JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60828
, , , , , , , ,
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science,Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University

Summary

We beschrijven een methode om harige wortels te induceren door Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie in Tartary boekweit(Fagopyrum tataricum). Dit kan worden gebruikt om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten in Tartary boekweit te onderzoeken, worden aangenomen voor elke genetische transformatie, of gebruikt voor andere geneeskrachtige planten na verbetering.

Abstract

Tartary boekweit (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] bezit verschillende biologische en farmacologische activiteiten omdat het overvloedige secundaire metabolieten zoals flavonoïden, vooral rutine bevat. Agrobacterium rhizogenes zijn geleidelijk wereldwijd gebruikt om harige wortels in medicinale planten te induceren om genfuncties te onderzoeken en de opbrengst van secundaire metabolieten te verhogen. In deze studie hebben we een gedetailleerde methode beschreven om A. rhizogenes-gemedieerde harige wortels in tbc te genereren. Cotyledons en hypocotyledonaire as op 7-10 dagen werden geselecteerd als explants en besmet met A. rhizogenes die een binaire vector, die onvoorziene harige wortels die verscheen na 1 week veroorzaakt. De gegenereerde harige worteltransformatie werd geïdentificeerd op basis van morfologie, resistentieselectie (kanamycine) en reporter genexpressie (groen fluorescerend eiwit). Vervolgens werden de getransformeerde harige wortels naar behoefte zelf gepropageerd. Ondertussen werd een myeloblastose (MYB) transcriptiefactor, FtMYB116, omgezet in het TB-genoom met behulp van de A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels om de rol van FtMYB116 in het synthetiseren van flavonoïden te verifiëren. De resultaten toonden aan dat de expressie van flavonoïde-gerelateerde genen en de opbrengst van flavonoïde verbindingen (rutine en quercetine) aanzienlijk waren (p < 0,01) gepromoot door FtMYB116, wat aangeeft dat A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels kunnen worden gebruikt als een effectief alternatief instrument om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten te onderzoeken. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol dat in deze studie wordt beschreven voor het genereren van harige wortels kan worden aangenomen voor elke genetische transformatie of andere geneeskrachtige planten na aanpassing.

Introduction

Tartary boekweit (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) is een soort dicotyledon behorend tot het geslacht Fagopyrum en de familie Polygonaceae1. Als een soort van Chinese geneeskunde homologe voedsel, tbc heeft aanzienlijke belangstelling ontvangen als gevolg van de onderscheidende chemische samenstelling en diverse bio-activiteiten tegen ziekten. Tbc is voornamelijk rijk aan koolhydraten, eiwitten, vitaminen en carotenoïden, evenals in polyfenolen zoals fenolzuren en flavonoïden1. Verschillende biologische en farmacologische activiteiten van flavonoïden, waaronder antioxidatieve, antihypertensieve2, en ontstekingsremmende evenals antikanker en antidiabetische eigenschappen, zijn aangetoond3.

Agrobacterium rhizogenes is een bodembacterie die bijdraagt aan de ontwikkeling van harige wortelziekte in verschillende hogere planten, vooral dicotyledons, door het infecteren van wondplaatsen4,5. Dit proces wordt geïnitieerd door de overdracht van het T-DNA in het wortelopwekkende (Ri) plasmid5,6 en gaat vaak gepaard met de integratie en expressie van een exogen eergen uit de Ri plasmid en de daaropvolgende stappen van het genereren van het harige wortelfenotype7. A. rhizogenes-gemedieerde transgene harige wortels, als krachtig instrument op het gebied van plantaardige biotechnologie, zijn het meest gebruikt vanwege hun stabiele en hoge productiviteit en gemakkelijke verkregen in een korte periode. Bovendien onderscheiden harige wortels veroorzaakt door A. rhizogenes zich efficiënt door hun plagiotropische wortelontwikkeling en een sterk vertakkende groei in een hormoonvrij medium8. Ze kunnen worden gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waaronder kunstmatige zaadproductie, wortelknobbelonderzoek, en bij het bestuderen van de interacties met andere organismen zoals mycorrhizal schimmels, aaltjes en wortelpathogenen7,9. Bovendien zijn harige worteltransformatieculturen op grote schaal gebruikt als experimenteel systeem om de biochemische trajecten en chemische signalering te onderzoeken en om secundaire metabolieten van planten te produceren die worden gebruikt als farmaceutische producten, cosmetica en levensmiddelenadditieven8,10. De waardevolle secundaire metabolieten, waaronder indole alkaloïden, aconites, tropane alkaloïden, terpenoïden en flavonoïden, gesynthetiseerd in wilde harige wortels zijn onderzocht voor meerdere decennia in tal van soorten, zoals ginsenoside in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, en fenolverbindingen in TB2,13.

Harige wortels zijn geproduceerd met behulp van A. rhizogenes in 79 plantensoorten uit 27 families14. Bijvoorbeeld, A. rhizogenes-gemedieerde harige wortel transformatie is gemeld in sojabonen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, en witloof(Cichorium intybus L.) 20. TB harige wortel transformatie is ook onderzocht2. Weinig gedetailleerde protocollen zijn beschikbaar met betrekking tot de ontwikkeling van harige wortels bemiddeld door A. rhizogenes ofwel het dragen van een binaire vector of niet. Zo introduceerden Sandra et al.21 een methode voor de productie van transgene aardappelharige wortels die in wilde scheuten worden ondersteund. De volledig ontwikkelde harige wortels kunnen 5-6 weken na de injectie van A. rhizogenes worden gevisualiseerd die het gus reporter gen in de stengelinternodes van aardappelplanten vervoeren. Een andere studie had ook gemeld een transgene harige wortelstelsel geïnduceerd door A. rhizogenes herbergen de gusA reporter gen in jute(Corchorus capsularis L.) 22. Bovendien verkregen Supaart et al.23 transgene tabaksharige wortels met behulp van A. rhizogenes getransformeerd met de expressievector pBI121 die het gen van Δ1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase draagt om THCA te produceren.

Echter, een stap-voor-stap proces voor een effectieve generatie van harige wortel transformatie, vooral in TB, is relatief minder aangetoond. In deze studie hebben we beschreven een gedetailleerd protocol met behulp van A. rhizogenes die de reporter gen (GFP), een selectieve marker (Kan), en een gen van belang (b4, een geïdentificeerd uit onze groep, maar ongepubliceerd gen uit fundamentele helix-loop-helix(bHLH) familie) om harige wortel genetische transformatie in TTb te genereren. Het experiment duurde 5-6 weken, van de inenting van zaden tot het genereren van harige wortels, waarbij de explant voorbereiding, infectie, coculturing, subculturing, en de daaropvolgende voortplanting. Bovendien werd A. rhizogenes die een binaire plasmid bevat die het tbc-transgene van myeloblastosetranscriptiefactor 116(FtMYB116)draagt, gebruikt om te bepalen of FtMYB116 de accumulatie van flavonoïden, met name rutine, in tbc kan bevorderen op gen- en metabolisch niveau door de tbc-harige worteltransformatie. FtMYB116, dat is een licht-geïnduceerde transcriptie factor, regelt de synthese van rutin ei onder verschillende lichtomstandigheden5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoïde-3′-hydroxylase (F3‘H), en flavonol synthase (FLS)24 zijn belangrijke enzymen die betrokken zijn bij de metabole route van rutine biosynthese. Daarom toont deze studie de overexpressie van FtMYB116 bij tbc harige wortels en de expressie van belangrijke enzymgenen, evenals de inhoud van rutine en andere flavonoïden zoals quercetine.

Protocol

De tbc gebruikt in deze studie werd genoemd als BT18, die afkomstig is van het ras van “JinQiao No.2” geteeld door het Research Center of Small Miscellaneous Grain van Shanxi Academy of Agricultural Science. De primaire stappen van dit protocol worden geïllustreerd in figuur 1. OPMERKING: Bedien explants-gerelateerde manipulatie snel, en waar mogelijk, houd de petrischaaltjes gesloten om verwelking en verontreiniging te voorkomen. Tenzij anders vermeld, werden al…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde TB harige worteltransformatieDeze studie beschrijft het stapsgewijze protocol dat is ingesteld om genetisch getransformeerde harige wortels te verkrijgen met behulp van A. rhizogenes. Het duurde ongeveer 5-6 weken van de inenting van tbc-zaden tot het oogsten van de geïdentificeerde harige wortels, en enkele belangrijke stappen zijn afgebeeld in figuur 1 (A-H). Kort werden gesteriliseerde gepelde za…

Discussion

Tbc is gebruikt in verschillende studies in verband met secundaire metabolieten op genetische en metabolische niveaus1,2,5,27,28. Harige wortelcultuur, als een unieke bron voor metabolietproductie, speelt een centrale rol in de metabole techniek29 en kan worden gebruikt om metabole trajecten te veranderen door het invoegen van de verwan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Fundamental Research Funds voor de Centrale Onderzoeksinstituten voor Welzijn ZXKT17002.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Tags

Hairy RootsAgrobacterium RhizogenesTartary BuckwheatFagopyrum TataricumTransformationSeedlingExplantCotyledonHypocotylYEB MediumMonoclonal Colony

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image