Summary
Describimos un método de inducir raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-transformación mediada en trigo sarraceno tartá ) (Fagopyrum tataricum). Esto se puede utilizar para investigar las funciones genéticas y la producción de metabolitos secundarios en el trigo sarraceno tártaro, ser adoptado para cualquier transformación genética, o utilizado para otras plantas medicinales después de la mejora.
Abstract
El trigo sarraceno taráfilo (TB)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] posee diversas actividades biológicas y farmacológicas porque contiene abundantes metabolitos secundarios como flavonoides, especialmente rutinarina. Agrobacterium rhizogenes se han utilizado gradualmente en todo el mundo para inducir raíces peludas en plantas medicinales para investigar las funciones genéticas y aumentar el rendimiento de metabolitos secundarios. En este estudio, hemos descrito un método detallado para generar a. rizogenes-raíces peludas mediadas en la tuberculosis. Los cotiledons y el eje hipocotiledónider a los 7-10 días fueron seleccionados como explantas e infectados con A. rizogenes llevando un vector binario, que indujo raíces peludas aventureras que aparecieron después de 1 semana. La transformación de la raíz peluda generada se identificó en función de la morfología, la selección de resistencia (kanamicina) y la expresión génica del reportero (proteína fluorescente verde). Posteriormente, las raíces peludas transformadas se autopropagaron según sea necesario. Mientras tanto, un factor de transcripción de mieloblastosis (MYB), FtMYB116,se transformó en el genoma de la tuberculosis utilizando las raíces pellizudas mediadas por A. rhizogenespara verificar el papel de FtMYB116 en la síntesis de flavonoides. Los resultados mostraron que la expresión de genes relacionados con el flavonoide y el rendimiento de los compuestos flavonoides (rutina y quercetina) fueron significativamente (p < 0.01) promovidos por FtMYB116,lo que indica que las raíces peludas mediadas por A. rhizogenespueden utilizarse como una herramienta alternativa eficaz para investigar las funciones génicas y la producción de metabolitos secundarios. El protocolo detallado paso a paso descrito en este estudio para generar raíces peludas puede ser adoptado para cualquier transformación genética u otras plantas medicinales después del ajuste.
Introduction
Tartary sarraceno (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) es un tipo de dicotiledón perteneciente al género Fagopyrum y la familia Polygonaceae1. Como un tipo de alimento homóloga de la medicina china, la tuberculosis ha estado recibiendo un interés considerable debido a su composición química distintiva y diversas bioactividades contra las enfermedades. La tuberculosis es principalmente rica en carbohidratos, proteínas, vitaminas y carotenoides, así como en polifenoles como ácidos fenólicos y flavonoides1. Varias actividades biológicas y farmacológicas de flavonoides, incluyendo antioxidante, antihipertensivo2, y antiinflamatorias, así como propiedades anticancerígenas y antidiabéticas, se han demostrado3.
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria del suelo que contribuye al desarrollo de la enfermedad de las raíces peludas en varias plantas superiores, especialmente dicotiledos, infectando los sitios de la herida4,,5. Este proceso se inicia mediante la transferencia del ADN-T en el plásmido de inducción de raíces (Ri)5,6 y se acompaña comúnmente de la integración y expresión de un gen exógeno del plásmido Ri y los pasos subsiguientes de generación del fenotipo de raíz peluda7. A. rhizogenes-raíces vellosas transgénicas mediadas, como una poderosa herramienta en el campo de la biotecnología vegetal, han sido más ampliamente utilizados debido a su estable y alta productividad y fácil obtención en un corto período de tiempo. Por otra parte, raíces peludas inducidas por A. rizogenes se distinguen eficientemente por su desarrollo de raíz plagiotrópica y crecimiento altamente ramificado en un medio libre de hormonas8. Se pueden utilizar en varios campos de investigación, incluyendo la producción artificial de semillas, investigación de nódulos de raíz, y en el estudio de las interacciones con otros organismos como hongos micorrizas, nematodos, y patógenos de la raíz7,9. Además, los cultivos de transformación de raíces peludas se han utilizado ampliamente como un sistema experimental para investigar las vías bioquímicas y la señalización química y para producir metabolitos secundarios vegetales que se utilizan como productos farmacéuticos, cosméticos y aditivos alimentarios8,,10. Los valiosos metabolitos secundarios, incluyendo alcaloides indólicos, aconitas, alcaloides tropano, terpenoides y flavonoides, sintetizados en raíces peludas de tipo salvaje se han investigado durante varias décadas en numerosas especies, como el ginsenoside en Panax ginseng11,coumarine en Ammi majus12,y compuestos fenólicos en TB2,,13.
Raíces peludas se han producido utilizando A. rizogenes en 79 especies de plantas de 27 familias14. Por ejemplo, A. rhizogenes-transformación de raíz peluda mediada se ha divulgado en soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, y achicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb transformación de raíz peluda también se ha investigado2. Pocos protocolos detallados están disponibles con respecto al desarrollo de raíces peludas mediadas por A. rhizogenes ya sea que lleven un vector binario o no. Por ejemplo, Sandra et al.21 introdujeron un método para producir raíces peludas de papa transgénicas sostenidas en brotes de tipo salvaje. Las raíces peludas completamente desarrolladas podrían visualizarse 5-6 semanas después de la inyección de A. rizogenes llevando el gen del reportero de gus en los internodos del tallo de las plantas de papa. Otro estudio también había reportado un sistema radicular peludo transgénico inducido por A. rhizogenes albergando el gen reportero gusA en yute (Corchorus capsularis L.) 22.23 obtuvieron raíces peludas de tabaco transgénica utilizando A. rhizogenes transformados con la expresión vector pBI121 que transporta el gen del ácido1tetrahidrocannabinólico (THCA) para producir THCA.
Sin embargo, un proceso paso a paso para una generación efectiva de transformación de la raíz peluda, especialmente en la tuberculosis, ha sido relativamente menos demostrado. En este estudio, hemos descrito un protocolo detallado utilizando A. rhizogenes que llevan el gen reportero (GFP), un marcador selectivo (Kan), y un gen de interés (b4, un gen identificado de nuestro grupo pero inédito de la familia básica helix-loop-helix(bHLH)) para generar transformación genética de raíz peluda en TB. El experimento duró 5-6 semanas, desde la inoculación de semillas hasta la generación de raíces peludas, que involucraron la preparación de explantas, infección, cocultura, subcultura ción y posterior propagación. Además, A. rhizogenes que contiene un plásmido binario que transporta el transgén de tuberculosis del factor de transcripción de mieloblastosis 116 (FtMYB116) se utilizó para determinar si FtMYB116 puede promover la acumulación de flavonoides, particularmente la rutina, en la tuberculosis a nivel genético y metabólico a través de la transformación de la raíz peluda de TB. FtMYB116, que es un factor transcripcional inducido por la luz, regula la síntesis de rutina en diferentes condiciones de luz5. La calcocona sintasa (CHS), la flavanona-3-hidroxilasa (F3H), el flavonoide-3'-hidroxilasa (F3'H) y la flavonol sintasa (FLS)24 son enzimas clave implicadas en la vía metabólica de la biosíntesis de rutina. Por lo tanto, este estudio demuestra la sobreexpresión de FtMYB116 en raíces peludas de tuberculosis y la expresión de genes clave de enzimas, así como el contenido de rutina y otros flavonoides como la quercetina.
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Protocol
La TB utilizada en este estudio fue nombrada como BT18, que se originó a partir de la raza de "JinQiao No.2" cultivada por el Centro de Investigación de Pequeño Grano Varios de la Academia Shanxi de Ciencias Agrícolas. Los pasos primarios de este protocolo se ilustran en el cuadro 1.
NOTA: Operar la manipulación relacionada con explantes rápidamente, y cuando sea posible, mantener los platos Petri cerrados para evitar marchitamientos y contaminación. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones explantarse se llevaron a cabo bajo la condición de una luz de 14 horas y un fotoperiodo oscuro de 10 horas a 25 oC. A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones relacionadas con explantas o bacterias se realizaron en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. Todos los ingredientes de medios para A. rhizogenes y cultivos de plantas in vitro se proporcionan en la Tabla 1. Después de ajustar el pH, todos los medios fueron autoclavedos a 120 oC durante 20 min. Los medios solidificados se prepararon llenando 25 ml de medio en una placa Petri de 9 cm de diámetro y permitiéndole solidificarse.
ADVERTENCIA: Deposite todas las bacterias y plantas modificadas genéticamente en el contenedor de residuos apropiado. Operar todos los productos químicos peligrosos en un armario de humos y depositarlos en el contenedor de residuos peligrosos.
1. Preparación de explantes de tuberculosis
- Preparación de semillas de tuberculosis
- Seleccione semillas de tuberculosis regordetas y no dañadas(Figura 1A1) que se hayan conservado a una temperatura inferior a 20 oC durante no más de 2 años.
- Remoje las semillas en agua a 28 oC durante aproximadamente 20 minutos para que la capa de semillas pueda pelarse fácilmente(Figura 1A2). Si es necesario, utilice tijeras para cortar una ranura en las semillas para facilitar el peeling.
- Esterilización de semillas de tuberculosis
- Coloque entre 100 y 200 semillas peladas en un matraz cónico esterilizado de 100 ml.
- Desinfectar las semillas con 75% de etanol durante 30 s.
- Sustituya el etanol por un 5% de hipoclorito sódico y desinfecte durante 15 min.
NOTA: La desinfección con bicloruro de mercurio a una concentración de 1 g/L durante 8 min puede utilizarse como esterilizador alternativo para reemplazar el hipoclorito de sodio en cualquier caso de esterilización inadecuada.
ADVERTENCIA: El bicloruro de mercurio es peligroso y no es un material respetuoso con el medio ambiente. Operarlo en el armario de fumcoración y depositarlo en el contenedor de residuos peligrosos, si se utiliza bicloruro de mercurio en cualquier caso. - Vierta el hipoclorito de sodio.
- Lave las semillas con agua desionizada estéril 5 veces.
- Seque las semillas con un papel bibuoso estéril.
- Preparación de plántulas de tuberculosis
- Preparar 50 ml de Murashige y Skoog (MS) medio basal (1962) complementado con 30 g/L de sacarosa y 7 g/L de agar en polvo (MSSA)(Tabla 1) en una botella de cultivo de tejido vegetal de 300 ml.
- Ajuste el pH a 5,8 antes de autoclave.
- Distribuya 10 semillas uniformemente por botella de medio MSSA.
- Germinar las semillas en una sala de cultivo a 25 oC a 1 oC bajo la condición de luz durante 7-10 días.
- Preparación de explantes estériles
- Seleccione plántulas robustas de TB(Figura 1C),cuando se desdoblen las 2 piezas de cotiledón.
- Cortar las plántulas de las raíces(Figura 1C puntasde flecha de color rojo),evitando el contacto con el medio.
- Colócalos en un plato estéril de Petri.
- Corta los hipococotílos en segmentos de 0,8-1 cm y corta los cotiledons en trozos de aproximadamente 0,5 cm.
- Precultivo de estos explantes en medio MSSA bajo la condición de luz durante 24 h.
- Transfiera a un matraz cónico esterilizado de 100 ml, que ahora está listo para la infección.
2. Preparación de A. rizogenes para la transformación
NOTA: La cepa A. rhizogenes ACCC10060 fue proporcionada amablemente por el Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales y conservada a 80oC. A. rhizogenes se transformó con el vector binario pK7GWIWG2D (II) que alberga un ADN-T que lleva el gen b4 que acompaña a un GFP como gen indicador y el gen de resistencia Kan como marcador seleccionable. El gen b4 es un miembro de la familia bHLH del factor de transcripción, que aún no se ha publicado. Para evaluar el potencial de las raíces peludas de tuberculosis, A. rhizogenes se transformó con el vector binario pK7WG2D que contiene el gen MYB116 para investigar su efecto en la producción de metabolitos secundarios como flavonoides a nivel de expresión génica y por análisis metabólicos. Activado A. rizogenes debe estar bien preparado al mismo tiempo con los explantes.
- Activación de A. rhizogenes
- Deshielo A. rizogenes sobre hielo
- Sumerja las bacterias y alinee uniformemente sobre el medio de manitol de levadura (YEB) suplementado con 15 g/L de agar en polvo, 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de espectinomicina (YEBARS, pH 7.0).
- Incubar las bacterias a 28oC durante 12–16 h.
- Escoge una colonia monoclonal y enmócelala en otro plato de Petri de la misma manera descrita anteriormente.
- Seleccione colonias monoclonales y clasifique en un matraz cónico esterilizado de 100 ml que contenga 20 ml de medio YEB complementado con 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de espectinomicina (YEBRS, pH 7.0) a 28 oC y 200 rpm durante 16-18 h hasta que el valor de OD600 alcance 2.0.
- Incubar entre 2%y 4% del cultivo antes mencionado en otro matraz cónico de 100 ml que contenga 20 ml de medio YEBRS a 28 oC y 200 rpm para 4-5 h hasta que el valor de OD600 alcance aproximadamente 0,5(Figura 1D).
3. Infección y detección de explantes de tuberculosis
NOTA: El objetivo de este protocolo es obtener raíces peludas transformadas genéticamente. Las raíces de tipo silvestre se utilizaron como el control negativo para evaluar la expresión transgénica. En este protocolo, A. rhizogenes se transformó con vector binario pK7WG2D que llevaba el gen de FtMYB116 o pK7GWIWG2D (II) llevando el gen de b4 de antemano.
- Resuspensión de A. rhizogenes
- Transfiera el cultivo obtenido en el paso 2.1.6 a un tubo centrífugo esterilizado de 50 ml.
- Girar a 4.000 x g durante 10 min a 20oC.
- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano con un medio de EP complementado con 30 g/L de sacarosa y 300 oM de acetosyringona (AS) (MSSAS, pH 5.8) a OD600 0.2.
- Infección de explantes
- Infundir la suspensión bacteriana obtenida en el paso 3.1.3 en un matraz cónico que contenga los explantas preparadas en el paso 1.4.6 durante 10 min(Figura 1E).
- Saque los explantes y seque con un papel bibuloso estéril.
4. Cocultura de explantes con A. rhizogenes
- Coloque un papel de filtro estéril de 9 cm de diámetro en el medio MS, que se solidifica con polvo de agar de 7 g/L complementado con sacarosa de 30 g/L y AS de 100 m (medio MSSAAS, pH 5.2).
- Superponga los explantes en el papel del filtro a 25 oC durante 3 días en la oscuridad(Figura 1F).
5. Inducción y cultura selectiva
- Coloque aproximadamente 20 explantes infectados en el medio MSSA complementado con 500 mg/L de cefotaxime y 50 mg/l de kanamicina (Kan) (MSSACK, pH 5.8)(Figura 1G).
- Incubarlos verticalmente bajo la condición de luz a 25 oC a 1 oC. Las raíces peludas ocurren aproximadamente 1 semana después de la incubación(Figura 1H puntas de flecha de tablero negro indican la aparición de raíces peludas).
NOTA: Reemplace el medio MSSACK cada 15 días si es necesario.
6. Sucultura de las raíces peludas de LA Tuberculosis
NOTA: Este procedimiento tiene como objetivo cosechar raíces peludas vigorosas. Observar regularmente el crecimiento de raíces peludas durante la propagación, y eliminar las contaminadas e inactivadas de manera oportuna. Si es necesario, repita los siguientes pasos para propagar más raíces peludas. Se tarda aproximadamente 10-14 días desde la subcultura hasta la cosecha.
- Seleccione las raíces peludas que muestran aspecto blanco y crecimiento rápido.
- Cortarlos en trozos de 2-3 cm.
- Conténlos claramente en un banco limpio.
- Sumercelos en un matraz cónico esterilizado de 100 ml que contiene 5 ml de medio MS complementado con 30 g/l de sacarosa y 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) a una velocidad giratoria de 80 rpm a 25 oC en la oscuridad hasta que se sobresevan hasta el fondo del matraz(Figura 1I).
7. Identificación de raíces peludas transformadas y conservación
NOTA: Las raíces peludas transformadas se pueden identificar en función de los aspectos de morfología y nivel genético. La identificación también se puede llevar a cabo de acuerdo con el genoma de la raíz peluda y la resistencia, que no están cubiertos en este protocolo. Este procedimiento se centra principalmente en el gen del reportero y la identificación del gen objetivo.
- Retire las raíces peludas leonadas y contaminadas y selecciónelas con aspecto blanco.
- Evalúe si hay fluorescencia verde bajo un transiluminador ultravioleta doble azul/ligero.
- Seleccione las raíces peludas que presentan una fuerte señal de fluorescencia en los tubos numerados o envuelta sin un papel de aluminio marcado después de secarlas con un papel absorbente.
- Liofilizarlos en nitrógeno líquido, seguido de almacenar toda la cosecha a 80 oC para una investigación posterior.
- Identificación genética
- Triturar 0,1 g de las raíces peludas en polvo fino en nitrógeno líquido.
- Preparar el ADN genómico de las líneas transgénicas independientes de la tuberculosis utilizando el método modificado del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)25 de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de ADN genómico vegetal.
- Realizar reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando 100 ng de plantilla de ADN genómico y imprimaciones enumeradas en la Tabla 2.
- Realizar el ciclo de amplificación de la siguiente manera: predesnaturalización a 94oC durante 5 min, desnaturalización a 94oC durante 30s, recocido de imprimación a 55oC para 30s y extensión de imprimación a 72oC para 30 s. Después de 36 ciclos y un paso de extensión final a 72 oC durante 10 min, analizar los productos de amplificación en geles de agarosa al 1%.
- Mancha los geles con tinción de ácido nucleico y visualícelos bajo luz UV.
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Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-mediación de la transformación de la raíz peluda de la tuberculosis
Este estudio describe el protocolo paso a paso que se estableció para obtener raíces peludas transformadas genéticamente utilizando A. rhizogenes. Tomó aproximadamente 5-6 semanas desde la inoculación de semillas de tuberculosis hasta la cosecha de las raíces peludas identificadas, y algunos pasos clave se representan en la Figura 1 (A-H). Brevemente, se inocularon semillas esterilizadas con cáscara(Figura 1B)para lograr una germinación estéril más rápida. A. rizogenes (Figura 1D) y explantas estériles deben activarse y prepararse con antelación, respectivamente. Esto es seguido por algunos pasos clave, incluyendo la infección de explantes con A. rhizogenes activados (Figura 1E), cocultivo (Figura 1F), y cultivo selectivo (Figura 1G). Los explantes infectados deben colocarse uniformemente en el medio sólido de LA YM y el espacio debe mantenerse entre ellos para separar fácilmente las diferentes líneas transgénicas. Raíces peludas aparecen con un color blanco esponjoso de una manera plagiotrópica en los sitios de la herida de los explantes (Figura 1H). Las raíces peludas forman una matriz altamente ramificada y entrelazada y se pueden propagar según sea necesario(Figura 1I). Las raíces peludas cosechadas se pueden utilizar para investigar la función génica o la interacción gen-o proteína-proteína. Alternativamente, las raíces peludas de tb pueden propagarse masivamente para producir metabolitos secundarios como la rutina en los biorreactores designados.
El método para inducir raíces peludas transgénicas en la tuberculosis ha sido corroborado utilizando un vector binario (pK7GWIWG2D (II)) que lleva los genes GFP y b4 (un miembro de la familia bHLH del factor transcripcional, aún no publicado). El gen reportero GFP se utilizó para distinguir fácilmente las raíces peludas transgénicas de las no transgénicas visualizando la señal bajo un transiluminador ultravioleta dual azul/ligero (Figura 2) o identificando el gen objetivo(Figura 3). Las raíces peludas transformadas mostraban fluorescencia verde cuando se iluminaban bajo luz azul o ultravioleta (representada sin puntas de flecha negras en la Figura 2A),mientras que las raíces peludas no transformadas no mostraban la fluorescencia verde(Figura 2B). Las raíces peludas con una señal GFP alta se propagaron durante quince días, como se ilustra en la Figura 2C.
Para identificar aún más si el vector binario se ha transformado con éxito en el genoma de la tuberculosis, se llevaron a cabo identificaciones genéticas. En resumen, se preparó ADN genómico vegetal de las raíces peludas de tuberculosis para el análisis de PCR basado en el método CTAB modificado25. La PCR se realizó amplificando los genes (Kan, GFPy b4), que estuvo presente en la Figura 3,respectivamente. Las imprimaciones se enumeran en la Tabla 2. La presencia de los 3 genes en todas las líneas transgénicas(Figura 3, carriles 5–11) indicó que el vector binario se ha transformado con éxito en el genoma de la tuberculosis. Kan y GFP estaban ausentes en las raíces de tipo silvestre(Figura 3, carril 3) y control negativo experimental(Figura 3, carril4), mientras que b4 se detectó en las raíces de tipo silvestre. Estos 3 genes se presentaron sin duda en el control positivo(Figura 3, carril 2), pero aparentemente estaban ausentes en el control negativo(Figura 3, carril4).
Evaluación del factor de transcripción inducido por la luz FtMYB116 en TB utilizando el sistema radicular peludo antes mencionado
FtMYB116 se expresó mediante el empleo del protocolo antes mencionado de inducción de la raíz peluda. Esto se logró preinsertando el gen FtMYB116 en el vector binario pK7WG2D y luego infectando con A. rhizogenes para lograr la sobreexpresión genética. Brevemente, las raíces peludas de 0,1 g fueron trituradas en polvo fino mediante el uso de nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de aislamiento de ARN vegetal26. A continuación, se realizaron PCR de transcripción inversa y PCR en tiempo real para amplificar FtMYB116 y rutin sintetizar genes relacionados con la vía. Posteriormente se verificaron los efectos reglamentarios de FtMYB116 en la expresión génica relacionada con la síntesis de rutina y el rendimiento de la rutina.
La Figura 4A muestra la expresión relativa de FtMYB116 en las líneas transgénicas de las raíces peludas de tb. En comparación con el grupo de control, la expresión relativa de FtMYB116 mostró un aumento considerable en las 3 líneas transgénicas independientes. La Figura 4B y la Figura 4C ilustran la promoción de la biosíntesis de rutina y quercetina a nivel metabólico a través de la sobreexpresión ftMYB116. El contenido de rutina y quercetina en el transgénico se incrementó significativamente(p < 0.01) en comparación con los del tipo salvaje, alcanzando 40 y 0,5 mg/g FW, respectivamente, que fueron 8 veces los del tipo salvaje. Las expresiones génicas relativas de CHS, F3H, F3'Hy FLS en las 3 líneas transgénicas fueron notablemente más altas que las del grupo de control(Figura 4D). Juntos, estos resultados confirmaron que la estrategia descrita en este estudio podría utilizarse con éxito para generar transformación de la raíz peluda en la tuberculosis e investigar la expresión génica y el rendimiento metabólico de los metabolitos secundarios.
Figura 1: Procesos para inducir a A. rhizogenes-raíces vellosas transgénicas mediadas en la tuberculosis. Se muestran imágenes representativas de las etapas críticas: (A1) y (A2) representan antes y después de pelar las capas de semillas; (B) representa cada 10 semillas inoculadas en un frasco de tejido que contiene medio MSSA; (C) denota las plántulas de tuberculosis entre 7 y 10 días después de la inoculación, y las puntas de flecha de la cabeza de flecha de la mira roja muestran los puntos de corte; (D) y (E) indican la preparación de A. rizogenes (OD600 a 0,5) y la infección de explantas, respectivamente; (F) y (G) simbolizan la cocultura con A. rhizogenes activados en el cultivo medio y selectivo MSSAAS en el medio MSSACK, respectivamente; raíces peludas emergen de (H), como lo muestran las puntas de flecha de tablero negro; y (I) muestra la propagación de la formación de raíces peludas; las puntas de flecha de tablero negro indican las raíces peludas inducidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Transformación del vector binario portador del gen reportero de la FPG. (A) denota las raíces peludas inducidas después del cultivo selectivo examinado bajo el transiluminador ultravioleta doble azul/ligero. (B) y (C) representan la raíz de tipo salvaje y la propagación de raíces peludas transformadas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Amplificación pcR de genes (Kan, GFPy b4) a partir de ADN genómico aislado de raíces de tipo salvaje y raíces peludas de tuberculosis en 7 líneas transgénicas independientes. (A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Carril 1:marcadores de tamaño molecular (la punta de flecha blanca indica 750 bp), carril 2:plásmido (vector binario pK7GWIWG2D (II) que lleva genes Kan, GFPy b4) como control positivo, carril 3:raíz de tipo salvaje, carril 4:H2O purificado como control negativo, y carriles 5–11:las 7 líneas transgénicas independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión relativa de FtMYB116 en las líneas transgénicas de raíces peludas DE TUBERCULOSIS. (A) y el efecto promatista de la sobreexpresión de FtMYB116 sobre la biosíntesis de (B) rutina y (C) quercetina (Esta cifra ha sido modificada de Dong et al.5). Los experimentos se realizaron por triplicado y se llevaron a cabo 3 veces. "**" indica una diferencia significativa en p < 0.01 usando la prueba tde Student. (D) Expresión de genes relacionados con vías de síntesis de flavonoides en líneas transgénicas. El nivel de expresión relativa se normalizó al del control actin. Los datos se presentan como media s/ desviación estándar (n . 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio | Ingredientes medianos | ||
| Mssa | Medio de Murashige y Skoog (MS) que contiene sacarosa en 30 g/L, y polvo de agar en 7 g/L, pH 5.8 | ||
| YEBARS | Manitol de levadura Medio (YEB) que contiene agar en polvo a 15 g/L, rifampicina a 50 mg/L y espectromicina a 50 mg/L, pH 7,0 | ||
| YEBRS | YEB que contiene rifampicina a 50 mg/L, y espectromicina a 50 mg/L, pH 7,0 | ||
| MSSAS | Medio MS que contiene sacarosa a 30 g/L y acetosyringona (AS) a 300 oM, pH 5,8 | ||
| MsSaa | Medio MS que contiene sacarosa a 30 g/L, polvo de agar a 7g/L y AS a 100oM, pH 5.2 | ||
| MSSACK | Medio EM que contiene sacarosa a 30 g/L, polvo de agar a 7 g/L, cefotaxime a 500 mg/L y kanamicina (kan) a 50 mg/L, pH 5,8 | ||
| MSSk | Medio DEscontentúa que contiene sacarosa a 30 g/L, y kan a 50 mg/L, pH 5,8 | ||
Tabla 1: Medios de comunicación y sus ingredientes.
| Cartilla | Secuencia (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTCCCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAAGCGGCCA | |
Tabla 2: Secuencia de imprimación.
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Discussion
La tuberculosis se ha utilizado en varios estudios relacionados con metabolitos secundarios a niveles genéticos y metabólicos1,2,5,27,28. El cultivo de raíces peludas, como fuente única para la producción de metabolitos, desempeña un papel fundamental en la ingeniería metabólica29 y se puede utilizar para alterar las vías metabólicas mediante la inserción de los genes relacionados. 2 inicialmente introdujeron el establecimiento de cultivos de raíces peludas de tuberculosis por A. rhizogenes-mediada transformación para lograr la producción de compuestos fenólicos. El contenido de rutina que obtuvieron en las raíces peludas de tuberculosis fue más de 10 veces mayor que el de las raíces de tipo salvaje. En el presente estudio, la introducción de FtMYB116 condujo a una mayor expresión de genes relacionados con la rutina y aumentó la producción de rutina en las raíces peludas de tuberculosis. Esta técnica se ha confirmado que es adecuada para la caracterización fenotípica y la expresión de genes relacionados con el fenilpropanoideo como FtF3H y FtFLS en raíces peludas TB5,,30,,31. 32 utilizaron raíces peludas de TB para investigar la producción de rutina mediante la sobreexpresión a una serie de factores transcripcionales ftMYB. 33 observaron una disminución en el contenido de rutina debido a la sobreexpresión de FtMYB11 en raíces peludas de tuberculosis. Estos resultados junto con nuestros hallazgos indican los efectos factibles de la transformación de la raíz peluda en la interacción entre los factores transcripcionales ftMYB y los genes relacionados con la biosíntesis de rutina.
Aunque hay datos limitados sobre un protocolo paso a paso para la inducción de raíces peludas de tuberculosis, aquí describimos el protocolo paso a paso por primera vez para obtener raíces peludas de tuberculosis transgénicas de una manera eficiente y estable utilizando A. rhizogenes que lleva un vector binario. Durante estos procesos experimentales, numerosos factores tienen que ser cuidadosamente considerados para obtener las raíces peludas inducidas óptimamente. En primer lugar, la selección de explantes es un factor determinante. Se sabe que los cultivares de tuberculosis afectan la morfología de las raíces peludas y la producción de compuestos fenólicos. 30 ilustraron que la expresión génica en la vía biosintética fenilpropanoidey y el contenido de compuestos fenólicos variaban entre los cultivares de tuberculosis. También encontraron raíces peludas en un cultivar, que era de color púrpura rojizo profundo debido a su contenido de antocianina13. En nuestro estudio, 2 recién desplegados cotiledos e hipocotileyos fueron seleccionados como los explantes. Esto se debe a que las hojas jóvenes y tiernas favorecen una alta tasa de inducción de la raíz peluda2,,30,mientras que las células vegetales muy diferenciadas y viejas afectan negativamente la inducción de la raíz peluda. En segundo lugar, la cepa de A. rhizogenes tiene un impacto significativo en la inducción de la raíz peluda. Diferentes cepas bacterianas exhiben diferentes habilidades transformadoras en términos de morfologías y eficiencia de inducción de raíces peludas, que pueden ser iluminadas por los diferentes plásmidos albergados por las cepas34. 35 compararon los efectos de varias cepas de A. rhizogenes (R1000, R1200, 15834, LBA9402 y A4) en la inducción de raíces peludas de tb y la biosíntesis fenilpropanoides y encontraron que la cepa más prometedora para la producción de raíces peludas en TB era R1000. Este hallazgo ha sido apoyado por Kim et al.2 Sin embargo, la cepa ACCC10060 que fue excluida en el estudio de Aye et al. pero utilizada en nuestro estudio exhibió una eficiencia satisfactoria de la infección. La esponjosa apariencia blanca de las raíces peludas obtenidas utilizando nuestro protocolo está de acuerdo con las raíces peludas generadas en Salvia miltiorrhiza36,donde se utilizó la misma cepa ACCC10060 portadora del vector binario pK7GWIWG2D (II) para silenciar el gen objetivo. En tercer lugar, el degerminación, incluido el pretratamiento de materiales y la concentración de cefotaxime en el cultivo selectivo, también desempeñan un papel vital en la inducción de la raíz peluda. La desinfección incompleta en cualquier paso podría conducir al fracaso de la transformación de la raíz peluda. Además, la concentración bacteriana tiene una influencia significativa en la producción de raíces transformadas. Las altas concentraciones pueden reducir las células vegetales por inhibición competitiva, mientras que las bajas concentraciones pueden causar baja disponibilidad4.
Además, las condiciones de cultivo como el medio de crecimiento, el tiempo apropiado de precultura y cocultura, y otros factores bióticos o abióticos juegan un papel importante en el inducton de raíz peluda. 37 recomendaron un medio de SM de 1/2 que contiene sacarosa a una concentración de 30 g/L para cocultivo para lograr las raíces peludas máximas de tuberculosis. Esto se puede explicar por el medio de sal alta que es adecuado para la formación de raíces peludas, mientras que un medio de sal baja favorece la multiplicación bacteriana excesiva34. AS es un tipo de compuesto fenólico que puede facilitar la transformación mediada por A. rizogenesen un número de especies vegetales por la transcripción de la región vir de Agrobacterium34,38,y vir podría ser efectivamente inducida en un medio con un pH de < 5.739,40. Por lo tanto, recomendamos un medio de cocultivo con pH 5.2 complementado con 100 M de AS. 37 informaron que las raíces peludas de la tuberculosis se tornaban marrones después del día 24 de color blanco y amarillo pálido. Por lo tanto, subcultivan raíces peludas cada 24 días; sin embargo, recomendamos suculir cada quince días para evitar el dorado de las raíces peludas. Además, las condiciones ambientales como la luz, las hormonas, la temperatura y la radiación UV parecen afectar a la expresión de genes relacionados con la biosíntesis flavonoide al estimular o deprimir la transducción deseñales 41,42. El estudio anterior ha demostrado la importancia de la luz muy roja en el monitoreo de la expresión génica relacionada con la rutina en raíces peludas de tuberculosis5.
La transformación mediada por A. rhizogenestiene la ventaja de que cualquier gen exógeno de interés insertado en un vector binario puede transferirse al clon de raíz peluda transformada34 para lograr la sobreexpresión, la pérdida de función a través del silenciamiento de ARN43,o el descubrimiento de nuevos genes metabólicos mediante análisis de transcriptoma5. Las raíces peludas tienen un gran potencial para producir metabolitos secundarios, proteínas recombinantes e incluso anticuerpos44. Esto se debe principalmente a su crecimiento fácil y rápido en medio libre de hormonas, siendo menos costoso, sin necesidad de regeneración en plantas completas21,y el rendimiento relativamente alto de metabolitos secundarios en comparación con el del material de la planta de partida31. Estas raíces también se pueden separar de la explanta original para establecer clones radiculares a largo plazo, estables y caracterizados manteniendo su capacidad biosintética y fenotipos. En conjunto, sobre la base de estos hallazgos, este protocolo proporciona un método rápido, distinto y eficiente para producir raíces peludas transformadas para investigar la producción de metabolitos secundarios y presenta una referencia para la inducción de raíces peludas en otras plantas. Sin embargo, el potencial de explorar cultivos de raíces peludas para generar rendimientos masivos de compuestos bioactivos depende del sistema de biorreactor adecuado en el que deben preocuparse ciertos parámetros, como el suministro deoxígeno, 4,8. Este protocolo se limita a la producción de metabolitos secundarios derivados de raíces peludas e investigar el fenotipo visualizado de genes funcionales como la varianza del color y el contenido de metabolitos secundarios; sin embargo, los cambios fenotípicos en toda la planta independientemente de la obtención de plantas regeneradas de las raíces peludas no pudieron ser evaluados en este estudio.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Fondos Fundamentales de Investigación para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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