एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीनद्वारा बालों की जड़ों को प्रेरित करना - ताररी अनाज में मध्यस्थता परिवर्तन (फेगोपिरम तार्टीकम)
Summary
हम एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीनद्वारा बालों की जड़ों को प्रेरित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं – ताररी अनाज(फेगोपिरम तारिकुम)में मध्यस्थता परिवर्तन। इसका उपयोग जीन कार्यों और तीखाअनाज में माध्यमिक मेटाबोलिट्स के उत्पादन की जांच करने के लिए किया जा सकता है, किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अपनाया जा सकता है, या सुधार के बाद अन्य औषधीय पौधों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
तारक अनाज (टीबी) [फेगोपिरम तार्टिक्यूम (एल.) गेटर्न] के पास विभिन्न जैविक और औषधीय गतिविधियां हैं क्योंकि इसमें फ्लेवोनॉइड, विशेष रूप से रूटिन जैसे प्रचुर मात्रा में द्वितीयक मेटाबोलाइट्स होते हैं। जीन कार्यों की जांच करने और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की उपज को बढ़ाने के लिए औषधीय पौधों में बालों वाली जड़ों को प्रेरित करने के लिए दुनिया भर में एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन का धीरे-धीरे उपयोग किया गया है। इस अध्ययन में, हमने टीबी में ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन किया है। 7-10 दिनों में कोटाइलेडन और हाइपोकोटिलालोनी एक्सिस को एक्सप्लांट ्स के रूप में चुना गया और बाइनरी वेक्टर ले जाने वाले ए राइज़ोजीन से संक्रमित किया गया, जिसने 1 सप्ताह के बाद दिखाई देने वाली साहसी बालों वाली जड़ों को प्रेरित किया। उत्पन्न बालों वाले रूट परिवर्तन की पहचान आकृति विज्ञान, प्रतिरोध चयन (कनकसिन) और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के आधार पर की गई थी। बाद में, बदल बालों वाली जड़ों को आवश्यकतानुसार स्वयं प्रचारित किया गया। इस बीच, एक myeloblastosis (MYB) प्रतिलेखन कारक, FtMYB116,टीबी जीनोम में बदल गया था ए rhizogenes-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों का उपयोग करने के लिए synthesizing flavonoids में FtMYB116 की भूमिका को सत्यापित करने के लिए । परिणामों से पता चला है कि फ्लेवोनॉयड से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति और फ्लेवोनॉइड यौगिकों (रूटिन और क्वेर्केटिन) की उपज को FtMYB116द्वारा प्रचारित (पी एंड एलटी; 0.01) काफी था, जो यह दर्शाता है कि ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों को जीन कार्यों और माध्यमिक मेटाबोलिट्स के उत्पादन की जांच करने के लिए एक प्रभावी वैकल्पिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। बालों की जड़ों को पैदा करने के लिए इस अध्ययन में वर्णित विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल समायोजन के बाद किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन या अन्य औषधीय पौधों के लिए अपनाया जा सकता है।
Introduction
तारक अनाज (टीबी)(Fagopyrum tataricum (एल.) Gaertn) जीनस Fagopyrum और बहुभुजों की पारिवारिक1से संबंधित डाइकोटिलेडन का एक प्रकार है । चीनी दवा के एक प्रकार के रूप में, टीबी अपनी विशिष्ट रासायनिक संरचना और रोगों के खिलाफ विविध जैव गतिविधियों के कारण काफी रुचि प्राप्त कर रहा है । टीबी मुख्य रूप से कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, विटामिन और कैरोटेनॉइड के साथ-साथ पॉलीफेनॉल जैसे फेनोलिक एसिड और फ्लेवोनॉइड1में समृद्ध है। फ्लेवोनॉइड की विभिन्न जैविक और औषधीय गतिविधियों, जिनमें एंटीऑक्सीडेटिव, एंटीहाइपरटेंसिव2और एंटी-भड़काऊ के साथ-साथ एंटीकैंसर और एंटीडायबिटिक गुणों का प्रदर्शन किया गया है,3का प्रदर्शन किया गया है ।
एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन एक मिट्टी जीवाणु है जो घाव साइटों4,,5को संक्रमित करके कई उच्च पौधों, विशेष रूप से डाइकोटिलेडोन में बालों वाली जड़ रोग के विकास में योगदान देता है। यह प्रक्रिया रूट-उत्प्रेरण (आरआई) प्लाज्मिड5,,6 में टी-डीएनए के हस्तांतरण द्वारा शुरू की जाती है और आमतौर पर री प्लाज्मिड से एक एक्सोजेनस जीन के एकीकरण और अभिव्यक्ति और बालों वाले रूट फेनोटाइप7को उत्पन्न करने के बाद के चरणों के साथ होती है। ए राइजोजीन-मध्यस्थताट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ें, पौधे जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में, एक छोटी अवधि में उनके स्थिर और उच्च उत्पादकता और आसान प्राप्त करने के कारण सबसे व्यापक रूप से उपयोग की गई हैं। इसके अलावा, ए राइजोजीन द्वारा प्रेरित बालों वाली जड़ें कुशलतापूर्वक उनके साहित्यिक जड़ विकास और हार्मोन मुक्त मध्यम8में अत्यधिक शाखाओं में बंटी वृद्धि से प्रतिष्ठित हैं। इनका उपयोग कृत्रिम बीज उत्पादन, रूट नोड्यूल अनुसंधान सहित अनुसंधान के कई क्षेत्रों में किया जा सकता है, और अन्य जीवों जैसे माइकोरिज़ल कवक, सूत्रकृमि और रूटरोगजनक7,,9के साथ बातचीत का अध्ययन करने में। इसके अलावा, बालों वाले रूट परिवर्तन संस्कृतियों को जैव रासायनिक रास्तों और रासायनिक सिग्नलिंग की जांच करने और फार्मास्यूटिकल्स, सौंदर्य प्रसाधन और खाद्य योजक8,,10के रूप में उपयोग किए जाने वाले पौधे माध्यमिक मेटाबोलाइटिस का उत्पादन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इंडोल एल्कलॉइड, एकोनिट्स, ट्रोपेन एल्कलॉइड, टेर्पेनॉइड और फ्लेवोनॉइड सहित मूल्यवान माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, जंगली प्रकार की बालों वाली जड़ों में संश्लेषित कई दशकों से जांच की गई है,2,जैसे पैनाक्स जिनसेंग11में जिनसेनोसाइड, अम्मी मज़स12 में कोमरीन12,और फिनोलिक यौगिक शामिल हैं।
बालों की जड़ों का उत्पादन किया गया है २७ परिवारों से ७९ पौधों की प्रजातियों में ए rhizogenes का उपयोग कर14। उदाहरण के लिए, सोयाबीन15,,16, साल्विया17, प्लंबागो इंडिका18, लोटस जैपोन्कस19,और कासनी(सिकोरियम इंटिबस एल) में ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाले जड़ परिवर्तन की सूचना दी गई है। 20. टीबी बालों वाले रूट ट्रांसफॉर्मेशन की भी जांच की गई है2. कुछ विस्तृत प्रोटोकॉल ए राइजोजीन द्वारा मध्यस्थता की गई बालों वाली जड़ों के विकास के बारे में उपलब्ध हैं या तो बाइनरी वेक्टर ले जाते हैं या नहीं। उदाहरण के लिए, सैंड्रा एट अल.21 ने जंगली प्रकार की शूटिंग में निरंतर ट्रांसजेनिक आलू बालों वाली जड़ों के उत्पादन की एक विधि पेश की। पूरी तरह से विकसित बालों वाली जड़ों को आलू के पौधों के स्टेम इंटरनोड्स में गस रिपोर्टर जीन ले जाने वाले ए राइजोजीन के इंजेक्शन के 5-6 सप्ताह बाद कल्पना की जा सकती है । एक अन्य अध्ययन में जूट(कोर्कोरस शिमला मिर्च एल) में गुसा रिपोर्टर जीन को शरण देने वाले ए राइजोजीन द्वारा प्रेरित ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ प्रणाली की भी सूचना दी गई थी । 22.इसके अलावा, सुपार्ट एट अल.23 ने टीएचसीए का उत्पादन करने के लिए 1-टेट्राहाइड्रोकैनाबिनोलिक1एसिड (THCA) सिंथेस के जीन को ले जाने वाली अभिव्यक्ति वेक्टर pBI121 के साथ बदल ए राइजोजीन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक तंबाकू बालों की जड़ें प्राप्त कीं।
हालांकि, बालों वाले जड़ परिवर्तन की एक प्रभावी पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया, विशेष रूप से टीबी में, अपेक्षाकृत कम प्रदर्शन किया गया है । इस अध्ययन में, हमने टीबी में बालों वाले रूट जेनेटिक ट्रांसफॉर्मेशन उत्पन्न करने के लिए रिपोर्टर जीन(जीएफपी),एक चयनात्मक मार्कर(कान),और ब्याज के जीन(b4),हमारे समूह से पहचाने गए लेकिन बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स(बीएचएलएच)परिवार से अप्रकाशित जीन) को ले जाने वाले ए राइज़ोजीन का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । प्रयोग 5-6 सप्ताह तक चला, बीजों के टीका से बालों वाली जड़ों के उत्पादन के लिए, एक्सप्लांट तैयारी, संक्रमण, coculturing, क्षत- भंग, और बाद में प्रचार शामिल है । इसके अलावा, ए राइजोजीन जिसमें एक बाइनरी प्लाज्मिड होता है जो माइलोप्लास्टिसिस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 116(FtMYB116)के टीबी ट्रांसजीन को ले जाता है, यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था कि क्या FtMYB116 टीबी बालों वाले रूट परिवर्तन के माध्यम से जीन और मेटाबोलिक स्तर पर टीबी में फ्लेवोनॉइड, विशेष रूप से रूटिन के संचय को बढ़ावा दे सकता है। FtMYB116,जो एक प्रकाश-प्रेरित प्रतिलेखन कारक है, विभिन्न प्रकाश स्थितियों5के तहत रुटिन के संश्लेषण को नियंत्रित करता है। चालकोन सिंथासे(सीएचएस),फ्लेवनोन-3-हाइड्रोक्सीलेस(एफ 3एच),फ्लेवोनॉइड-3′-हाइड्रोक्सीलेस(F3’H),और फ्लेवोनोल सिंथासे(FLS)24 रूटिन बायोसिंथेसिस के मेटाबोलिक मार्ग में शामिल प्रमुख एंजाइम हैं।H इसलिए, यह अध्ययन टीबी बालों वाली जड़ों में FtMYB116 की अतिअभिव्यक्ति और प्रमुख एंजाइम जीन की अभिव्यक्ति के साथ-साथ रूटिन की सामग्री और क्वेरसेटिन जैसे अन्य फ्लेवोनॉइड को दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीबी का उपयोग जेनेटिक और मेटाबोलिक स्तर1,2,5,,27,,28पर माध्यमिक मेटाबोलिट्स से संबंधित कई अध्ययनों में किया गया है . बालों वाली जड़ संस्कृति, मेट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को केंद्रीय लोक कल्याण अनुसंधान संस्थानों ZXKT17002 के लिए मौलिक अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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