Summary

Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.

Abstract

Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.

Introduction

Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.

Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.

Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.

Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3′-Hydroxylase (F3H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.

Protocol

Die in dieser Studie verwendete TB wurde bt18 genannt, die aus der Rasse “JinQiao No.2” stammt, die vom Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science angebaut wurde. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt. HINWEIS: Betreiben Sie Explanten-bezogene Manipulationen schnell, und halten Sie die Petrischalen nach Möglichkeit geschlossen, um Welken und Kontaminationen zu vermeiden. Sofern nicht …

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes-vermittelte TB haarige WurzeltransformationDiese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das eingerichtet wurde, um genetisch transformierte haarige Wurzeln mit A. rhizogeneszu erhalten. Es dauerte etwa 5-6 Wochen von der Impfung von TB-Samen bis zur Ernte der identifizierten haarigen Wurzeln, und einige wichtige Schritte sind in Abbildung 1 (A-H) dargestellt. Kurz gesagt, sterilisierte Schalensame…

Discussion

TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021

References

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

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Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).

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