Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produktion af autologt blodpladerigt plasma til at øge in vitro human fibroblastekspansion

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Denne protokol præsenterer en enhed, der producerer PRP for at øge in vitro-udvidelsen af celler i et 100% autologt fibroblastkultursystem.

Abstract

Der er i øjeblikket stor klinisk interesse for brugen af autologe fibroblaster til hudreparation. I de fleste tilfælde kræves dyrkning af hudceller in vitro. Imidlertid har cellekultur, der bruger xenogene eller allogene kulturmedier, nogle ulemper (dvs. risiko for infektiøs agenstransmission eller langsom celleudvidelse). Her udvikles et autologt dyrkningssystem til udvidelse af humane hudfibroblastceller in vitro ved hjælp af patientens eget blodpladerige plasma (PRP). Human dermal fibroblaster isoleres fra patienten, mens de gennemgår abdominalplastik. Kulturer følges i op til 7 dage ved hjælp af et medium suppleret med enten føtalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodcelleindhold i PRP-præparater, proliferation og fibroblastdifferentiering vurderes. Denne protokol beskriver metoden til opnåelse af et standardiseret, ikke-aktiveret præparat af PRP ved hjælp af et dedikeret medicinsk udstyr. Præparatet kræver kun medicinsk udstyr (CuteCell-PRP) og centrifuge. Denne enhed er velegnet under tilstrækkelige medicinske praksisforhold og er et et-trins, apyrogent og sterilt lukket system, der kræver en enkelt, blød centrifugering på 1.500 x g i 5 minutter. Efter centrifugering adskilles blodkomponenterne, og det blodpladerige plasma opsamles let. Denne enhed muliggør en hurtig, konsistent og standardiseret forberedelse af PRP, der kan bruges som et cellekulturtilskud til in vitro-ekspansion af humane celler. PRP opnået her indeholder en 1,5 gange blodpladekoncentration sammenlignet med fuldblod sammen med en præferencefjernelse af røde og hvide blodlegemer. Det er vist, at PRP har en boostende effekt i celleproliferation sammenlignet med FBS (7,7x), og at fibroblaster aktiveres ved PRP-behandling.

Introduction

Regenerativ medicin sigter mod at helbrede eller erstatte væv og organer, der er beskadiget af alder, sygdom eller traumer samt korrigere medfødte defekter. Ved autolog terapi trækkes celler eller væv ud af en patient, udvides eller modificeres og genindføres derefter til donoren. Denne form for terapi har et bredt potentiale inden for dermatologi1. I autolog fibroblastbehandling dyrkes en patients fibroblaster og injiceres igen til behandling af rynker, rimtider eller acne ar. Da fibroblaster er de vigtigste funktionelle celler i dermis, kan injektion af autologe fibroblaster være mere gavnlig end andre terapier i ansigtsforyngelse2.

I huden er fibroblaster ansvarlige for syntese og sekretion af ekstracellulære proteiner (dvs. kollagen, elastin, hyaluronsyre og glycosaminoglycaner). De frigiver også vækstfaktorer, der regulerer cellefunktion, migration og celle-matrix / celle-celle-interaktioner i normal hudhomeostase og sårheling3. Dermale fibroblaster er allerede blevet introduceret som en potentiel klinisk celleterapi til hudsårheling4, vævsregenerering5 eller dermale fyldstoffer i æstetiske og plastikkirurgiske procedurer6. Nogle undersøgelser tyder endda på, at fibroblaster i forbindelse med regenerativ medicin kan være en mere praktisk og effektiv celleterapi end mesenkymale stamceller7.

For at opnå et tilstrækkeligt antal fibroblaster til kliniske anvendelser er celleudvidelse normalt obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellekultur kræver basalmedium suppleret med vækstfaktorer, proteiner og enzymer for at understøtte celleadhæsion og proliferation. Føtalt bovint serum (FBS) er et almindeligt supplement til cellekulturmedier, fordi føtalt blod 1) er rig på vækstfaktorer sammenlignet med voksent blod og 2) præsenterer et lavt antistofindhold8. Efterhånden som celleterapi skrider frem, er der bekymringer om sikkerheden ved klassiske cellekulturforhold, hvor FBS tilsættes til kulturmediet. Desuden er der nu en tendens til at erstatte FBS med alternativer9. Flere FBS-erstatninger har vist lovende resultater10.

Det blodpladerige plasma (PRP) alternativ er valgt her, og vi har udviklet et medicinsk udstyr til at producere et standardiseret præparat af PRP, kaldet CuteCell-PRP. Den tilsigtede anvendelse af dette udstyr er fremstilling af autolog PRP, der skal anvendes som et kulturmedietilskud til in vitro-ekspansion af autologe celler under GMP-betingelser.

PRP defineres som en koncentreret trombocytsuspension i plasma. Fordi der er adskillige forberedelsesprotokoller, som adskiller sig i 1) den nødvendige mængde blod, 2) anvendte typer enheder og 3) centrifugeringsprotokol, varierer de resulterende blodpladekoncentrationer fra lidt over til mere end 10x blodbaselineværdien. Derudover indeholder PRP-præparater variable niveauer af forurening af røde og hvide blodlegemer. Terminologien "PRP" bruges således til at beskrive produkter, der varierer meget i deres biologiske sammensætning og potentielle terapeutiske virkninger.

I de fleste undersøgelser opnås FBS-substitution ved anvendelse af forskellige koncentrationer af PRP, der aktiveres (af thrombin eller calcium). Denne kunstige aktivering fremkalder en øjeblikkelig og vigtig frigivelse af blodpladevækstfaktorer fra 15 min op til 24 timer11. Derfor menes det, at trombocytaktivering er uønsket til anvendelser i cellekulturer, hvor langsom frigivelse af vækstfaktorer fra gradvis blodpladedegranulering er påkrævet.

PRP-terapi involverer fremstilling af autologe blodplader i koncentreret plasma12. Den optimale blodpladekoncentration er uklar, og der findes en bred vifte af kommercielle enheder til fremstilling af PRP13. Denne mangel på standardisering skyldes inkonsekvens mellem undersøgelser og har ført til en sort boks med hensyn til dosering og tidspunkt for injektion. Denne protokol beskriver en procedure til opnåelse af autolog PRP ved hjælp af denne dedikerede PRP-enhed til at udvide hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo-kulturmodel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelsesprotokollen var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen, og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke, før de deltog i undersøgelsen. Hudprøver opnås fra raske kvinder, der gennemgår abdominalplastik i afdelingen for plastisk, rekonstruktiv og æstetisk kirurgi på Genève universitetshospitaler (Genève, Schweiz). Proceduren er i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen og blev godkendt af den lokale institutionelle etiske komité (protokol #3126).

1. Udarbejdelse af PRP

BEMÆRK: CuteCell-PRP-rørene (materialetabellen) er designet til hurtig forberedelse af PRP fra et lille volumen af patientens blod i et lukket kredsløbssystem.

  1. Indsamling af fuldblod
    BEMÆRK: Høst autologt blod fra en perifer vene i armen ved hjælp af en sommerfuglnål, der er direkte forbundet med PRP-røret, i henhold til lægeinstituttets indsamlingsprotokol. Blod kan trækkes direkte tilbage gennem venøs kanyle, hvis patienten er under anæstesi.
    1. Åbn blisterpakningen med tuben. Udfør den venøse punktering og fyld det ønskede antal PRP-rør med fuldblod. Vakuummet i rørene muliggør automatisk opsamling af det nødvendige volumen blod (~ 10 ml).
    2. Vend forsigtigt rørene på hovedet flere gange for at blande blodet med antikoagulant.
    3. Inde i et biosikkerhedsskab (klasse 2) fjernes 100 μL totalt fuldblod ved hjælp af en 1 ml sprøjte til yderligere antal blodlegemer.
  2. Centrifugering
    BEMÆRK: Sørg for, at centrifugen er korrekt afbalanceret, før du starter den.
    1. Når blodet er opsamlet i PRP-rørene, skal du om nødvendigt forberede et modvægtsrør (leveres separat) med vand til samme niveau som blodet i PRP-røret. Placer de fyldte rør i centrifugen modsat hinanden, og sørg for, at maskinen er afbalanceret.
    2. Centrifugeringsprøver ved 1.500 x g i 5 min.
      BEMÆRK: Indstil den tilsvarende omdrejningstalshastighed i henhold til centrifugeproducentens anvisninger. Efter centrifugering bliver blodet fraktioneret. De røde og hvide blodlegemer fanges under gelen, og blodplader sætter sig på overfladen af gelen (figur 1).
  3. PRP-røret vendes forsigtigt 20x på hovedet for at resuspendere trombocytaflejringen i plasmasupernatanten.
    BEMÆRK: Sørg for, at blodpladerne er helt løsrevet fra gelen. Plasmaet skal skifte fra klart og gennemsigtigt til uklart. Hvis blodpladeaggregater er til stede, skal de opsamles med plasmaet.
  4. For at opsamle PRP skal du tage plasmaopløsningen fra tuben ved hjælp af en sprøjteoverførselsanordning, der er tilsluttet en 10 ml sprøjte.
    BEMÆRK: Der opnås ca. 5 ml PRP fra hvert rør. PRP-opløsningen er nu klar til at blande det endelige mediumpræparat i. Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur (RT) under sikkerhedsskabet indtil de fremtidige trin, der involverer hæmatologisk analysator og brug.
  5. Før du bruger PRP, bestemmes blodpladekoncentrationen, det gennemsnitlige blodpladevolumen og antallet af røde og hvide blodlegemer ved hjælp af en automatiseret hæmatologisk analysator (materialetabel). For at gøre dette skal du forsigtigt trække 100 μL af opløsningen ud og overføre den til et 1,5 ml rør.
    BEMÆRK: PRP anvendes som et autologt kulturtilskud i en koncentration mellem 5-20% v/v. Den optimale koncentration af PRP skal bestemmes for hver cellelinje. For at forhindre dannelse af fibrinkoagulationer bør det endelige kulturmedie suppleres med 2 E/ml heparin.

2. Isolering af autologe fibroblaster og kultur i FBS- eller PRP-supplerede medier

  1. Vask hudprøver i fosfatbufret saltvand (PBS) ved forsigtigt at ryste i et 50 ml polypropylenrør.
  2. Hvis hudprøven er forholdsvis stor (>10 cm 2), anbringes prøven på låget af en 150 cm2 vævskulturskål (epidermal side nedad). Fjern det subkutane fedtvæv ved hjælp af et par tang og saks. For at forhindre vævet i at tørre ud, skylles vævet hvert par minutter i PBS.
    BEMÆRK: Brug mindre vævskulturskål til mindre prøver.
  3. Når fedttrimningen er færdig, skæres vævet i strimler på ca. 0,5 cm x 1,5 cm ved hjælp af en steril skalpel.
  4. Tilsæt 5 ml collagenase-dispase mix (Tabel over materialer; 14 Wünsch enheder / ml) til et sterilt 15 ml rør.
  5. Overfør det afskårne væv til røret, og sørg for, at vævsstykkerne er nedsænket i opløsningen. Sæt røret sikkert på hylden.
  6. Rørene anbringes i en inkubator ved 37 °C med orbitalomrystning i 150 minutter. Efter inkubation anbringes røret indeholdende vævet i biosikkerhedsskabet.
  7. Placer låget på en steril 100 mm kulturskål på hovedet i biosikkerhedsskabet. Overfør den fordøjede vævsopløsning til bunden af 100 mm kulturskålen uden stænk. Hvis der er stykker væv tilbage i røret, skal du bruge en steril 1 ml pipette eller steril pincet til at overføre vævsstykkerne til bunden af 100 mm kulturskålen.
  8. Med epidermisstrimlen opad adskilles det intakte epidermisark fra dermis ved hjælp af to par tang. Hold dermis af vævsstrimlen med et par tang og kanten af epidermis med et andet par tang. Skræl dermis og epidermis fra hinanden i to stykker, og hold de adskilte stykker på samme låg. Prøv at udføre dette trin hurtigt og gentag manipulationen for hvert stykke væv.
  9. Dermale stykker overføres til en ny 100 mm kulturskål indeholdende PBS.
  10. Brug laboratoriepincet til at placere de dermale stykker i et 15 ml polypropylenrør med 3 ml 0,3% trypsin / PBS. Inkuber i 10-20 min i et 37 °C vandbad og vend røret flere gange hver 2-3 min.
  11. For at stoppe den enzymatiske reaktion tilsættes 3-5 ml iskold komplet vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagle medium [DMEM] eller RPMI indeholdende 10% FBS). Vortex røret kraftigt flere gange. Filtrer fibroblastsuspensionen gennem et 85 μm nylonnet (placeret over toppen af et 50 ml rør) for at fjerne dermalt snavs.
  12. Der centrifugeres i 10 minutter ved 150 x g ved 4 °C. Supernatanten suges op, og pelletpen opslæmmes igen i 100-1.000 μL komplet vækstmedium.
  13. Ved hjælp af trypanblåt (fortyndingsfaktor på x2) blandet med cellesuspensionen tælles antallet af samlede og levedygtige celler ved at fylde hæmocytometerets kammer.
    BEMÆRK: Cellelevedygtighed afhænger af de betingelser, der anvendes til enzymatisk fordøjelse. For at øge cellegendannelse og cellelevedygtighed kan hudprøven skæres i mindre stykker.
  14. Plade 3-10 x 104 celler i 5 ml komplet FBS-vækstmedium (DMEM, 10% FBS varmeinaktiveret i 60 minutter ved 56 °C, 1% 1 M HEPES-bufferopløsning, 1% 100x ikke-essentiel aminosyreblanding, 1% 100x L-glutamin, 1% 100x penicillin/streptomycin, 1% 100x natriumpyruvat) i en 25 cm2 vævskulturkolbe. Der inkuberes ved 37 °C.
    BEMÆRK: Levedygtige fibroblaster fastgøres til kolben inden for 24 timer og begynder at udvise spindelformen på 2-3 dage.
  15. På dag 2 aspireres mediet, der indeholder ikke-klæbende celler, og tilsættes frisk medium.
    BEMÆRK: Da døde celler i dyrkningsmediet påvirker væksten af levedygtige fibroblaster, skal ikke-klæbende, døde celler fjernes fra kulturen.
  16. Skift mediet hver 3-4 dage, indtil kulturen når 70-80% sammenløb.
  17. For at høste fibroblaster vaskes med PBS og inkuberes med trypsin/EDTA-opløsning i 3 minutter ved 37 °C i inkubatoren.
  18. For at stoppe reaktionen tilsættes 3-5 ml varmt komplet vækstmedium (DMEM eller RPMI indeholdende 10% FBS). Der udtages en prøve af cellesuspensionen for at tælle cellerne med hæmocytometeret. Centrifuger suspensionen i 5 minutter ved 200 x g og fjern substratet ved aspiration.
  19. Fibroblasten dyrkes i PRP-medium (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M HEPES-bufferopløsning, 1% 100x ikke-essentiel aminosyreblanding, 1% 100x L-glutamin, 1% 100x penicillin/streptomycin, 1% 100x natriumpyruvat, 2 E/ml heparin) i inkubatoren ved 37 °C.
    BEMÆRK: Den anbefalede mindste celletæthed er 4.000 levedygtige celler / cm2.
  20. For at vurdere PRP-effekter på fibroblastproliferation, frøfibroblaster (passage 2) i 24 brøndplader med en densitet på 8 x 103 celler pr. hul i PRP-medium med forskellige PRP-koncentrationer (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% og 50%) og med 2 U / ml heparin eller under klassiske dyrkningsmediumbetingelser (10% FBS). Efter 7 dages dyrkning tilsættes et vitalt farvestof (celleproliferation violet) til celler og vurderer proliferation ved flowcytometri.
  21. For at studere cytoskeletale omlejringer, frøceller i 96 brønd sorte/klare fladbundede plader i en koncentration på 1 x 10 5 celler/ml i komplet FBS vækst DMEM (se trin 2.14) suppleret med0,5 % FBS i 24 timer. Behandl celler med 10% FBS eller forskellige PRP-koncentrationer (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% og 50%) i 7 dage.
    1. Fastgør fibroblasterne med 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabiliser med 0,1% Triton X-100 i 5 minutter ved RT. Plet fibroblasterne med 50 ml 5 U / ml phalloidin, vask 2x med PBS og marker med 50 ml 1 mg / ml 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter. Cytation 3 cellebilleddannelse multimode læser (BioTek) blev brugt til at visualisere phalloidin farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne patenterede teknologi er et enkelt, hurtigt og reproducerbart medicinsk udstyr, der bruges til at fremstille standardiserede PRP-præparater. Det er et et-trins, helt lukket system, der tillader fremstilling af PRP fra venøst fuldblod efter 5 minutters centrifugering ved 1.500 x g (på grund af separeringsgelteknologien). PRP opnået efter centrifugering ryddes fra røde og hvide blodlegemer, som sidder under gelen. Efter flere rørinversioner resuspenderes blodpladerne, der er oven på gelen, i plasmaet, og PRP er klar til brug (figur 1).

For at vurdere reproducerbarheden af blodcelleindholdet i præparatet blev fuldblods- og PRP-prøver analyseret fra 10 forskellige patienter med en hæmatologisk analysator. Efter behandling af fuldblod med apparatet blev størstedelen af de røde blodlegemer (RBC'er) og hvide blodlegemer (WBC'er) fjernet. Den gennemsnitlige trombocytkoncentration viste en 1,5 gange stigning sammenlignet med den fysiologiske koncentration, der findes i fuldblod (figur 2).

I den autologe kulturopsætning blev en patients isolerede fibroblaster dyrket i nærvær af stigende PRP-koncentrationer (1-50%) sammenlignet med den klassiske dyrkningsmediumtilstand (10% FBS). Efter 7 dages dyrkning uden at skifte medie udviste kulturerne primet med 20% PRP et højere antal levedygtige fibroblaster (figur 3A, B; 7,7 gange højere sammenlignet med kontroltilstanden). Phalloidinfarvning viste, at den morfologiske ændring, der blev observeret ved PRP-aktivering, var relateret til F-actin-reorganisering, som er en signatur af fibroblastaktivering (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Forberedelse af autolog PRP til anvendelse som kulturmedietilskud til in vitro-ekspansion af autologe celler under GMP-betingelser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Antal blodlegemer og blodplader. PRP fremstillet med det kommercielle udstyr viser et meget reproducerbart blodcelleindhold på trods af variationer mellem donorer. PLT: blodplader (x 105); WBC'er: hvide blodlegemer (x 103); RBC'er: røde blodlegemer (x 106), n = 10 patienter. Dette tal er ændret fra Berndt et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af PRP proliferative virkninger på autolog fibroblastkultur. (A) Repræsentative brightfield mikroskopiske billeder, der viser de boostende virkninger af 20% PRP-medium tilsat fibroblaster isoleret fra den samme patient efter 7 dages dyrkning. Skalastang = 100 μm. (B) Vurdering af PRP-proliferativ virkning ved flowcytometri ved anvendelse af vitalt farvestof. Proliferative virkninger af stigende PRP-koncentrationer sammenlignet (1-50%) med 10% FBS (n = 10 patienter) på normal human dermal fibroblast (NHDF) i 7 dage uden medium ændring i et komplet autologt system (celler og PRP fra samme patient; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Dette tal er ændret fra Berndt et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Cytoskeletvisualisering gennem F-actinfarvning. Efter 7 dage dyrket i 20% PRP (højre panel) aktiveres fibroblaster og omorganiserer deres cytoskelet sammenlignet med kontrolkulturbetingelser med 10% FBS (venstre panel). Skalabjælke = 200 μm. Dette tal er ændret fra Berndt et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene ved at bruge autologe fibroblaster som et naturligt alternativ sammenlignet med andre fyldmaterialer i sårcelleterapi omfatter god biokompatibilitet, minimale bivirkninger og lethed ved høst og brug. Før du bruger disse lægemidler i en daglig klinisk indstilling, er det imidlertid nødvendigt med ordentlige prækliniske undersøgelser for at identificere vækstfunktionerne og vurdere den biologiske funktion og sikkerhed af isolerede fibroblaster både før og efter transplantation. Direkte efter isolationsprocessen skal in vitro-udvidelse af cellerne således udføres hurtigt for at begrænse antallet af celledelinger. Dyrkningsbetingelserne skal kontrolleres nøje for at sikre det endelige autologe biologiske produkts sikkerhed og effektivitet.

I publicerede prækliniske studier er celler i passagerne 3-4 typisk valgt til at blive injiceret, da de er bedst egnede med hensyn til cellemængde og proliferativ/sekretorisk aktivitet15. Det meste prækliniske forskning er udført med kulturmedier, hvor FBS er kilden til næringsstoffer og vækstfaktorer16. Men, denne xenogene vækst supplement udgør en mulig risiko for infektion og immunologiske reaktioner. På grund af forekomsten af bovin spongiform encephalopati (BSE) i besætninger verden over er der betydelig lovgivningsmæssig bekymring med hensyn til brugen af FBS som cellekulturtilskud på grund af risikoen for at indføre xenogent materiale i celleterapikulturer10.

Normalt opnås proliferation af fibroblast eller mesenkymale stamceller (MSC) ved anvendelse af FBS-supplerede vækstmedier. Mens FBS har været en tilstrækkelig næringsstofforsyning til cellekultur, udgør det yderligere hindringer ud over risikoen for zoonoseforurening. For det første udgør FBS-produkter enorme produktionsomkostninger sammenlignet med produkter afledt af humant blod, delvis på grund af reducerede spredningshastigheder og en forlænget dyrkningsudvidelsesperiode9. For det andet er FBS en kilde til xenoproteiner, der interagerer med de isolerede celler og derved øger risikoen for immunreaktion på grund af udseendet af antistoffer mod overfladeproteinkomplekser på transplanterede celler10.

For at imødegå de potentielle ulemper ved FBS som næringsstof til klinisk udvidelse af celler er humane blodafledte produkter blevet introduceret som alternativer. Nogle undersøgelser har foreslået at erstatte FBS i kulturmedier med autologt humant serum til celleudvidelse, men da celleproliferation er langsom, kræver det stadig en lang dyrkningstid (3 uger) og flere cellepassager før transplantation17,18.

Andre grupper har brugt blodpladelysat (PL), en cellefri supernatant rig på vækstfaktorer, der frigives fra blodplader efter fryse-optøning af blodpladekoncentraterne. Den største fordel ved PL sammenlignet med PRP er dets frosne lagringspotentiale. Derfor kan det samme parti bruges til på hinanden følgende cellekulturapplikationer. Desuden kan det som et hyldeprodukt standardiseres ved at analysere vækstfaktorindholdet og andre biologiske egenskaber før brug. Nogle ulemper er, at det er allogent, og partier samles fra flere donorer. Da PL desuden ikke indeholder levende blodplader, som kan producere cytokiner og vækstfaktorer i op til 10 dage, skal dyrkningsmedier, der indeholder PL, udskiftes hver 3. dag (i stedet for 7-10 dage, når dyrkning suppleres med PRP)19. Udvidelse af cellerne in vitro i deres egen kilde til vækstfaktorer og næringsstoffer, der leveres af dette PRP-præparat, er bestemt fordelagtigt. Præparatet er fri for xenogene kosttilskud i cellekulturen, der kan forårsage afstødning, allergi eller overførsel af infektionssygdomme.

I tidligere undersøgelser er det blevet påvist, at autolog PRP kan anvendes som et sikkert, effektivt og omkostningseffektivt dyrkningsmedium til fedtafledt mesenkymal stamcelleproliferation (ADSC)20. Medier, der leveres med 20% autolog PRP, øgede celleproliferation op til 13 gange uden at ændre cellefænotypen. I klinikker anses PRP for at have kraftig foryngelses- og regenereringskapacitet.

I øjeblikket anvendes PRP opnået fra en patients blod allerede effektivt i den kliniske indstilling til sårheling alene21 eller i kombination med hyaluronsyre 22,23 eller knogleregenerering 24,25; eller hudforyngelse alene26 eller i kombination med fedtafledte stromale vaskulære fraktionsceller27,28,29. Dette førte til undersøgelsen af at bruge en patients egen PRP til at fremme ekspansion af autologe fibroblaster.

Til dette formål og for at sikre reproducerbarhed af de resultater, der blev opnået med PRP-præparatet, udviklede vi en speciel PRP-enhed. Dette lukkede system muliggør standardisering af PRP-præparaterne, hvilket er en forudsætning for at minimere udsving fra patientens donor (med hensyn til blodpladekoncentration og operatørafhængige variationer). Blodcelletællingerne fra 10 patienter viste, at protokollen er meget reproducerbar (figur 2). Desuden blev det vist, at PRP havde potente virkninger som en proliferationsbooster, op til 7,7 gange sammenlignet med FBS (figur 3B). Dette er vigtigt for at reducere omkostningerne og den tid, der kræves til udvidelsesprocessen. I en nylig undersøgelse analyserede vi yderligere, hvordan PRP påvirker fibroblastproliferation og differentiering. 20% PRP viste den bedste effekt uden at påvirke cellefænotypen eller genotype14.

En begrænsning af metoden er, at mediet indeholdende PRP skal fremstilles med heparin for at forhindre koagulationsdannelse. Selvom standard plasmaantikoagulant (et natriumcitratantikoagulant og calciumchelator) anvendes i denne enhed, kan dannelse af fibrinkoagulationer forekomme, når plasma tilsættes til kulturmedier, der indeholder calcium30. Heparin ud over PRP-præparatet forhindrer denne fibrinkoagulationsdannelse. Imidlertid kan hepariner binde vækstfaktorer og kan forstyrre cellevækst30. For eksempel viste heparin sig at påvirke dermal fibroblastproliferationnegativt 31. De anvendte koncentrationer var imidlertid 4 gange mere koncentrerede sammenlignet med den koncentration, der blev anvendt i denne undersøgelse (2 E/ml).

Desuden renses kommercielt heparin hovedsageligt fra svinekilder; Derfor repræsenterer det på grund af dets animalske oprindelse en begrænsning i udviklingen af fuldstændigt xenofrit medium. Selvom svineheparin er blevet godkendt til human terapi, er overfølsomhed over for molekylet blevet rapporteret32. En anden begrænsning er, at PRP skal bruges som et frisk biologisk supplement og ikke kan fryses. Med hensyn til halveringstiden for blodpladerne er det tidligere blevet påvist, at efter 10 dage er halvdelen af de blodplader, der er til stede i PRP, stadig levedygtige33. Af denne grund holdes PRP ved stuetemperatur og anvendes i 10 dage. For fremtidige celleterapier, der kræver produktion af et massivt antal celler, er den største begrænsning desuden den samlede mængde blod, der kan trækkes tilbage fra patienten.

Sammenfattende viser denne protokol, at udskiftning af FBS med PRP resulterer i en hurtig ekspansion af fibroblaster. De blodplader, der er til stede i PRP, frigiver langsomt en orkestreret blanding af vækstfaktorer i ekspansionsfasen af dyrkningen. Den præsenterede enhed anvendes under en standardiseret procedure, der reducerer kompleksiteten og den praktiske tid under forberedelsen af PRP. Dette system anses derfor for at være en passende metode, når der er behov for en hurtig og sikker ex vivo-udvidelse til autologe celleterapiapplikationer under GMP-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Projektet er finansieret af Regen Lab SA. Sarah Berndt er projektleder for celleterapi i Regen Lab og ansat i Regen Lab SA. Antoine Turzi er administrerende direktør for RegenLab.

Acknowledgments

Vi takker hr. Grégory Schneiter for den tekniske bistand med flowcytometridata. Professor Muriel Cuendet (Laboratory of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Sciences og University of Geneva) for at tillade brugen af Attune flowcytometeret og Cytation 3 high-throughput mikroskopet; Professor Brigitte Pittet for videnskabelig rådgivning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

Tilbagetrækning udgave 168 blodpladerig plasma PRP fibroblaster celleproliferation cellemigration sårheling cellekultur celleterapi
Produktion af autologt blodpladerigt plasma til at øge in vitro human fibroblastekspansion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter