Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produktion av autolog trombocytrik plasma för att öka in vitro human fibroblastexpansion

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Detta protokoll presenterar en enhet som producerar PRP för att öka in vitro-expansionen av celler i ett 100% autologt fibroblastodlingssystem.

Abstract

Det finns för närvarande ett stort kliniskt intresse för användning av autologa fibroblaster för hudreparation. I de flesta fall krävs odling av hudceller in vitro. Cellodling med xenogena eller allogena odlingsmedier har dock vissa nackdelar (dvs. risk för överföring av smittämnen eller långsam cellexpansion). Här utvecklas ett autologt odlingssystem för expansion av humana hudfibroblastceller in vitro med hjälp av patientens egen trombocytrika plasma (PRP). Humana dermala fibroblaster isoleras från patienten medan de genomgår bukplastik. Kulturer följs i upp till 7 dagar med hjälp av ett medium kompletterat med antingen fetalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodkroppsinnehåll i PRP-preparat, proliferation och fibroblastdifferentiering bedöms. Detta protokoll beskriver metoden för att erhålla en standardiserad, icke-aktiverad beredning av PRP med hjälp av en dedikerad medicinsk utrustning. Preparatet kräver endast en medicinsk anordning (CuteCell-PRP) och centrifug. Denna enhet är lämplig under tillräckliga medicinska förhållanden och är ett enstegs, apyrogent och sterilt slutet system som kräver en enstegs, mjuk centrifugering av 1 500 x g i 5 minuter. Efter centrifugering separeras blodkomponenterna och den blodplättrika plasman samlas lätt upp. Denna enhet möjliggör en snabb, konsekvent och standardiserad beredning av PRP som kan användas som ett cellodlingstillskott för in vitro-expansion av humana celler. Den PRP som erhålls här innehåller en 1,5-faldig trombocytkoncentration jämfört med helblod tillsammans, med ett företrädesvis avlägsnande av röda och vita blodkroppar. Det visas att PRP har en boostrande effekt i cellproliferation jämfört med FBS (7,7x) och att fibroblaster aktiveras vid PRP-behandling.

Introduction

Regenerativ medicin syftar till att läka eller ersätta vävnader och organ som skadats av ålder, sjukdom eller trauma samt korrigera medfödda defekter. Vid autolog behandling dras celler eller vävnad ut från en patient, expanderas eller modifieras och återinförs sedan till donatorn. Denna form av terapi har bred potential inom dermatologi1. Vid autolog fibroblastbehandling odlas en patients fibroblaster och injiceras igen för att behandla rynkor, rimtider eller akneärr. Eftersom fibroblaster är de viktigaste funktionella cellerna i dermis kan injektion av autologa fibroblaster vara mer fördelaktig än andra terapier vid ansiktsföryngring2.

I huden är fibroblaster ansvariga för syntes och utsöndring av extracellulära proteiner (dvs kollagen, elastin, hyaluronsyra och glykosaminoglykaner). De frisätter också tillväxtfaktorer som reglerar cellfunktion, migration och cell-matrix / cell-cellinteraktioner vid normal hudhomeostas och sårläkning3. Dermala fibroblaster har redan introducerats som en potentiell klinisk cellterapi för sårläkning4, vävnadsregenerering5 eller hudfyllmedel vid estetiska och plastikkirurgiska ingrepp6. Vissa studier tyder till och med på att fibroblaster i samband med regenerativ medicin kan vara en mer praktisk och effektiv cellterapi än mesenkymala stamceller7.

För att erhålla ett tillräckligt antal fibroblaster för kliniska tillämpningar är cellexpansion vanligtvis obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellodling kräver basalmedium kompletterat med tillväxtfaktorer, proteiner och enzymer för att stödja celladhesion och proliferation. Fetalt bovint serum (FBS) är ett vanligt tillskott för cellodlingsmedia, eftersom fosterblod 1) är rikt på tillväxtfaktorer jämfört med vuxenblod och 2) uppvisar ett lågt antikroppsinnehåll8. När cellterapi fortskrider finns det oro över säkerheten för klassiska cellodlingsförhållanden där FBS läggs till odlingsmediet. Dessutom finns det nu en tendens att ersätta FBS med alternativ9. Flera FBS-substitut har visat lovande resultat10.

Här har man valt alternativet med trombocytrik plasma (PRP) och vi har utvecklat en medicinteknisk produkt för att producera ett standardiserat preparat av PRP, kallat CuteCell-PRP. Den avsedda användningen av denna produkt är beredning av autolog PRP som ska användas som ett odlingsmedietillskott för in vitro-expansion av autologa celler under GMP-förhållanden.

PRP definieras som en koncentrerad trombocytsuspension i plasma. Eftersom det finns många beredningsprotokoll, som skiljer sig åt i 1) mängden blod som behövs, 2) typer av enheter som används och 3) centrifugeringsprotokoll, varierar de resulterande trombocytkoncentrationerna från något över till mer än 10x blodbaslinjevärdet. Dessutom innehåller PRP-preparat varierande nivåer av kontaminering av röda och vita blodkroppar. Terminologin "PRP" används således för att beskriva produkter som varierar mycket i sin biologiska sammansättning och potentiella terapeutiska effekter.

I de flesta studier uppnås FBS-substitution med olika koncentrationer av PRP som aktiveras (av trombin eller kalcium). Denna artificiella aktivering framkallar en omedelbar och viktig frisättning av trombocyttillväxtfaktorer från 15 min upp till 24 h11. Därför antas det att trombocytaktivering är oönskad för applikationer i cellkulturer, där långsam frisättning av tillväxtfaktorer från gradvis trombocytdegranulering krävs.

PRP-behandling innefattar beredning av autologa blodplättar i koncentrerad plasma12. Den optimala trombocytkoncentrationen är oklar och ett brett spektrum av kommersiella anordningar finns tillgängliga för att förbereda PRP13. Denna brist på standardisering beror på inkonsekvens mellan studier och har lett till en svart låda när det gäller dosering och tidpunkt för injektion. Detta protokoll beskriver en procedur för att erhålla autolog PRP med hjälp av denna dedikerade PRP-enhet för att expandera hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo-odlingsmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studieprotokollet följde Helsingforsdeklarationen och alla patienter gav skriftligt informerat samtycke innan de deltog i studien. Hudprover tas från friska kvinnor som genomgår bukplastik på avdelningen för plastik, rekonstruktiv och estetisk kirurgi vid Genèves universitetssjukhus (Genève, Schweiz). Förfarandet överensstämmer med principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av den lokala institutionella etiska kommittén (protokoll #3126).

1. Förberedelse av grundförutsättningar

OBS: CuteCell-PRP-rören (Table of Materials) är utformade för snabb beredning av PRP från en liten volym av patientens blod i ett slutet kretssystem.

  1. Samling av helblod
    OBS: Skörda autologt blod från en perifer ven i armen med hjälp av en fjärilnål direkt ansluten till PRP-röret, enligt medicinska institutets insamlingsprotokoll. Blod kan dras direkt genom venös kanyl om patienten är under anestesi.
    1. Öppna blisterförpackningen. Utför venös punktering och fyll önskat antal PRP-rör med helblod. Vakuumet i rören möjliggör automatisk insamling av den nödvändiga volymen blod (~ 10 ml).
    2. Vänd försiktigt rören upp och ner flera gånger för att blanda blodet med antikoagulant.
    3. Inuti ett biosäkerhetsskåp (klass 2), ta bort 100 μL totalt helblod med en 1 ml spruta för ytterligare antal blodkroppar.
  2. Centrifugering
    OBS: Se till att centrifugen är korrekt balanserad innan du startar den.
    1. När blodet har samlats in i PRP-rören, förbered vid behov ett motviktsrör (levereras separat) med vatten till samma nivå som blodet i PRP-röret. Placera de fyllda rören i centrifugen mittemot varandra och se till att maskinen är balanserad.
    2. Centrifugera proverna vid 1 500 x g i 5 minuter.
      OBS: Ställ in motsvarande varvtal enligt centrifugtillverkarens instruktioner. Efter centrifugering blir blodet fraktionerat. De röda och vita blodkropparna fångas under gelén och blodplättar sätter sig på gelens yta (figur 1).
  3. Vänd försiktigt upp och ned PRP-röret 20x för att återsuspendera trombocytavsättningen i plasmasupernatanten.
    OBS: Se till att blodplättarna är helt lossna från gelén. Plasman bör ändras från klar och transparent till grumlig. Om trombocytaggregat är närvarande bör de samlas in med plasma.
  4. För att samla PRP, ta plasmalösningen från röret med hjälp av en sprutöverföringsanordning ansluten till en 10 ml spruta.
    OBS: Cirka 5 ml PRP kommer att erhållas från varje rör. PRP-lösningen är nu klar att blandas i den slutliga medieberedningen. Lösningen kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under säkerhetsskåpet tills framtida steg involverar hematologianalysator och användning.
  5. Innan du använder PRP, bestäm trombocytkoncentrationen, genomsnittlig trombocytvolym och antal röda och vita blodkroppar med hjälp av en automatiserad hematologianalysator (materialtabell). För att göra detta, dra försiktigt upp 100 μl av lösningen och överför till ett 1,5 ml rör.
    OBS: PRP används som ett autologt kulturtillskott i en koncentration mellan 5-20% v / v. Den optimala koncentrationen av PRP måste bestämmas för varje cellinje. För att förhindra fibrinproppsbildning bör det slutliga odlingsmediet kompletteras med 2 E/ml heparin.

2. Isolering av autologa fibroblaster och odling i FBS- eller PRP-kompletterade medier

  1. Tvätta hudprover i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att försiktigt skaka i ett 50 ml polypropenrör.
  2. Om hudprovet är relativt stort (>10 cm 2), placera provet på locket på en 150 cm2 vävnadsodlingsskål (epidermal sida nedåt). Ta bort den subkutana fettvävnaden med hjälp av en pincett och sax. För att förhindra att vävnaden torkar ut, skölj vävnaden med några minuters mellanrum i PBS.
    OBS: Använd mindre vävnadsodlingsskål för mindre prover.
  3. När fetttrimningen är klar, skär vävnaden i cirka 0,5 cm x 1,5 cm remsor med en steril skalpell.
  4. Tillsätt 5 ml kollagenas-dispasblandning (materialförteckning; 14 Wünsch-enheter/ml) till ett sterilt 15 ml rör.
  5. Överför den skurna vävnaden till röret, se till att vävnadsbitarna är nedsänkta i lösningen. Täck röret ordentligt.
  6. Placera rören i en inkubator vid 37 °C med orbitalskakning i 150 minuter. Efter inkubation, placera röret som innehåller vävnaden i biosäkerhetsskåpet.
  7. Placera locket på en steril 100 mm odlingsskål upp och ner i biosäkerhetsskåpet. Överför den smälta vävnadslösningen till botten av 100 mm odlingsskålen utan stänk. Om några vävnadsbitar finns kvar i röret, använd en steril 1 ml pipett eller steril pincett för att överföra vävnadsbitarna till botten av 100 mm odlingsskålen.
  8. Med epidermisremsan uppåt, separera det intakta epidermisarket från dermis med hjälp av två par pincett. Håll dermis på vävnadsremsan med ett par pincett och kanten på epidermis med ett annat par pincett. Skala isär dermis och epidermis i två delar och håll de separerade bitarna på samma lock. Försök att utföra detta steg snabbt och upprepa manipuleringen för varje vävnad.
  9. Överför dermalbitarna till en ny 100 mm odlingsskål som innehåller PBS.
  10. Använd laboratorietång, placera dermala bitar i ett 15 ml polypropenrör med 3 ml 0,3% trypsin / PBS. Inkubera i 10-20 min i ett 37 °C vattenbad och vänd tuben flera gånger var 2-3 min.
  11. För att stoppa den enzymatiska reaktionen, tillsätt 3-5 ml iskallt komplett tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagle-medium [DMEM] eller RPMI innehållande 10% FBS). Vortex röret kraftigt flera gånger. Filtrera fibroblastsuspensionen genom ett 85 μm nylonnät (placerat över toppen av ett 50 ml rör) för att avlägsna dermalt skräp.
  12. Centrifugera i 10 min vid 150 x g vid 4 °C. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 100−1 000 μL komplett tillväxtmedium.
  13. Använd trypanblått (utspädningsfaktor x2) blandat med cellsuspensionen och räkna antalet totala och viabla celler genom att fylla hemocytometerns kammare.
    OBS: Cellviabiliteten beror på de förhållanden som används för enzymatisk nedbrytning. För att öka cellåterhämtningen och cellviabiliteten kan hudprovet skäras i mindre bitar.
  14. Platta 3-10 x 104 celler i 5 ml komplett FBS-tillväxtmedium (DMEM, 10% FBS värmeinaktiverad i 60 minuter vid 56 ° C, 1% 1 M HEPES-buffertlösning, 1% 100x icke-essentiell aminosyrablandning, 1% 100x L-glutamin, 1% 100x penicillin / streptomycin, 1% 100x natriumpyruvat) i en 25 cm2 vävnadsodlingskolv. Inkubera vid 37 °C.
    OBS: Livskraftiga fibroblaster fäster vid kolven inom 24 timmar och börjar uppvisa spindelformen inom 2–3 dagar.
  15. På dag 2, aspirera mediet som innehåller icke-vidhäftande celler och tillsätt nytt medium.
    OBS: Eftersom döda celler i odlingsmediet påverkar tillväxten av livskraftiga fibroblaster måste icke-vidhäftande, döda celler avlägsnas från kulturen.
  16. Byt mediet var 3-4: e dag tills kulturen når 70-80% sammanflöde.
  17. För att skörda fibroblaster, tvätta med PBS och inkubera med trypsin/EDTA-lösning i 3 minuter vid 37 °C i inkubatorn.
  18. För att stoppa reaktionen, tillsätt 3-5 ml varmt komplett tillväxtmedium (DMEM eller RPMI innehållande 10% FBS). Ta en alikvot av cellsuspensionen för att räkna cellerna med hemocytometern. Centrifugera suspensionen i 5 minuter vid 200 x g och avlägsna mediet genom aspiration.
  19. Odla fibroblasten i PRP-medium (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M HEPES-buffertlösning, 1% 100x icke-essentiell aminosyrablandning, 1% 100x L-glutamin, 1% 100x penicillin / streptomycin, 1% 100x natriumpyruvat, 2 U / ml heparin) i inkubatorn vid 37 ° C.
    OBS: Den minsta rekommenderade celldensiteten är 4 000 livskraftiga celler / cm2.
  20. För att bedöma PRP-effekter på fibroblastproliferation, fröfibroblaster (passage 2) i 24 brunnsplattor med en densitet av 8 x 103 celler per brunn i PRP-medium med olika PRP-koncentrationer (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% och 50%) och med 2 U / ml heparin eller under klassiska odlingsmediumförhållanden (10% FBS). Efter 7 dagars odling, tillsätt ett viktigt färgämne (cellproliferationsviolett) till celler och bedöma proliferationen genom flödescytometri.
  21. För att studera cytoskeletala omarrangemang, fröceller i 96 brunnssvarta/klara platta bottenplattor i en koncentration av 1 x 10 5 celler/ml i fullständig FBS-tillväxt DMEM (se steg 2.14) kompletterat med0,5 % FBS i 24 timmar. Behandla celler med 10% FBS eller olika PRP-koncentrationer (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% och 50%) i 7 dagar.
    1. Fixera fibroblasterna med 4% paraformaldehyd i 10 minuter och permeabilisera med 0,1% Triton X-100 i 5 minuter vid RT. Färga fibroblasterna med 50 ml 5 U / ml falloidin, tvätta 2x med PBS och markera med 50 ml 1 mg / ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 min. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) användes för att visualisera falloidinfärgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna patenterade teknik är en enkel, snabb och reproducerbar medicinsk anordning som används för att producera standardiserade PRP-preparat. Det är ett helt slutet system i ett steg som möjliggör beredning av PRP från venöst helblod efter 5 minuters centrifugering vid 1 500 x g (tack vare separeringsgeltekniken). PRP erhållen efter centrifugering rensas från röda och vita blodkroppar, som sitter under gelén. Efter flera rörinversioner återsuspenderas blodplättarna som ligger ovanpå gelén i plasma och PRP är redo att användas (figur 1).

För att bedöma reproducerbarheten av blodkroppsinnehållet i preparatet analyserades helblods- och PRP-prover från 10 olika patienter med en hematologianalysator. Efter bearbetning av helblod med enheten avlägsnades majoriteten av de röda blodkropparna (RBC) och vita blodkroppar (WBC). Den genomsnittliga trombocytkoncentrationen visade en 1,5-faldig ökning jämfört med den fysiologiska koncentrationen i helblodet (figur 2).

I den autologa odlingsuppsättningen odlades en patients isolerade fibroblaster i närvaro av ökande PRP-koncentrationer (1−50%), jämfört med det klassiska odlingsmedietillståndet (10% FBS). Efter 7 dagars kultur utan att ändra media uppvisade kulturerna grundade med 20% PRP ett högre antal livskraftiga fibroblaster (figur 3A, B; 7,7 gånger högre jämfört med kontrollförhållandet). Falloidinfärgning visade att den morfologiska förändringen som observerades vid PRP-aktivering var relaterad till F-aktinomorganisation, vilket är en signatur för fibroblastaktivering (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Beredning av autolog PRP för användning som odlingssubstrat för in vitro-expansion av autologa celler under GMP-betingelser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Antal blodkroppar och blodplättar. PRP framställd med den kommersiella enheten visar mycket reproducerbart blodkroppsinnehåll trots variationer mellan givare. PLT: trombocyter (x 105); WBC: vita blodkroppar (x 103); RBC: röda blodkroppar (x 106), n = 10 patienter. Denna siffra har modifierats från Berndt et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bedömning av PRP-proliferativa effekter på autolog fibroblastkultur. (A) Representativa ljusfältsmikroskopiska bilder som visar de förstärkande effekterna av 20% PRP-medium tillsatt till fibroblaster isolerade från samma patient efter 7 dagars odling. Skalstapel = 100 μm. (B) Bedömning av PRP-proliferativ effekt genom flödescytometri med användning av vitalt färgämne. Proliferativa effekter av ökande PRP-koncentrationer i jämförelse (1−50%) med 10% FBS (n = 10 patienter) på normal human dermal fibroblast (NHDF) i 7 dagar utan medelstor förändring i ett komplett autologt system (celler och PRP från samma patient; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Denna siffra har modifierats från Berndt et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Visualisering av cytoskelett genom färgning av F-aktin. Efter 7 dagar odlade i 20% PRP (höger panel) aktiveras fibroblaster och omorganiserar deras cytoskelett jämfört med kontrollodlingsförhållanden med 10% FBS (vänster panel). Skalstapel = 200 μm. Denna siffra har modifierats från Berndt et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fördelarna med att använda autologa fibroblaster som ett naturligt alternativ jämfört med andra fyllnadsmaterial i sårcellsterapi inkluderar god biokompatibilitet, minimala biverkningar och enkel skörd och användning. Innan dessa terapier används i en daglig klinisk miljö krävs dock lämpliga prekliniska studier för att identifiera tillväxtegenskaperna och bedöma den biologiska funktionen och säkerheten hos isolerade fibroblaster både före och efter transplantation. Således, direkt efter isoleringsprocessen, måste in vitro-expansion av cellerna utföras snabbt för att begränsa antalet celldelningar. Odlingsförhållandena måste kontrolleras noggrant för att säkerställa säkerheten och effekten hos den slutliga autologa biologiska produkten.

I publicerade prekliniska studier har celler vid passagerna 3−4 vanligtvis valts ut för injektion, eftersom de är mest lämpliga när det gäller cellkvantitet och proliferativ/sekretorisk aktivitet15. Mest preklinisk forskning har utförts med odlingsmedier där FBS är källan till näringsämnen och tillväxtfaktorer16. Emellertid, Detta xenogena tillväxttillskott utgör en möjlig risk för infektion och immunologiska reaktioner. På grund av förekomsten av bovin spongiform encefalopati (BSE) i besättningar över hela världen finns det betydande farhågor i lagstiftningen när det gäller användningen av FBS som ett cellodlingstillskott på grund av risken för att xenogent material förs in i cellterapikulturer10.

Vanligtvis uppnås proliferation av fibroblast- eller mesenkymala stamceller (MSC) med hjälp av FBS-kompletterade tillväxtmedier. Medan FBS har varit en tillräcklig näringstillförsel för cellodling, utgör den ytterligare hinder förutom risken för zoonoskontaminering. För det första medför FBS-produkter enorma tillverkningskostnader jämfört med produkter som härrör från blod från människa, delvis på grund av minskad spridning och en förlängd kulturexpansionsperiod9. För det andra är FBS en källa till xenoproteiner som interagerar med de isolerade cellerna, vilket ökar risken för immunreaktion på grund av utseendet av antikroppar mot ytproteinkomplex på transplanterade celler10.

För att ta itu med de potentiella nackdelarna med FBS som ett näringsämne för klinisk expansion av celler har humana blodbaserade produkter introducerats som alternativ. Vissa studier har föreslagit att ersätta FBS i odlingsmedia med autologt humant serum för cellexpansion, men eftersom cellproliferationen är långsam kräver det fortfarande en lång odlingstid (3 veckor) och flera cellpassager före transplantation17,18.

Andra grupper har använt trombocytlysat (PL), en cellfri supernatant rik på tillväxtfaktorer som frigörs från trombocyter efter frysupptining av trombocytkoncentraten. Den största fördelen med PL jämfört med PRP är dess frysta lagringspotential. Därför kan samma parti användas för på varandra följande cellodlingsapplikationer. Dessutom, som en hyllprodukt, kan den standardiseras genom att analysera tillväxtfaktorinnehållet och andra biologiska egenskaper före användning. Några nackdelar är att det är allogent, och satser samlas från flera givare. Eftersom PL inte innehåller några levande blodplättar, som kan producera cytokiner och tillväxtfaktorer i upp till 10 dagar, måste odlingsmedier som innehåller PL bytas var 3:e dag (i stället för 7–10 dagar när kulturen kompletteras med PRP)19. Att expandera cellerna in vitro i sin egen källa till tillväxtfaktorer och näringsämnen som tillhandahålls av detta PRP-preparat är verkligen fördelaktigt. Preparatet är fritt från xenogena tillskott i cellkulturen som kan orsaka avstötning, allergi eller överföring av infektionssjukdom.

I tidigare studier har det visats att autolog PRP kan användas som ett säkert, effektivt och kostnadseffektivt odlingsmedium för fett-härledd mesenkymal stamcellsproliferation (ADSC)20. Media levererade med 20% autolog PRP ökade cellproliferationen upp till 13 gånger utan att ändra cellfenotypen. I kliniker anses PRP ha kraftfull föryngrings- och regenereringskapacitet.

För närvarande används PRP erhållet från en patients blod redan effektivt i den kliniska miljön för sårläkning ensam21 eller i kombination med hyaluronsyra 22,23 eller benregenerering 24,25; eller enbart hudföryngring26 eller i kombination med fettbaserade stroma-kärlfraktionsceller27,28,29. Detta föranledde undersökningen av att använda en patients egen PRP för att främja expansion av autologa fibroblaster.

För detta ändamål, och för att säkerställa reproducerbarhet av de resultat som erhållits med PRP-preparatet, utvecklade vi en speciell PRP-enhet. Detta slutna system möjliggör standardisering av PRP-preparaten, vilket är en förutsättning för att minimera fluktuationer från patientens donator (avseende trombocytkoncentration och operatörsberoende variationer). Blodkroppsräkningen från 10 patienter visade att protokollet är mycket reproducerbart (figur 2). Dessutom visades att PRP hade potenta effekter som en spridningsbooster, upp till 7,7 gånger jämfört med FBS (figur 3B). Detta är viktigt för att minska kostnaderna och tiden som krävs för expansionsprocessen. I en nyligen genomförd studie analyserade vi vidare hur PRP påverkar fibroblastproliferation och differentiering. 20% PRP visade den bästa effekten utan att påverka cellfenotypen eller genotyp14.

En begränsning med metoden är att mediet innehållande PRP måste framställas med heparin för att förhindra proppsbildning. Även om standard plasma antikoagulant (en natriumcitrat antikoagulant och kalciumkelator) används i denna anordning, kan fibrinproppsbildning uppstå när plasma tillsätts till odlingsmedier som innehåller kalcium30. Heparin förutom PRP-preparatet förhindrar denna fibrinproppsbildning. Hepariner kan dock binda tillväxtfaktorer och kan störa celltillväxt30. Till exempel visade sig heparin negativt påverka dermal fibroblastproliferation31. De koncentrationer som användes var dock 4x mer koncentrerade jämfört med koncentrationen som användes i denna studie (2 E/ml).

Dessutom renas kommersiellt heparin huvudsakligen från svinkällor; På grund av sitt animaliska ursprung representerar det därför en begränsning i utvecklingen av helt xenofritt medium. Även om svinheparin har godkänts för human terapi har överkänslighet mot molekylen rapporterats32. En annan begränsning är att PRP måste användas som ett nytt biologiskt tillskott och inte kan frysas. När det gäller halveringstiden för trombocyterna har det tidigare visats att efter 10 dagar är hälften av trombocyterna i PRP fortfarande livskraftiga33. Av denna anledning hålls PRP vid rumstemperatur och används i 10 dagar. Dessutom, för framtida cellterapier som kräver produktion av ett stort antal celler, är huvudbegränsningen den totala mängden blod som kan tas ut från patienten.

Sammanfattningsvis visar detta protokoll att ersättning av FBS med PRP resulterar i en snabb expansion av fibroblaster. Trombocyterna som finns i PRP släpper långsamt en orkestrerad blandning av tillväxtfaktorer under kulturfasen av expansion. Den presenterade anordningen används under ett standardiserat förfarande som minskar komplexiteten och den praktiska tiden under beredningen av PRP. Detta system anses därför vara en lämplig metod när en snabb och säker ex vivo-expansion behövs för autologa cellterapiapplikationer under GMP-förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Detta projekt har finansierats av Regen Lab SA. Sarah Berndt är cellterapihuvudprojektledare för Regen Lab och är anställd av Regen Lab SA. Antoine Turzi är VD för RegenLab.

Acknowledgments

Vi tackar Grégory Schneiter för teknisk hjälp med flödescytometridata. Professor Muriel Cuendet (Laboratory of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Sciences och University of Geneva) för att tillåta användning av Attune-flödescytometern och Cytation 3-mikroskopet med hög genomströmning; Professor Brigitte Pittet för vetenskaplig rådgivning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
  2. Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).
  3. Stunova, A., Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).
  4. Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).
  5. Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).
  6. Weiss, R. A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).
  7. Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).
  8. Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).
  9. Karnieli, O., et al. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).
  10. van der Valk, J., et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  11. Cavallo, C., et al. Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules. BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).
  12. Peng, G. L. Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).
  13. Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).
  14. Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion. Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).
  15. Zeng, W., et al. Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation. Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).
  16. Lee, E. C. R., et al. Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study. Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).
  17. Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).
  18. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).
  19. Cowper, M., et al. Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
  20. Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).
  21. Martinez-Zapata, M. J., et al. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).
  22. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).
  23. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  24. Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation. The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).
  25. Saleem, M., et al. Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis. Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).
  26. Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects. Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).
  27. Fiaschetti, V., et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).
  28. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).
  29. Modarressi, A. Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes. World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).
  30. Muraglia, A., et al. Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).
  31. Ferrao, A. V., Mason, R. M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts. Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).
  32. Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. Hypersensitivity reactions to heparins. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).
  33. Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways. Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).

Tags

Retraktion utgåva 168 trombocytrik plasma PRP fibroblaster cellproliferation cellmigration sårläkning cellodling cellterapi
Produktion av autolog trombocytrik plasma för att öka in vitro human fibroblastexpansion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi,… More

Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter