Summary

Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes– trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.

Abstract

Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l’asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell’espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l’espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l’adattamento.

Introduction

Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate3.

Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)5,6 ed è comunemente accompagnato dall’integrazione e dall’espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa7. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni8. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside,in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, e i composti fenolici in23.13

Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie14. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e cicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche2. Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.21 ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l’iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) 22. Inoltre, Supaart et al.23 ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido1-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.

Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L’esperimento durò 5-6 settimane, dall’inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell’espianto, l’infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l’accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3′-hydroxylase (F3H), e flavonol synthase (FLS)24 sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l’espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.

Protocol

La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di “JinQiao No.2” coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1. NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente s…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosaQuesto studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall’inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzat…

Discussion

La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell’ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni corre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021

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Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).

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