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Bioengineering

Produzione di plasma autologo ricco di piastrine per aumentare l'espansione in vitro dei fibroblasti umani

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/60816
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

Questo protocollo presenta un dispositivo che produce PRP per aumentare l'espansione in vitro delle cellule in un sistema di coltura di fibroblasti autologhi al 100%.

Abstract

Attualmente c'è un grande interesse clinico nell'uso di fibroblasti autologhi per la riparazione della pelle. Nella maggior parte dei casi, è necessaria la coltura di cellule della pelle in vitro. Tuttavia, la coltura cellulare che utilizza terreni di coltura xenogenici o allogenici presenta alcuni svantaggi (ad esempio, rischio di trasmissione di agenti infettivi o lenta espansione cellulare). Qui, viene sviluppato un sistema di coltura autologo per l'espansione delle cellule di fibroblasti della pelle umana in vitro utilizzando il plasma ricco di piastrine (PRP) di un paziente. I fibroblasti dermici umani sono isolati dal paziente durante l'addominoplastica. Le colture vengono seguite per un massimo di 7 giorni utilizzando un terreno integrato con siero bovino fetale (FBS) o PRP. Viene valutato il contenuto delle cellule del sangue nelle preparazioni di PRP, la proliferazione e la differenziazione dei fibroblasti. Questo protocollo descrive il metodo per ottenere una preparazione standardizzata e non attivata di PRP utilizzando un dispositivo medico dedicato. La preparazione richiede solo un dispositivo medico (CuteCell-PRP) e una centrifuga. Questo dispositivo è adatto in condizioni di pratica medica sufficienti ed è un sistema chiuso monopassaggio, apirogeno e sterile che richiede una singola centrifugazione a rotazione morbida di 1.500 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, i componenti del sangue vengono separati e il plasma ricco di piastrine viene facilmente raccolto. Questo dispositivo consente una preparazione rapida, coerente e standardizzata del PRP che può essere utilizzato come integratore di coltura cellulare per l'espansione in vitro delle cellule umane. Il PRP qui ottenuto contiene una concentrazione piastrinica di 1,5 volte rispetto al sangue intero insieme, con una rimozione preferenziale dei globuli rossi e bianchi. È dimostrato che il PRP presenta un effetto potenziante nella proliferazione cellulare rispetto alla FBS (7,7x) e che i fibroblasti vengono attivati dopo il trattamento con PRP.

Introduction

La medicina rigenerativa mira a guarire o sostituire tessuti e organi danneggiati da età, malattie o traumi, nonché a correggere difetti congeniti. Nella terapia autologa, le cellule o i tessuti vengono prelevati da un paziente, espansi o modificati, quindi reintrodotti nel donatore. Questa forma di terapia ha un ampio potenziale nel campo della dermatologia1. Nella terapia con fibroblasti autologhi, i fibroblasti di un paziente vengono coltivati e reiniettati per trattare rughe, ritidi o cicatrici da acne. Poiché i fibroblasti sono le principali cellule funzionali nel derma, l'iniezione di fibroblasti autologhi può essere più vantaggiosa di altre terapie nel ringiovanimento del viso2.

Nella pelle, i fibroblasti sono responsabili della sintesi e della secrezione di proteine extracellulari (cioè collagene, elastina, acido ialuronico e glicosaminoglicani). Rilasciano anche fattori di crescita che regolano la funzione cellulare, la migrazione e le interazioni cellula-matrice / cellula-cellula nella normale omeostasi cutanea e nella guarigione delle ferite3. I fibroblasti dermici sono già stati introdotti come potenziale terapia cellulare clinica per la guarigione delle ferite cutanee4, la rigenerazione dei tessuti5 o i filler dermici nelle procedure di chirurgia estetica e plastica6. Alcuni studi suggeriscono addirittura che, nel contesto della medicina rigenerativa, i fibroblasti possono essere una terapia cellulare più pratica ed efficace rispetto alle cellule staminali mesenchimali7.

Per ottenere un numero sufficiente di fibroblasti per applicazioni cliniche, l'espansione cellulare è solitamente obbligatoria. La coltura cellulare ex vivo/in vitro richiede terreno basale integrato con fattori di crescita, proteine ed enzimi per supportare l'adesione e la proliferazione cellulare. Il siero bovino fetale (FBS) è un integratore comune per i terreni di coltura cellulare, perché il sangue fetale 1) è ricco di fattori di crescita rispetto al sangue adulto e 2) presenta un basso contenuto di anticorpi8. Con il progredire della terapia cellulare, ci sono preoccupazioni sulla sicurezza delle condizioni di coltura cellulare classica in cui FBS viene aggiunto al terreno di coltura. Inoltre, vi è ora una tendenza a sostituire FBS con alternative9. Diversi sostituti FBS hanno mostrato risultati promettenti10.

L'alternativa al plasma ricco di piastrine (PRP) è stata selezionata qui e abbiamo sviluppato un dispositivo medico per produrre una preparazione standardizzata di PRP, denominata CuteCell-PRP. L'uso previsto di questo dispositivo è la preparazione di PRP autologo da utilizzare come integratore di terreni di coltura per l'espansione in vitro di cellule autologhe in condizioni GMP.

Il PRP è definito come una sospensione piastrinica concentrata nel plasma. Poiché esistono numerosi protocolli di preparazione, che differiscono in 1) la quantità di sangue necessaria, 2) i tipi di dispositivi utilizzati e 3) il protocollo di centrifugazione, le concentrazioni piastriniche risultanti variano da leggermente superiore a oltre 10 volte il valore basale del sangue. Inoltre, i preparati di PRP contengono livelli variabili di contaminazione dei globuli rossi e bianchi. La terminologia "PRP" viene quindi utilizzata per descrivere prodotti che variano notevolmente nella loro composizione biologica e nei potenziali effetti terapeutici.

Nella maggior parte degli studi, la sostituzione FBS si ottiene utilizzando diverse concentrazioni di PRP che viene attivato (da trombina o calcio). Questa attivazione artificiale provoca un rilascio immediato e importante di fattori di crescita piastrinica da 15 min fino a 24 h11. Pertanto, si ritiene che l'attivazione piastrinica sia indesiderabile per le applicazioni in colture cellulari, in cui è richiesto il lento rilascio di fattori di crescita dalla graduale degranulazione piastrinica.

La terapia PRP prevede la preparazione di piastrine autologhe nel plasma concentrato12. La concentrazione piastrinica ottimale non è chiara e una vasta gamma di dispositivi commerciali sono disponibili per preparare PRP13. Questa mancanza di standardizzazione deriva dall'incoerenza tra gli studi e ha portato a una scatola nera per quanto riguarda il dosaggio e la tempistica dell'iniezione. Questo protocollo descrive una procedura per ottenere PRP autologo utilizzando questo dispositivo PRP dedicato per espandere i fibroblasti cutanei in un modello di coltura ex vivo autologo al 100%.

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Protocol

Il protocollo di studio era conforme alla Dichiarazione di Helsinki e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima di partecipare allo studio. I campioni di pelle sono ottenuti da donne sane sottoposte ad addominoplastica nel Dipartimento di Chirurgia Plastica, Ricostruttiva ed Estetica degli Ospedali Universitari di Ginevra (Ginevra, Svizzera). La procedura è conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stata approvata dal comitato etico istituzionale locale (protocollo #3126).

1. Preparazione del PRP

NOTA: I tubi CuteCell-PRP (Table of Materials) sono progettati per la rapida preparazione del PRP da un piccolo volume di sangue del paziente in un sistema a circuito chiuso.

  1. Raccolta di sangue intero
    NOTA: Prelevare sangue autologo da una vena periferica del braccio utilizzando un ago a farfalla direttamente collegato al tubo PRP, secondo il protocollo di raccolta dell'istituto medico. Il sangue può essere prelevato direttamente attraverso la cannula venosa se il paziente è sotto anestesia.
    1. Aprire il blister tubo. Eseguire la puntura venosa e riempire il numero desiderato di tubi PRP con sangue intero. Il vuoto all'interno delle provette consentirà la raccolta automatica del volume di sangue necessario (~ 10 ml).
    2. Capovolgere con attenzione i tubi più volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante.
    3. All'interno di un armadio di biosicurezza (classe 2), rimuovere 100 μL di sangue intero totale utilizzando una siringa da 1 mL per ulteriori conteggi del numero di cellule del sangue.
  2. Centrifugazione
    NOTA: Assicurarsi che la centrifuga sia bilanciata correttamente prima di avviarla.
    1. Una volta raccolto il sangue nelle provette PRP, se necessario, preparare un tubo controbilanciato (fornito separatamente) con acqua allo stesso livello del sangue nel tubo PRP. Posizionare i tubi riempiti nella centrifuga uno di fronte all'altro, assicurandosi che la macchina sia bilanciata.
    2. Centrifugare i campioni a 1.500 x g per 5 min.
      NOTA: Impostare la velocità di giri corrispondente in base alle istruzioni del produttore della centrifuga. Dopo la centrifugazione, il sangue diventerà frazionato. I globuli rossi e bianchi sono intrappolati sotto il gel e le piastrine si depositano sulla superficie del gel (Figura 1).
  3. Capovolgere delicatamente il tubo PRP 20x per risospendere il deposito piastrinico nel surnatante plasmatico.
    NOTA: Assicurarsi che le piastrine siano completamente staccate dal gel. Il plasma dovrebbe cambiare da chiaro e trasparente a torbido. Se sono presenti aggregati piastrinici, devono essere raccolti con il plasma.
  4. Per raccogliere il PRP, prelevare la soluzione al plasma dalla provetta utilizzando un dispositivo di trasferimento della siringa collegato a una siringa da 10 ml.
    NOTA: Da ogni provetta si otterranno circa 5 ml di PRP. La soluzione PRP è ora pronta per essere miscelata nella preparazione finale del mezzo. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente (RT) sotto l'armadio di sicurezza fino alle fasi future che coinvolgono l'analizzatore ematologico e l'uso.
  5. Prima di utilizzare il PRP, determinare la concentrazione piastrinica, il volume piastrinico medio e il numero di globuli rossi e bianchi utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato (tabella del materiale). Per fare ciò, prelevare con cautela 100 μL della soluzione e trasferirli in un tubo da 1,5 ml.
    NOTA: PRP è usato come integratore di coltura autologa ad una concentrazione compresa tra 5-20% v / v. La concentrazione ottimale di PRP deve essere determinata per ogni linea cellulare. Per prevenire la formazione di coaguli di fibrina, il terreno di coltura finale deve essere integrato con 2 U/mL di eparina.

2. Isolamento di fibroblasti autologhi e coltura in terreni integrati con FBS o PRP

  1. Lavare i campioni di pelle in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) agitando delicatamente in un tubo di polipropilene da 50 ml.
  2. Se il campione di pelle è relativamente grande (>10 cm 2), posizionare il campione sul coperchio di una capsula di coltura tissutale di 150 cm2 (lato epidermico verso il basso). Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo usando un paio di pinze e forbici. Per evitare che il tessuto si secchi, sciacquare il tessuto ogni pochi minuti in PBS.
    NOTA: Utilizzare un piatto di coltura tissutale più piccolo per campioni più piccoli.
  3. Quando il taglio del grasso è completo, tagliare il tessuto in strisce di circa 0,5 cm x 1,5 cm usando un bisturi sterile.
  4. Aggiungere 5 mL di miscela collagenasi-dispasi (Tabella dei materiali; 14 unità di Wünsch/ml) in un tubo sterile da 15 ml.
  5. Trasferire il tessuto tagliato nel tubo, assicurandosi che i pezzi di tessuto siano immersi nella soluzione. Tappare saldamente il tubo.
  6. Posizionare i tubi in un'incubatrice a 37 °C con agitazione orbitale per 150 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo contenente il tessuto nell'armadio di biosicurezza.
  7. Posizionare il coperchio di un piatto di coltura sterile da 100 mm capovolto nell'armadio di biosicurezza. Trasferire la soluzione di tessuto digerito sul fondo del piatto di coltura da 100 mm, senza schizzi. Se nel tubo rimangono pezzi di tessuto, utilizzare una pipetta sterile da 1 mL o una pinza sterile per trasferire i pezzi di tessuto sul fondo del piatto di coltura da 100 mm.
  8. Con la striscia dell'epidermide rivolta verso l'alto, separare il foglio dell'epidermide intatto dal derma usando due paia di pinze. Tenere il derma della striscia di tessuto con un paio di pinze e il bordo dell'epidermide con un altro paio di pinze. Staccare il derma e l'epidermide in due pezzi, mantenendo i pezzi separati sulla stessa palpebra. Prova a eseguire rapidamente questo passaggio e ripeti la manipolazione per ogni pezzo di tessuto.
  9. Trasferire i pezzi dermici in un nuovo piatto di coltura da 100 mm contenente PBS.
  10. Utilizzando una pinza da laboratorio, posizionare i pezzi dermici in un tubo di polipropilene da 15 ml con 3 ml di tripsina / PBS allo 0,3%. Incubare per 10-20 minuti a bagnomaria a 37 °C e capovolgere il tubo più volte ogni 2-3 minuti.
  11. Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 3-5 ml di terreno di coltura completo ghiacciato (terreno di coltura Eagle modificato di Dulbecco [DMEM] o RPMI contenente il 10% di FBS). Vortice il tubo vigorosamente più volte. Filtrare la sospensione di fibroblasti attraverso una rete di nylon da 85 μm (posizionata sopra la parte superiore di un tubo da 50 ml) per rimuovere i residui dermici.
  12. Centrifugare per 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100−1.000 μL di terreno di crescita completo.
  13. Utilizzando il blu di tripano (fattore di diluizione x2) miscelato con la sospensione cellulare, contare il numero di cellule totali e vitali riempiendo la camera dell'emocitometro.
    NOTA: La vitalità cellulare dipende dalle condizioni utilizzate per la digestione enzimatica. Per aumentare il recupero cellulare e la vitalità cellulare, il campione di pelle può essere tagliato in pezzi più piccoli.
  14. Piastra 3-10 x 104 cellule in 5 ml di terreno di coltura FBS completo (DMEM, 10% FBS inattivato termicamente per 60 minuti a 56 °C, 1% 1 M soluzione tampone HEPES, 1% 100x miscela di aminoacidi non essenziali, 1% 100x L-glutammina, 1% 100x penicillina/streptomicina, 1% 100x piruvato di sodio) in un matraccio di coltura tissutale 25 cm2 . Incubare a 37 °C.
    NOTA: I fibroblasti vitali si attaccheranno al pallone entro 24 ore e inizieranno a mostrare la forma del fuso in 2-3 giorni.
  15. Il giorno 2, aspirare il terreno contenente cellule non aderenti e aggiungere terreno fresco.
    NOTA: Poiché le cellule morte nel terreno di coltura influenzano la crescita dei fibroblasti vitali, le cellule morte non aderenti devono essere rimosse dalla coltura.
  16. Cambiare il terreno ogni 3-4 giorni fino a quando la coltura raggiunge il 70-80% di confluenza.
  17. Per raccogliere i fibroblasti, lavare con PBS e incubare con soluzione di tripsina/EDTA per 3 minuti a 37 °C nell'incubatore.
  18. Per interrompere la reazione, aggiungere 3-5 ml di terreno di coltura completo caldo (DMEM o RPMI contenente il 10% di FBS). Prendere un'aliquota della sospensione cellulare per contare le cellule con l'emocitometro. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 200 x g e rimuovere il fluido mediante aspirazione.
  19. Coltura del fibroblasto in terreno PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M soluzione tampone HEPES, 1% 100x miscela di aminoacidi non essenziali, 1% 100x L-glutammina, 1% 100x penicillina/streptomicina, 1% 100x piruvato di sodio, 2 U/mL eparina) nell'incubatore a 37 °C.
    NOTA: La densità minima di cella raccomandata è di 4.000 cellule vitali/cm2.
  20. Per valutare gli effetti del PRP sulla proliferazione dei fibroblasti, i fibroblasti del seme (passaggio 2) in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 8 x 103 cellule per pozzetto in mezzo PRP con diverse concentrazioni di PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) e con 2 U/mL di eparina o in condizioni di terreno di coltura classico (10% FBS). Dopo 7 giorni di coltura, aggiungere un colorante vitale (viola di proliferazione cellulare) alle cellule e valutare la proliferazione mediante citometria a flusso.
  21. Per studiare i riarrangiamenti citoscheletrici, le cellule seme in 96 piastre a fondo piatto nero / chiaro a una concentrazione di 1 x 10 5 cellule / ml in DMEM di crescita FBS completa (vedi fase 2.14) integrato con0,5 % FBS per 24 ore. Trattare le cellule con FBS al 10% o diverse concentrazioni di PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) per 7 giorni.
    1. Fissare i fibroblasti con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,1% per 5 minuti su RT. Colorare i fibroblasti con 50 ml di falloidina 5 U/mL, lavare 2x con PBS e marcare con 50 ml di 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti. Il lettore multimodale di imaging cellulare Cytation 3 (BioTek) è stato utilizzato per visualizzare la colorazione della falloidina.

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Representative Results

Questa tecnologia brevettata è un dispositivo medico semplice, veloce e riproducibile utilizzato per produrre preparati PRP standardizzati. Si tratta di un sistema monopassaggio, completamente chiuso che consente la preparazione di PRP da sangue venoso intero dopo 5 minuti di centrifugazione a 1.500 x g (grazie alla tecnologia del gel separatore). Il PRP ottenuto dopo la centrifugazione viene eliminato dai globuli rossi e bianchi, che si trovano sotto il gel. Dopo diverse inversioni del tubo, le piastrine che si trovano sopra il gel vengono risospese nel plasma e il PRP è pronto per l'uso (Figura 1).

Per valutare la riproducibilità del contenuto di cellule del sangue nella preparazione, sono stati analizzati campioni di sangue intero e PRP da 10 diversi pazienti con un analizzatore ematologico. Dopo l'elaborazione del sangue intero con il dispositivo, la maggior parte dei globuli rossi (RBC) e dei globuli bianchi (WBC) sono stati rimossi. La concentrazione piastrinica media ha mostrato un aumento di 1,5 volte rispetto alla concentrazione fisiologica trovata nel sangue intero (Figura 2).

Nel set-up di coltura autologa, i fibroblasti isolati di un paziente sono stati coltivati in presenza di concentrazioni crescenti di PRP (1-50%), rispetto alla condizione classica del terreno di coltura (10% FBS). Dopo 7 giorni di coltura senza cambiare il terreno, le colture innescate con il 20% di PRP hanno mostrato un numero maggiore di fibroblasti vitali (Figura 3A, B; 7,7 volte superiore rispetto alla condizione di controllo). La colorazione con falloidina ha evidenziato che il cambiamento morfologico osservato all'attivazione del PRP era correlato alla riorganizzazione della F-actina, che è una firma dell'attivazione dei fibroblasti (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Preparazione di PRP autologo da utilizzare come integratore di terreni di coltura per l'espansione in vitro di cellule autologhe in condizioni GMP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Conta delle cellule del sangue e delle piastrine. Il PRP preparato con il dispositivo commerciale mostra un contenuto di cellule del sangue altamente riproducibile nonostante le variazioni tra donatori. PLT: piastrine (x 105); WBCs: globuli bianchi (x 103); RBC: globuli rossi (x 106), n = 10 pazienti. Questa cifra è stata modificata da Berndt et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Valutazione degli effetti proliferativi del PRP sulla coltura autologa di fibroblasti. (A) Immagini microscopiche rappresentative in campo chiaro che dimostrano gli effetti di potenziamento del 20% di terreno PRP aggiunto ai fibroblasti isolati dallo stesso paziente dopo 7 giorni di coltura. Barra della scala = 100 μm. (B) Valutazione dell'effetto proliferativo del PRP mediante citometria a flusso mediante colorante vitale. Effetti proliferativi dell'aumento delle concentrazioni di PRP in confronto (1-50%) con FBS al 10% (n = 10 pazienti) sul fibroblasto dermico umano normale (NHDF) per 7 giorni senza variazione del mezzo in un sistema autologo completo (cellule e PRP dello stesso paziente; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Questa cifra è stata modificata da Berndt et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Visualizzazione del citoscheletro attraverso la colorazione F-actina. Dopo 7 giorni cresciuti in PRP al 20% (pannello di destra), i fibroblasti vengono attivati e riorganizzano il loro citoscheletro rispetto alle condizioni di coltura di controllo con il 10% di FBS (pannello di sinistra). Barra di scala = 200 μm. Questa cifra è stata modificata da Berndt et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

I vantaggi dell'utilizzo di fibroblasti autologhi come alternativa naturale rispetto ad altri materiali di riempimento nella terapia cellulare della ferita includono una buona biocompatibilità, effetti collaterali minimi e facilità di raccolta e utilizzo. Tuttavia, prima di utilizzare queste terapie in un contesto clinico quotidiano, sono necessari studi preclinici adeguati per identificare le caratteristiche di crescita e valutare la funzione biologica e la sicurezza dei fibroblasti isolati sia prima che dopo il trapianto. Pertanto, subito dopo il processo di isolamento, l'espansione in vitro delle cellule deve essere eseguita rapidamente per limitare il numero di divisioni cellulari. Le condizioni di coltura devono essere strettamente controllate per garantire la sicurezza e l'efficacia del prodotto biologico autologo finale.

Negli studi preclinici pubblicati, le cellule ai passaggi 3-4 sono state tipicamente scelte per essere iniettate, in quanto sono più adatte in termini di quantità cellulare e attività proliferativa / secretoria15. La maggior parte della ricerca preclinica è stata eseguita con terreni di coltura in cui FBS è la fonte di nutrienti e fattori di crescita16. Tuttavia, Questo integratore di crescita xenogenico presenta un possibile rischio di infezione e reazioni immunologiche. A causa dell'insorgenza dell'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) negli allevamenti di tutto il mondo, vi sono notevoli preoccupazioni normative per quanto riguarda l'uso di FBS come integratore di colture cellulari a causa del rischio di introdurre materiale xenogenico nelle colture di terapia cellulare10.

Di solito, la proliferazione dei fibroblasti o delle cellule staminali mesenchimali (MSC) si ottiene utilizzando terreni di crescita integrati con FBS. Mentre FBS è stato un adeguato apporto di nutrienti per la coltura cellulare, pone ulteriori ostacoli oltre al rischio di contaminazione da zoonosi. In primo luogo, i prodotti FBS presentano enormi costi di produzione rispetto ai prodotti derivati dal sangue umano, in parte a causa dei ridotti tassi di proliferazione e di un prolungato periodo di espansione della coltura9. In secondo luogo, FBS è una fonte di xenoproteine che interagiscono con le cellule isolate, aumentando così il rischio di reazione immunitaria a causa della comparsa di anticorpi contro complessi proteici di superficie sulle cellule trapiantate10.

Per affrontare i potenziali inconvenienti dell'FBS come nutriente per l'espansione clinica delle cellule, sono stati introdotti prodotti derivati dal sangue umano come alternative. Alcuni studi hanno proposto di sostituire FBS in terreni di coltura con siero umano autologo per l'espansione cellulare, ma poiché la proliferazione cellulare è lenta, richiede ancora un lungo tempo di coltura (3 settimane) e diversi passaggi cellulari prima del trapianto17,18.

Altri gruppi hanno utilizzato il lisato piastrinico (PL), un surnatante privo di cellule ricco di fattori di crescita che vengono rilasciati dalle piastrine dopo la rottura del congelamento dei concentrati piastrinici. Il principale vantaggio del PL rispetto al PRP è il suo potenziale di stoccaggio congelato. Pertanto, lo stesso lotto può essere utilizzato per applicazioni consecutive di coltura cellulare. Inoltre, come prodotto standard, può essere standardizzato analizzando il contenuto del fattore di crescita e altre caratteristiche biologiche prima dell'uso. Alcuni svantaggi sono che è allogenico e i lotti sono raggruppati da diversi donatori. Inoltre, poiché la PL non contiene piastrine viventi, che possono produrre citochine e fattori di crescita fino a 10 giorni, i terreni di coltura contenenti PL devono essere cambiati ogni 3 giorni (invece di 7-10 giorni quando la coltura è integrata con PRP)19. Espandere le cellule in vitro nella propria fonte di fattori di crescita e nutrienti forniti da questa preparazione PRP è certamente vantaggioso. Il preparato è privo di integratori xenogenici nella coltura cellulare che potrebbero causare rigetto, allergia o trasmissione di malattie infettive.

In studi precedenti, è stato dimostrato che il PRP autologo può essere utilizzato come terreno di coltura sicuro, efficiente ed economico per la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)20. I terreni forniti con PRP autologo al 20% hanno aumentato la proliferazione cellulare fino a 13 volte senza modificare il fenotipo cellulare. Nelle cliniche, il PRP è considerato avere potenti capacità di ringiovanimento e rigenerazione.

Attualmente, il PRP ottenuto dal sangue di un paziente è già utilizzato in modo efficiente in ambito clinico per la sola guarigione delle ferite21 o in combinazione con acido ialuronico 22,23 o rigenerazione ossea 24,25; o ringiovanimento cutaneo da solo26 o in combinazione con cellule della frazione vascolare stromale derivate dal tessuto adiposo27,28,29. Ciò ha spinto lo studio sull'utilizzo del PRP di un paziente per promuovere l'espansione dei fibroblasti autologhi.

A tale scopo, e per garantire la riproducibilità dei risultati ottenuti con la preparazione PRP, abbiamo sviluppato uno speciale dispositivo PRP. Questo sistema chiuso consente la standardizzazione dei preparati PRP, che è un prerequisito per ridurre al minimo le fluttuazioni del donatore di un paziente (per quanto riguarda la concentrazione piastrinica e le variazioni dipendenti dall'operatore). La conta delle cellule del sangue ottenuta da 10 pazienti ha mostrato che il protocollo è altamente riproducibile (Figura 2). Inoltre, è stato dimostrato che il PRP ha avuto potenti effetti come booster di proliferazione, fino a 7,7 volte rispetto a FBS (Figura 3B). Questo è importante per ridurre i costi e i tempi necessari per il processo di espansione. In un recente studio, abbiamo ulteriormente analizzato come il PRP influisce sulla proliferazione e la differenziazione dei fibroblasti. Il PRP al 20% ha mostrato la migliore efficacia senza influenzare il fenotipo cellulare o il genotipo14.

Una limitazione del metodo è che il mezzo contenente PRP deve essere preparato con eparina per prevenire la formazione di coaguli. Anche se in questo dispositivo viene utilizzato un anticoagulante plasmatico standard (un anticoagulante citrato di sodio e un chelante del calcio), la formazione di coaguli di fibrina può verificarsi quando il plasma viene aggiunto a terreni di coltura contenenti calcio30. L'eparina oltre alla preparazione PRP impedisce questa formazione di coaguli di fibrina. Tuttavia, le eparine possono legare i fattori di crescita e possono interferire con la crescita cellulare30. Ad esempio, è stato dimostrato che l'eparina influisce negativamente sulla proliferazione dei fibroblasti dermici31. Tuttavia, le concentrazioni utilizzate erano 4 volte più concentrate rispetto alla concentrazione utilizzata in questo studio (2 U / ml).

Inoltre, l'eparina commerciale è principalmente purificata da fonti suine; Pertanto, a causa della sua origine animale, rappresenta una limitazione nello sviluppo di un mezzo completamente privo di xeno. Sebbene l'eparina suina sia stata approvata per la terapia umana, è stata riportata ipersensibilità alla molecola32. Un'altra limitazione è che il PRP deve essere usato come integratore biologico fresco e non può essere congelato. Per quanto riguarda l'emivita delle piastrine, è stato precedentemente dimostrato che dopo 10 giorni, metà delle piastrine presenti nel PRP sono ancora vitali33. Per questo motivo, il PRP viene mantenuto a temperatura ambiente e utilizzato per 10 giorni. Inoltre, per le future terapie cellulari che richiedono la produzione di un numero massiccio di cellule, la limitazione principale è la quantità totale di sangue che può essere prelevata dal paziente.

In sintesi, questo protocollo dimostra che la sostituzione di FBS con PRP si traduce in una rapida espansione dei fibroblasti. Le piastrine presenti nel PRP rilasciano lentamente un mix orchestrato di fattori di crescita durante la fase di espansione della coltura. Il dispositivo presentato viene utilizzato durante una procedura standardizzata che riduce la complessità e il tempo pratico durante la preparazione del PRP. Questo sistema è quindi considerato un metodo appropriato quando è necessaria un'espansione ex vivo rapida e sicura per applicazioni di terapia cellulare autologa in condizioni GMP.

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Disclosures

Questo progetto è stato finanziato da Regen Lab SA. Sarah Berndt è responsabile del progetto di terapia cellulare per Regen Lab ed è impiegata presso Regen Lab SA. Antoine Turzi è il CEO di RegenLab.

Acknowledgments

Ringraziamo il signor Grégory Schneiter per l'assistenza tecnica con i dati di citometria a flusso; la professoressa Muriel Cuendet (Laboratorio di farmacognosia, Scuola di scienze farmaceutiche e Università di Ginevra) per aver consentito l'uso del citometro a flusso Attune e del microscopio ad alta produttività Cytation 3; Prof.ssa Brigitte Pittet per consulenze scientifiche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

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References

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Retrazione Numero 168 plasma ricco di piastrine PRP fibroblasti proliferazione cellulare migrazione cellulare guarigione delle ferite coltura cellulare terapia cellulare
Produzione di plasma autologo ricco di piastrine per aumentare l'espansione in vitro dei fibroblasti umani
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Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

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