa conectado a uma seringa de 10 mL.
    OBS: Cerca de 5 mL de PRP serão obtidos de cada tubo. A solução de PRP está agora pronta para misturar na preparação final do meio. A solução pode ser mantida à temperatura ambiente (RT) sob o gabinete de segurança até as etapas futuras envolvendo analisador hematológico e uso.
  5. Antes de usar o PRP, determinar a concentração plaquetária, o volume plaquetário médio e o número de hemácias e leucócitos usando um analisador hematológico automatizado (Tabela de material). Para isso, retire cuidadosamente 100 μL da solução e transfira para um tubo de 1,5 mL.
    NOTA: PRP é usado como um suplemento de cultura autóloga em uma concentração entre 5-20% v/v. A concentração ótima de PRP precisa ser determinada para cada linhagem celular. Para prevenir a formação de coágulos de fibrina, o meio de cultura final deve ser suplementado com 2 U/mL de heparina.

2. Isolamento de fibroblastos autólogos e cultura em meio suplementado com SFB ou PRP

  1. Lavar as amostras de pele em solução salina tamponada com fosfato (PBS) agitando suavemente em um tubo de polipropileno de 50 mL.
  2. Se a amostra de pele for relativamente grande (>10 cm 2), coloque a amostra na tampa de uma placa de cultura de tecidos de 150 cm2 (lado epidérmico para baixo). Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS.
    NOTA: Use placa de cultura de tecido menor para amostras menores.
  3. Quando o corte de gordura estiver completo, corte o tecido em tiras de aproximadamente 0,5 cm x 1,5 cm usando um bisturi estéril.
  4. Adicionar 5 mL de mistura colagenase-dispase (Tabela de Materiais; 14 unidades Wünsch/mL) a um tubo estéril de 15 mL.
  5. Transfira o tecido cortado para o tubo, garantindo que os pedaços de tecido estejam submersos na solução. Tampe o tubo com segurança.
  6. Colocar os tubos numa incubadora a 37 °C com agitação orbital durante 150 minutos. Após a incubação, coloque o tubo contendo o tecido no armário de biossegurança.
  7. Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 mm de cabeça para baixo no armário de biossegurança. Transfira a solução de tecido digerido para o fundo da placa de cultura de 100 mm, sem respingos. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de 1 mL ou pinça estéril para transferir os pedaços de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 mm.
  8. Com a tira da epiderme voltada para cima, separe a lâmina de epiderme intacta da derme usando dois pares de pinças. Segure a derme da tira de tecido com um par de pinças e a borda da epiderme com outro par de pinças. Descasque a derme e a epiderme em dois pedaços, mantendo os pedaços separados na mesma tampa. Tente realizar essa etapa rapidamente e repita a manipulação para cada pedaço de tecido.
  9. Transfira as peças dérmicas para uma nova placa de cultura de 100 mm contendo PBS.
  10. Com pinça de laboratório, colocar as peças dérmicas em tubo de polipropileno de 15 mL com 3 mL de tripsina/PBS a 0,3%. Incubar durante 10-20 minutos em banho-maria a 37 °C e inverter o tubo várias vezes a cada 2-3 minutos.
  11. Para interromper a reação enzimática, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo gelado (meio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] ou RPMI contendo 10% de FBS). Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes. Filtrar a suspensão de fibroblastos através de uma tela de náilon de 85 μm (colocada sobre o topo de um tubo de 50 mL) para remover detritos dérmicos.
  12. Centrifugar durante 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100−1.000 μL de meio de crescimento completo.
  13. Usando azul de tripano (fator de diluição de x2) misturado com a suspensão celular, conte o número de células totais e viáveis preenchendo a câmara do hemocitômetro.
    NOTA: A viabilidade celular depende das condições utilizadas para a digestão enzimática. Para aumentar a recuperação celular e a viabilidade celular, a amostra de pele pode ser cortada em pedaços menores.
  14. Placa 3−10 x 104 células em 5 mL de meio de cultura completo de SFB (DMEM, 10% de FBS inativado termicamente por 60 min a 56 °C, solução tampão 1% M HEPES, mistura de aminoácidos não essenciais 1% 100x, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% 100x piruvato de sódio) em um frasco de cultura de tecidos25 cm2 . Incubar a 37 °C.
    NOTA: Os fibroblastos viáveis fixam-se ao frasco dentro de 24 h e começam a exibir a forma fusiforme em 2-3 dias.
  15. No dia 2, aspirar o meio contendo células não aderentes e adicionar meio fresco.
    NOTA: Como as células mortas no meio de cultura afetam o crescimento de fibroblastos viáveis, as células mortas não aderentes devem ser removidas da cultura.
  16. Troque o meio a cada 3−4 dias até que a cultura atinja 70−80% de confluência.
  17. Para colher fibroblastos, lavar com PBS e incubar com solução de tripsina/EDTA por 3 min a 37 °C na incubadora.
  18. Para parar a reação, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo morno (DMEM ou RPMI contendo 10% de FBS). Tome uma alíquota da suspensão celular para contar as células com o hemocitômetro. Centrifugar a suspensão por 5 min a 200 x g e retirar o meio por aspiração.
  19. Cultura do fibroblasto em meio PRP (DMEM, PRP 20%, tampão HEPES 1% 1M, mistura de aminoácidos não essenciais 100x 1%, L-glutamina 100x, penicilina/estreptomicina 100x, piruvato de sódio 100x 1%, heparina 2U/mL) na incubadora a 37 °C.
    NOTA: A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis/cm2.
  20. Para avaliar os efeitos do PRP sobre a proliferação fibroblástica, foram utilizados fibroblastos de sementes (passagem 2) em placas de 24 poços a uma densidade de 8 x 103 células por poço em meio de PRP com diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) e com 2 U/mL de heparina ou em condições clássicas de meio de cultura (10% SFB). Após 7 dias de cultivo, adicionar um corante vital (violeta de proliferação celular) às células e avaliar a proliferação por citometria de fluxo.
  21. Para estudar rearranjos citoesqueléticos, as células de sementes em 96 placas de fundo plano bem preto/claro a uma concentração de 1 x 105 células/mL em DMEM de crescimento completo de FBS (ver etapa 2.14) suplementadas com 0,5% de FBS por 24 horas. Tratar as células com SFB a 10% ou diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) por 7 dias.
    1. Fixar os fibroblastos com paraformaldeído a 4% por 10 min e permeabilizar com Triton X-100 a 0,1% por 5 min na RT. Manchar os fibroblastos com 50 mL de faloidina 5 U/mL, lavar 2x com PBS e marcar com 50 mL de 1 mg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) foi usado para visualizar a coloração de faloidina.

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Representative Results

Esta tecnologia patenteada é um dispositivo médico simples, rápido e reprodutível usado para produzir preparações padronizadas de PRP. É um sistema de uma etapa, totalmente fechado, que permite a preparação do PRP a partir do sangue total venoso após 5 min de centrifugação a 1.500 x g (devido à tecnologia de gel separador). O PRP obtido após a centrifugação é eliminado dos glóbulos vermelhos e brancos, que ficam abaixo do gel. Após várias inversões tubárias, as plaquetas que estão em cima do gel são ressuspensas no plasma, e o PRP está pronto para uso (Figura 1).

Para avaliar a reprodutibilidade do conteúdo de células sanguíneas na preparação, amostras de sangue total e PRP foram analisadas de 10 pacientes diferentes com um analisador hematológico. Após o processamento do sangue total com o dispositivo, a maioria das hemácias (hemácias) e leucócitos (leucócitos) foram removidas. A concentração plaquetária média apresentou aumento de 1,5 vezes em relação à concentração fisiológica encontrada no sangue total (Figura 2).

Na configuração de cultura autóloga, os fibroblastos isolados de um paciente foram cultivados na presença de concentrações crescentes de PRP (1−50%), em comparação com a condição clássica de meio de cultura (SFB a 10%). Após 7 dias de cultura sem troca dos meios, as culturas submetidas a priming com PRP a 20% exibiram maior número de fibroblastos viáveis (Figura 3A,B; 7,7x maior em relação à condição controle). A coloração pela faloidina evidenciou que a alteração morfológica observada na ativação do PRP estava relacionada à reorganização da F-actina, que é uma assinatura da ativação fibroblástica (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Preparação do PRP autólogo para ser utilizado como meio de cultura complementar para expansão in vitro de células autólogas em condições de GMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Contagem de células sanguíneas e plaquetas. O PRP preparado com o dispositivo comercial apresenta conteúdo de células sanguíneas altamente reprodutível, apesar das variações interdoadores. PLT: plaquetas (x 105); Leucócitos: glóbulos brancos (x 103); Hemácias: hemácias (x10 6), n = 10 pacientes. Esse valor foi modificado a partir de Berndt et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação dos efeitos proliferativos do PRP na cultura autóloga de fibroblastos. (A) Imagens microscópicas representativas de campo claro demonstrando os efeitos potencializadores do meio PRP a 20% adicionado aos fibroblastos isolados do mesmo paciente após 7 dias de cultura. Barra de escala = 100 μm. (B) Avaliação do efeito proliferativo do PRP por citometria de fluxo utilizando corante vital. Efeitos proliferativos do aumento das concentrações de PRP em comparação (1−50%) com FBS a 10% (n = 10 pacientes) sobre fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) por 7 dias sem alteração do meio em um sistema autólogo completo (células e PRP do mesmo paciente; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Esse valor foi modificado a partir de Berndt et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Visualização do citoesqueleto pela coloração com F-actina. Após 7 dias de crescimento em PRP a 20% (painel direito), os fibroblastos são ativados e reorganizam seu citoesqueleto em relação às condições de cultura controle com SFB a 10% (painel esquerdo). Barra de escala = 200 μm. Esse valor foi modificado a partir de Berndt et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As vantagens do uso de fibroblastos autólogos como uma alternativa natural em comparação com outros materiais de preenchimento na terapia celular de feridas incluem boa biocompatibilidade, efeitos colaterais mínimos e facilidade de coleta e uso. No entanto, antes de usar essas terapêuticas em um ambiente clínico diário, estudos pré-clínicos adequados são necessários para identificar as características de crescimento e avaliar a função biológica e a segurança dos fibroblastos isolados antes e após o transplante. Assim, logo após o processo de isolamento, a expansão in vitro das células deve ser realizada rapidamente a fim de limitar o número de divisões celulares. As condições de cultura devem ser rigorosamente controladas para garantir a segurança e eficácia do produto biológico autólogo final.

Em estudos pré-clínicos publicados, as células nas passagens 3−4 têm sido tipicamente escolhidas para serem injetadas, pois são mais adequadas em termos de quantidade celular e atividade proliferativa/secretora15. A maioria das pesquisas pré-clínicas tem sido realizada com meios de cultura nos quais a SFB é fonte de nutrientes e fatores de crescimento16. No entanto, Este suplemento de crescimento xenogênico apresenta um possível risco de infecção e reações imunológicas. Devido à ocorrência de encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em rebanhos em todo o mundo, existe uma considerável preocupação regulatória em relação ao uso de SFB como suplemento de cultura celular, devido ao risco de introdução de material xenogênico em culturas de terapia celular10.

Geralmente, a proliferação de fibroblastos ou células-tronco mesenquimais (CTM) é obtida usando meios de crescimento suplementados com FBS. Embora a SFB tenha sido um suprimento adequado de nutrientes para cultura celular, ela apresenta obstáculos adicionais além do risco de contaminação por zoonoses. Em primeiro lugar, os produtos FBS apresentam um custo de fabricação enorme em comparação com os produtos derivados do sangue humano, em parte devido às taxas reduzidas de proliferação e a um período prolongado de expansão da cultura9. Em segundo lugar, a SFB é uma fonte de xenoproteínas que interagem com as células isoladas, aumentando o risco de reação imune devido ao aparecimento de anticorpos contra complexos proteicos de superfície nas células transplantadas10.

Para abordar as potenciais desvantagens da FBS como nutriente para a expansão clínica das células, produtos derivados do sangue humano foram introduzidos como alternativas. Alguns estudos propuseram a substituição da SFB em meios de cultura por soro humano autólogo para expansão celular, mas como a proliferação celular é lenta, ainda requer um longo tempo de cultura (3 semanas) e várias passagens celulares antes do transplante17,18.

Outros grupos utilizaram o lisado plaquetário (PL), um sobrenadante livre de células rico em fatores de crescimento que são liberados das plaquetas após a ruptura do congelamento-descongelamento dos concentrados plaquetários. A principal vantagem do PL em relação ao PRP é o seu potencial de armazenamento congelado. Portanto, o mesmo lote pode ser usado para aplicações consecutivas de cultura celular. Além disso, como um produto de prateleira, pode ser padronizado analisando o teor de fator de crescimento e outras características biológicas antes do uso. Algumas desvantagens são que ele é alogênico, e lotes são agrupados de vários doadores. Além disso, como o PL não contém plaquetas vivas, que podem produzir citocinas e fatores de crescimento por até 10 dias, os meios de cultura contendo PL devem ser trocados a cada 3 dias (em vez de 7 a 10 dias quando a cultura é suplementada com PRP)19. Expandir as células in vitro em sua própria fonte de fatores de crescimento e nutrientes fornecidos por esta preparação de PRP é certamente vantajoso. A preparação é livre de quaisquer suplementos xenogênicos na cultura de células que possam causar rejeição, alergia ou transmissão de doenças infecciosas.

Em estudos anteriores, foi demonstrado que o PRP autólogo pode ser usado como meio de cultura seguro, eficiente e custo-efetivo para a proliferação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSC)20. Os meios fornecidos com PRP autólogo a 20% aumentaram a proliferação celular em até 13 vezes, sem alterar o fenótipo celular. Nas clínicas, o PRP é considerado como tendo poderosas capacidades de rejuvenescimento e regeneração.

Atualmente, o PRP obtido do sangue do paciente já é utilizado de forma eficiente no cenário clínico para cicatrização de feridas isoladamente 21 ou em combinação com ácido hialurônico 22,23 ou regeneração óssea 24,25; ou rejuvenescimento da pele isoladamente26 ou em combinação com células da fração vascular estromais derivadas do tecido adiposo27,28,29. Isso motivou a investigação do uso do PRP do próprio paciente para promover expansão de fibroblastos autólogos.

Para isso, e para garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos com a preparação do PRP, foi desenvolvido um dispositivo especial de PRP. Esse sistema fechado permite a padronização das preparações do PRP, pré-requisito para minimizar as flutuações do doador do paciente (quanto à concentração plaquetária e variações operador-dependentes). A contagem de células sanguíneas obtida de 10 pacientes mostrou que o protocolo é altamente reprodutível (Figura 2). Além disso, foi demonstrado que o PRP teve efeitos potentes como impulsionador da proliferação, até 7,7 vezes em comparação com o SFB (Figura 3B). Isso é importante para reduzir os custos e o tempo necessários para o processo de expansão. Em um estudo recente, analisamos ainda como o PRP afeta a proliferação e diferenciação fibroblástica. O PRP a 20% apresentou a melhor eficácia sem afetar o fenótipo celular ou genótipo14.

Uma limitação do método é que o meio contendo PRP deve ser preparado com heparina para prevenir a formação de coágulos. Embora o anticoagulante plasmático padrão (um anticoagulante de citrato de sódio e quelante de cálcio) seja usado nesse dispositivo, a formação de coágulos de fibrina pode ocorrer quando o plasma é adicionado ao meio de cultura que contém cálcio30. A heparina, além da preparação do PRP, previne a formação desse coágulo de fibrina. No entanto, as heparinas podem se ligar a fatores de crescimento e interferir no crescimento celular30. Por exemplo, demonstrou-se que a heparina afeta negativamente a proliferação fibroblástica dérmica31. No entanto, as concentrações utilizadas foram 4x mais concentradas em relação à concentração utilizada neste estudo (2 U/mL).

Além disso, a heparina comercial é purificada principalmente de fontes suínas; portanto, devido à sua origem animal, representa uma limitação no desenvolvimento de meio completamente livre de xeno. Embora a heparina suína tenha sido aprovada para terapia humana, a hipersensibilidade à molécula tem sido relatada32. Outra limitação é que o PRP deve ser usado como suplemento biológico fresco e não pode ser congelado. Em relação à meia-vida das plaquetas, já foi demonstrado que, após 10 dias, metade das plaquetas presentes no PRP ainda são viáveis33. Por esse motivo, o PRP é mantido em temperatura ambiente e utilizado por 10 dias. Além disso, para futuras terapias celulares que exigem a produção de um grande número de células, a principal limitação é a quantidade total de sangue que pode ser retirada do paciente.

Em resumo, esse protocolo demonstra que a substituição da SFB pelo PRP resulta em rápida expansão dos fibroblastos. As plaquetas presentes no PRP liberam lentamente uma mistura orquestrada de fatores de crescimento durante a fase de cultura de expansão. O dispositivo apresentado é utilizado durante um procedimento padronizado que reduz a complexidade e o tempo de hands-on durante a elaboração do PRP. Este sistema é considerado um método apropriado quando uma expansão ex vivo rápida e segura é necessária para aplicações de terapia celular autóloga em condições de GMP.

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Disclosures

Este projeto foi financiado pela Regen Lab SA. Sarah Berndt é gerente de projeto chefe de terapia celular do Regen Lab e trabalha no Regen Lab SA. Antoine Turzi é o CEO da RegenLab.

Acknowledgments

Agradecemos ao senhor deputado Grégory Schneiter pela assistência técnica com os dados da citometria de fluxo; a professora Muriel Cuendet (Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e da Universidade de Genebra) por permitir o uso do citômetro de fluxo Attune e do microscópio de alto rendimento Cytation 3; Professora Brigitte Pittet pelos pareceres científicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos
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Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

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