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Genetics

एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीनद्वारा बालों की जड़ों को प्रेरित करना - ताररी अनाज में मध्यस्थता परिवर्तन (फेगोपिरम तार्टीकम)

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60828
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 4, 1, 3, 5, 1, 1,2
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

Summary

हम एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीनद्वारा बालों की जड़ों को प्रेरित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं - ताररी अनाज(फेगोपिरम तारिकुम)में मध्यस्थता परिवर्तन। इसका उपयोग जीन कार्यों और तीखाअनाज में माध्यमिक मेटाबोलिट्स के उत्पादन की जांच करने के लिए किया जा सकता है, किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अपनाया जा सकता है, या सुधार के बाद अन्य औषधीय पौधों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

तारक अनाज (टीबी) [फेगोपिरम तार्टिक्यूम (एल.) गेटर्न] के पास विभिन्न जैविक और औषधीय गतिविधियां हैं क्योंकि इसमें फ्लेवोनॉइड, विशेष रूप से रूटिन जैसे प्रचुर मात्रा में द्वितीयक मेटाबोलाइट्स होते हैं। जीन कार्यों की जांच करने और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की उपज को बढ़ाने के लिए औषधीय पौधों में बालों वाली जड़ों को प्रेरित करने के लिए दुनिया भर में एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन का धीरे-धीरे उपयोग किया गया है। इस अध्ययन में, हमने टीबी में ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन किया है। 7-10 दिनों में कोटाइलेडन और हाइपोकोटिलालोनी एक्सिस को एक्सप्लांट ्स के रूप में चुना गया और बाइनरी वेक्टर ले जाने वाले ए राइज़ोजीन से संक्रमित किया गया, जिसने 1 सप्ताह के बाद दिखाई देने वाली साहसी बालों वाली जड़ों को प्रेरित किया। उत्पन्न बालों वाले रूट परिवर्तन की पहचान आकृति विज्ञान, प्रतिरोध चयन (कनकसिन) और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के आधार पर की गई थी। बाद में, बदल बालों वाली जड़ों को आवश्यकतानुसार स्वयं प्रचारित किया गया। इस बीच, एक myeloblastosis (MYB) प्रतिलेखन कारक, FtMYB116,टीबी जीनोम में बदल गया था ए rhizogenes-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों का उपयोग करने के लिए synthesizing flavonoids में FtMYB116 की भूमिका को सत्यापित करने के लिए । परिणामों से पता चला है कि फ्लेवोनॉयड से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति और फ्लेवोनॉइड यौगिकों (रूटिन और क्वेर्केटिन) की उपज को FtMYB116द्वारा प्रचारित (पी एंड एलटी; 0.01) काफी था, जो यह दर्शाता है कि ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाली जड़ों को जीन कार्यों और माध्यमिक मेटाबोलिट्स के उत्पादन की जांच करने के लिए एक प्रभावी वैकल्पिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। बालों की जड़ों को पैदा करने के लिए इस अध्ययन में वर्णित विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल समायोजन के बाद किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन या अन्य औषधीय पौधों के लिए अपनाया जा सकता है।

Introduction

तारक अनाज (टीबी)(Fagopyrum tataricum (एल.) Gaertn) जीनस Fagopyrum और बहुभुजों की पारिवारिक1से संबंधित डाइकोटिलेडन का एक प्रकार है । चीनी दवा के एक प्रकार के रूप में, टीबी अपनी विशिष्ट रासायनिक संरचना और रोगों के खिलाफ विविध जैव गतिविधियों के कारण काफी रुचि प्राप्त कर रहा है । टीबी मुख्य रूप से कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, विटामिन और कैरोटेनॉइड के साथ-साथ पॉलीफेनॉल जैसे फेनोलिक एसिड और फ्लेवोनॉइड1में समृद्ध है। फ्लेवोनॉइड की विभिन्न जैविक और औषधीय गतिविधियों, जिनमें एंटीऑक्सीडेटिव, एंटीहाइपरटेंसिव2और एंटी-भड़काऊ के साथ-साथ एंटीकैंसर और एंटीडायबिटिक गुणों का प्रदर्शन किया गया है,3का प्रदर्शन किया गया है ।

एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन एक मिट्टी जीवाणु है जो घाव साइटों4,,5को संक्रमित करके कई उच्च पौधों, विशेष रूप से डाइकोटिलेडोन में बालों वाली जड़ रोग के विकास में योगदान देता है। यह प्रक्रिया रूट-उत्प्रेरण (आरआई) प्लाज्मिड5,,6 में टी-डीएनए के हस्तांतरण द्वारा शुरू की जाती है और आमतौर पर री प्लाज्मिड से एक एक्सोजेनस जीन के एकीकरण और अभिव्यक्ति और बालों वाले रूट फेनोटाइप7को उत्पन्न करने के बाद के चरणों के साथ होती है। ए राइजोजीन-मध्यस्थताट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ें, पौधे जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में, एक छोटी अवधि में उनके स्थिर और उच्च उत्पादकता और आसान प्राप्त करने के कारण सबसे व्यापक रूप से उपयोग की गई हैं। इसके अलावा, ए राइजोजीन द्वारा प्रेरित बालों वाली जड़ें कुशलतापूर्वक उनके साहित्यिक जड़ विकास और हार्मोन मुक्त मध्यम8में अत्यधिक शाखाओं में बंटी वृद्धि से प्रतिष्ठित हैं। इनका उपयोग कृत्रिम बीज उत्पादन, रूट नोड्यूल अनुसंधान सहित अनुसंधान के कई क्षेत्रों में किया जा सकता है, और अन्य जीवों जैसे माइकोरिज़ल कवक, सूत्रकृमि और रूटरोगजनक7,,9के साथ बातचीत का अध्ययन करने में। इसके अलावा, बालों वाले रूट परिवर्तन संस्कृतियों को जैव रासायनिक रास्तों और रासायनिक सिग्नलिंग की जांच करने और फार्मास्यूटिकल्स, सौंदर्य प्रसाधन और खाद्य योजक8,,10के रूप में उपयोग किए जाने वाले पौधे माध्यमिक मेटाबोलाइटिस का उत्पादन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इंडोल एल्कलॉइड, एकोनिट्स, ट्रोपेन एल्कलॉइड, टेर्पेनॉइड और फ्लेवोनॉइड सहित मूल्यवान माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, जंगली प्रकार की बालों वाली जड़ों में संश्लेषित कई दशकों से जांच की गई है,2,जैसे पैनाक्स जिनसेंग11में जिनसेनोसाइड, अम्मी मज़स12 में कोमरीन12,और फिनोलिक यौगिक शामिल हैं।

बालों की जड़ों का उत्पादन किया गया है २७ परिवारों से ७९ पौधों की प्रजातियों में ए rhizogenes का उपयोग कर14। उदाहरण के लिए, सोयाबीन15,,16, साल्विया17, प्लंबागो इंडिका18, लोटस जैपोन्कस19,और कासनी(सिकोरियम इंटिबस एल) में ए राइजोजीन-मध्यस्थताबालों वाले जड़ परिवर्तन की सूचना दी गई है। 20. टीबी बालों वाले रूट ट्रांसफॉर्मेशन की भी जांच की गई है2. कुछ विस्तृत प्रोटोकॉल ए राइजोजीन द्वारा मध्यस्थता की गई बालों वाली जड़ों के विकास के बारे में उपलब्ध हैं या तो बाइनरी वेक्टर ले जाते हैं या नहीं। उदाहरण के लिए, सैंड्रा एट अल.21 ने जंगली प्रकार की शूटिंग में निरंतर ट्रांसजेनिक आलू बालों वाली जड़ों के उत्पादन की एक विधि पेश की। पूरी तरह से विकसित बालों वाली जड़ों को आलू के पौधों के स्टेम इंटरनोड्स में गस रिपोर्टर जीन ले जाने वाले ए राइजोजीन के इंजेक्शन के 5-6 सप्ताह बाद कल्पना की जा सकती है । एक अन्य अध्ययन में जूट(कोर्कोरस शिमला मिर्च एल) में गुसा रिपोर्टर जीन को शरण देने वाले ए राइजोजीन द्वारा प्रेरित ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ प्रणाली की भी सूचना दी गई थी । 22.इसके अलावा, सुपार्ट एट अल.23 ने टीएचसीए का उत्पादन करने के लिए 1-टेट्राहाइड्रोकैनाबिनोलिक1एसिड (THCA) सिंथेस के जीन को ले जाने वाली अभिव्यक्ति वेक्टर pBI121 के साथ बदल ए राइजोजीन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक तंबाकू बालों की जड़ें प्राप्त कीं।

हालांकि, बालों वाले जड़ परिवर्तन की एक प्रभावी पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया, विशेष रूप से टीबी में, अपेक्षाकृत कम प्रदर्शन किया गया है । इस अध्ययन में, हमने टीबी में बालों वाले रूट जेनेटिक ट्रांसफॉर्मेशन उत्पन्न करने के लिए रिपोर्टर जीन(जीएफपी),एक चयनात्मक मार्कर(कान),और ब्याज के जीन(b4),हमारे समूह से पहचाने गए लेकिन बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स(बीएचएलएच)परिवार से अप्रकाशित जीन) को ले जाने वाले ए राइज़ोजीन का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । प्रयोग 5-6 सप्ताह तक चला, बीजों के टीका से बालों वाली जड़ों के उत्पादन के लिए, एक्सप्लांट तैयारी, संक्रमण, coculturing, क्षत- भंग, और बाद में प्रचार शामिल है । इसके अलावा, ए राइजोजीन जिसमें एक बाइनरी प्लाज्मिड होता है जो माइलोप्लास्टिसिस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 116(FtMYB116)के टीबी ट्रांसजीन को ले जाता है, यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था कि क्या FtMYB116 टीबी बालों वाले रूट परिवर्तन के माध्यम से जीन और मेटाबोलिक स्तर पर टीबी में फ्लेवोनॉइड, विशेष रूप से रूटिन के संचय को बढ़ावा दे सकता है। FtMYB116,जो एक प्रकाश-प्रेरित प्रतिलेखन कारक है, विभिन्न प्रकाश स्थितियों5के तहत रुटिन के संश्लेषण को नियंत्रित करता है। चालकोन सिंथासे(सीएचएस),फ्लेवनोन-3-हाइड्रोक्सीलेस(एफ 3एच),फ्लेवोनॉइड-3'-हाइड्रोक्सीलेस(F3'H),और फ्लेवोनोल सिंथासे(FLS)24 रूटिन बायोसिंथेसिस के मेटाबोलिक मार्ग में शामिल प्रमुख एंजाइम हैं।H इसलिए, यह अध्ययन टीबी बालों वाली जड़ों में FtMYB116 की अतिअभिव्यक्ति और प्रमुख एंजाइम जीन की अभिव्यक्ति के साथ-साथ रूटिन की सामग्री और क्वेरसेटिन जैसे अन्य फ्लेवोनॉइड को दर्शाता है।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली टीबी को BT18 नाम दिया गया था, जो शांक्सी एकेडमी ऑफ एग्रीकल्चरल साइंस के छोटे विविध अनाज के अनुसंधान केंद्र द्वारा खेती की गई "जिंकिओ नंबर 2" की नस्ल से उत्पन्न हुआ था । इस प्रोटोकॉल के प्राथमिक चरणोंको चित्र 1 में दर्शाया गया है ।

नोट: एक्सप्लांट्स से संबंधित हेरफेर को तेजी से संचालित करें, और जब संभव हो, पेट्री व्यंजन को मुरझाने और संदूषण से बचने के लिए बंद रखें। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता, तब तक सभी एक्सप्लांट इन्क्यूबेशन 14-एच प्रकाश और 10-एच डार्क फोटोपीरियड की स्थिति में 25 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किए गए थे। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है, सभी एक्सप्लांटया बैक्टीरिया से संबंधित ऑपरेशन एक लैमिनार प्रवाह हुड में असेप्टिक परिस्थितियों में किए गए थे। ए राइजोजीन और इन विट्रो प्लांट संस्कृतियों के लिए सभी मीडिया सामग्री तालिका 1में प्रदान की जाती हैं । पीएच को एडजस्ट करने के बाद सभी मीडिया को 20 मिन के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव किया गया। 9 सेमी व्यास के पेट्री डिश में मीडियम के 25 मिलील भरकर जम कर मीडिया तैयार किया गया और उसे जमना हो गया।

सावधानी: सभी आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया और पौधों को उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में जमा करें। सभी खतरनाक रसायनों को एक धुएं की अलमारी में संचालित करें और खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में जमा करें।

1. टीबी एक्सप्लांट की तैयारी

  1. टीबी के बीज ों की तैयारी
    1. 2 साल से अधिक समय से −20 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर संरक्षित किए गए मोटा और अक्षतिग्रस्त टीबी बीज(चित्रा 1A1)का चयन करें।
    2. बीज को लगभग 20 00 00 के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर पानी में भिगो दें ताकि बीज कोट को आसानी से छीलया जा सके(चित्रा 1A2)। यदि आवश्यक हो, तो छीलने की सुविधा के लिए बीजों पर एक स्लॉट काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  2. टीबी के बीजों की नसबंदी
    1. 100-200 खुली बीजों को 100 मिलीग्राम निष्फल शंकुता फ्लास्क में रखें।
    2. 30 एस के लिए 75% इथेनॉल का उपयोग कर बीज कीटाणुरहित।
    3. इथेनॉल को 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट से बदलें और 15 मिन के लिए कीटाणुरहित करें।
      नोट: 8 न्यूनतम के लिए 1 ग्राम/एल की एकाग्रता पर पारा बिक्लोराइड का उपयोग करके संक्रमण अपर्याप्त नसबंदी के किसी भी मामले में सोडियम हाइपोक्लोराइट को बदलने के लिए एक वैकल्पिक स्टरलाइजर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
      सावधानी: बुध bichloride खतरनाक है और पर्यावरण के अनुकूल सामग्री नहीं है । इसे नाराज अलमारी में संचालित करें और खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में जमा करें, यदि पारा बिक्लोराइड का उपयोग किसी भी मामले में किया जाता है।
    4. सोडियम हाइपोक्लोराइट डालें।
    5. बाँझ deionized पानी का उपयोग कर बीज 5 बार धोलें।
    6. बीज एक बाँझ द्विबुलस कागज के साथ सूखी दाग।
  3. टीबी के रोपण की तैयारी
    1. 300 मीटर पौधे टिश्यू कल्चर बॉटल में 30 ग्राम/एल सुक्रोज और 7 जी/एल एगर पाउडर(एमएसएसए) (टेबल 1)के साथ पूरक 50 मीटर मुरुशिगे और स्कूग (एमएस) बेसल मीडियम (1962) तैयार करें।
    2. ऑटोक्लेविंग से पहले पीएच को 5.8 पर समायोजित करें।
    3. एमएसएसए माध्यम की प्रति बोतल समान रूप से 10 बीज वितरित करें।
    4. 7-10 दिनों के लिए प्रकाश स्थिति के तहत 25 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक संस्कृति कक्ष में बीज अंकुरित करें।
  4. बाँझ एक्सप्लांट की तैयारी
    1. टीबी के मजबूत रोपण(चित्रा 1सी)का चयन करें, जब कोटाइलेडन के 2 टुकड़े सामने आते हैं।
    2. जड़ों से रोपण काटें(चित्रा 1सी लाल-डैश एरोहेड्स),माध्यम के साथ संपर्क से बचने।
    3. उन्हें बाँझ पेट्री डिश में रखें।
    4. हाइपोकोटाइल को 0.8-1 सेमी सेगमेंट में काट लें, और कोटाइलेडन को लगभग 0.5 सेमी टुकड़ों में काट लें।
    5. 24 घंटे के लिए प्रकाश स्थिति के तहत एमएसएसए माध्यम पर इन एक्सप्पी को प्रीकल्चर करें।
    6. उन्हें 100 मीटर बंध्याकृत शंकुता में स्थानांतरित करें, जो अब संक्रमण के लिए तैयार हैं।

2. परिवर्तन के लिए ए राइजोजीन की तैयारी

नोट: ए rhizogenes तनाव ACCC10060 कृपया औषधीय संयंत्र विकास संस्थान द्वारा प्रदान की गई थी और −80 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया गया था। ए राइजोजीन बाइनरी वेक्टर pK7GWIWG2D (II) के साथ बदल गया था जो एक संकेतक जीन के रूप में जीएफपी के साथ बी4 जीन और एक चुनिंदा मार्कर के रूप में कान प्रतिरोध जीन को ले जाने वाले टी-डीएनए को बंदरगाह ों । जीन b4 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बीएचएलएच परिवार का सदस्य है, जिसे अभी तक प्रकाशित नहीं किया गया है । टीबी बालों वाली जड़ों की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, ए राइजोजीन को बाइनरी वेक्टर pK7WG2D के साथ बदल दिया गया था जिसमें MYB116 जीन युक्त जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर और मेटाबोलिक विश्लेषणों के स्तर पर फ्लेवोनॉइड जैसे माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के उत्पादन पर इसके प्रभाव की जांच करने के लिए । सक्रिय ए राइजोजीन को एक्सप्लांट्स के साथ एक ही समय में अच्छी तरह से तैयार किया जाना चाहिए।

  1. ए राइजोजीन की सक्रियता
    1. बर्फ पर गल ए राइजोजीन
    2. बैक्टीरिया डुबकी और उन्हें समान रूप से खमीर manitol माध्यम (YEB) पर लाइन 15 जी/एल आगर पाउडर, ५० मिलीग्राम/एल rifampicin, और ५० मिलीग्राम/एल स्पेक्ट्नोमाइसिन (YEBARS, पीएच ७.०) के साथ पूरक ।
    3. बैक्टीरिया को 12-16 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
    4. एक मोनोक्लोनल कॉलोनी चुनें और इसे एक ही ऊपर वर्णित तरीके से एक और पेट्री डिश में संस्कृति करें।
    5. मोनोक्लोनल कॉलोनियों का चयन करें और उन्हें 100 मिलीग्राम निष्फल शंकुता फ्लास्क में संस्कृति करें जिसमें वाईबी मीडियम के 20 मिलील के साथ 50 मिलीग्राम/एल रिफामपिसिन और 50 मिलीग्राम/एल स्पेक्ट्नोमाइसिन (YEBRS, पीएच 7.0) के साथ पूरक होता है, जब तक कि ओडी600 मूल्य 2.0 तक पहुंच जाता है।
    6. इनक्यूबेट 2% -एक और 100-mL शंकुक फ्लास्क में उपरोक्त संस्कृति का 4% जिसमें 28 डिग्री सेल्सियस पर YEBRS मध्यम का 20 मिलीएल और 4-5 घंटे के लिए 200 आरपीएम शामिल है जब तक कि ओडी600 मूल्य लगभग 0.5(चित्रा 1डी)तक नहीं पहुंचजाता।

3. टीबी एक्सप्लांट्स का संक्रमण और जांच

नोट: इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आनुवंशिक रूप से बदल बालों वाली जड़ों को प्राप्त करना है। ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए जंगली प्रकार की जड़ों का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, ए राइजोजीन को बाइनरी वेक्टर के साथ बदल दिया गया था या तो pK7WG2D FtMYB116 या pK7GWIWG2D (II) के जीन को पहले से बी 4 ले जा रहा था।

  1. ए राइजोजीन का पुनर्सस्पेंशन
    1. चरण 2.1.6 में प्राप्त संस्कृति को 50-0-एमएल स्टर्किग्यूगल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 4,000 x ग्राम पर स्पिन।
    3. सुपरनेट को हटा दें और 30 ग्राम/एल सुक्रोज और 300 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन (एएस) (एमएसएसएएस, पीएच 5.8) से ओडी600 0.2 के साथ पूरक एमएस मीडियम के साथ बैक्टीरियल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
  2. एक्सप्लांट्स का संक्रमण
    1. चरण 3.1.3 में प्राप्त बैक्टीरियल निलंबन को एक शंकुत्मक फ्लास्क में संचार करें जिसमें 10 मिन(चित्रा 1ई)के लिए चरण 1.4.6 में तैयार एक्सप्लांट शामिल हैं।
    2. एक्सप्लांट्स को बाहर निकालें, और उन्हें बाँझ बिबुलस पेपर का उपयोग करके सूखा दागें।

4. ए राइजोजीन के साथ एक्सप्लांट्स की सहसंस्कृति

  1. एमएस मीडियम पर बाँझ 9 सेमी व्यास का फिल्टर पेपर रखें, जो 30 जी/एल सुक्रोज और 100 माइक्रोन एएस (एमएसएसएएएस मीडियम, पीएच 5.2) के साथ पूरक 7 जी/एल एगर पाउडर का उपयोग करके जम जाता है।
  2. फिल्टर पेपर पर एक्सप्लांट्स को अंधेरे में 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ओवरले करें(चित्रा 1एफ)।

5. प्रेरण और चयनात्मक संस्कृति

  1. एमएसएसए मीडियम पर लगभग 20 संक्रमित एक्सप्लांट ्स रखें जो 500 मिलीग्राम/एल सेफोटैक्सीमे और 50 मिलीग्राम/एल कनकमिन (कान) (एमएससैक, पीएच 5.8)(चित्रा 1जी)के साथ पूरक हैं।
  2. उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश की स्थिति के तहत खड़ी इनक्यूबेट करें। बालों की जड़ें ऊष्मायन के लगभग 1 सप्ताह बाद होती हैं(चित्रा 1एच ब्लैक-डैश एरोहेड बालों वाली जड़ों की घटना का संकेत देते हैं)।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो हर 15 दिनों में MSSACK माध्यम की जगह ।

6. टीबी बालों वाली जड़ों को अधीन करना

नोट: इस प्रक्रिया का उद्देश्य जोरदार बालों वाली जड़ों को फसल करना है। नियमित रूप से प्रचार के दौरान बालों वाली जड़ों के विकास का निरीक्षण करें, और दूषित और निष्क्रिय लोगों को समय पर हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो अधिक बालों वाली जड़ों का प्रचार करने के लिए निम्नलिखित चरणों को दोहराएं। फसल को सबक्यूल करने से लगभग 10-14 दिन लगते हैं।

  1. सफेद उपस्थिति और तेजी से विकास दिखा बालों वाली जड़ों का चयन करें।
  2. उन्हें 2-3 सेमी के टुकड़ों में काट लें।
  3. स्पष्ट रूप से उन्हें एक साफ बेंच पर संख्या ।
  4. उन्हें 100 मिलीग्राम बंध्याकरण शंकुगत फ्लास्क में उपसंस्कृति, जिसमें एमएस मीडियम के 5 मिलील 30 ग्राम/एल सुक्रोज और 50 मिलीग्राम/एल कान (एमएसएसके, पीएच 5.8) के साथ पूरक किया गया था, जब तक कि वे फ्लास्क के नीचे तक फैल नहीं जाते(चित्रा 1I)।

7. बदल बालों वाली जड़ों और संरक्षण की पहचान

नोट: रूपविज्ञान और जीन स्तर के पहलुओं के आधार पर बदल बालों वाली जड़ों की पहचान की जा सकती है। पहचान बालों वाले रूट जीनोम और प्रतिरोध के अनुसार भी आयोजित की जा सकती है, जो इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं। यह प्रक्रिया मुख्य रूप से रिपोर्टर जीन और लक्ष्य जीन पहचान पर केंद्रित है ।

  1. tawny और दूषित बालों वाली जड़ों को हटा दें और सफेद उपस्थिति वाले लोगों का चयन करें।
  2. मूल्यांकन करें कि क्या नीले/हल्के दोहरे पराबैंगनी ट्रांसलिमिनर के तहत हरी फ्लोरेसेंस है।
  3. गिने ट्यूबों में एक मजबूत फ्लोरेसेंस संकेत का प्रदर्शन बालों वाली जड़ों का चयन करें या उन्हें एक शोषक कागज के साथ सुखाने के बाद एक चिह्नित टिनेफॉइल का उपयोग करके लपेटा गया।
  4. उन्हें तरल नाइट्रोजन में लिओफिलाइज करें, जिसके बाद आगे की जांच के लिए सभी फसल को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया गया।
  5. जीन पहचान
    1. तरल नाइट्रोजन में ठीक पाउडर में बालों की जड़ों के 0.1 ग्राम ट्राइटुरेट करें।
    2. पौधे जीनोमिक डीएनए किट के निर्माता के निर्देश के अनुसार संशोधित सेटाइलट्रीमेथिलम्मोनियम ब्रोमाइड (सीटैब) विधि25 का उपयोग करटीबी की स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइनों का जीनोमिक डीएनए तैयार करें।
    3. टेबल 2में सूचीबद्ध जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर के 100 एनजी का उपयोग करके पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।
    4. प्रवर्धन चक्र को इस प्रकार करें: 5 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रीडेनेटुशन, 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डेन्टुजन, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एनीलिंग, और 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एक्सटेंशन। 36 चक्रों और 10 वर्ष के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार चरण के बाद, 1% अगारोज जैल पर प्रवर्धन उत्पादों का विश्लेषण करें।
    5. नाभिक एसिड धुंधला के साथ जैल दाग और यूवी प्रकाश के तहत उन्हें कल्पना।

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Representative Results

एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन-मध्यस्थता टीबी बालों वाले रूट ट्रांसफॉर्मेशन
यह अध्ययन कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो ए राइजोजीनका उपयोग करके आनुवंशिक रूप से रूप से रूपांतरित बालों वाली जड़ों को प्राप्त करने के लिए स्थापित किया गया था। टीबी के बीजों की टीका से लेकर पहचाने गए बालों की जड़ों की कटाई तक लगभग 5-6 सप्ताह लगे, और कुछ महत्वपूर्ण चरणों को चित्रा 1 (ए-एच)में चित्रित किया गया है। संक्षेप में, निष्फल खोले गए बीजों को तेजी से बाँझ अंकुरण प्राप्त करने के लिए टीका लगाया गया था(चित्रा 1बी)। A. राइज़ोजीन (चित्रा 1डी)और बाँझ एक्सप्लांट ्स को क्रमशः सक्रिय और पहले से तैयार किया जाना चाहिए। इसके बाद कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए जाते हैं, जिनमें सक्रिय ए राइज़ोजीन (चित्रा 1ई),सहसंस्कृति(चित्रा 1एफ),और चयनात्मक संस्कृति(चित्रा 1जी)के साथ एक्सप्लांट्स का संक्रमण शामिल है। संक्रमित एक्सप्लांट्स को जम एमएस माध्यम पर समान रूप से रखा जाना चाहिए और विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों को आसानी से अलग करने के लिए उनके बीच अंतरिक्ष को बनाए रखा जाना चाहिए। बालों वाली जड़ें एक्सप्लांट्स(चित्रा 1एच)के घाव साइटों में एक साहित्यिक तरीके से शराबी सफेद रंग के साथ दिखाई देती हैं। बालों वाली जड़ें एक अत्यधिक शाखाकृत और एक इंटरलॉक मैट्रिक्स बनाती हैं और आवश्यकतानुसार प्रचारित की जा सकती हैं(चित्र 1I)। काटे गए बालों वाली जड़ों का उपयोग जीन फ़ंक्शन या जीन- या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, टीबी बालों वाली जड़ों को नामित बायोरिएक्टरों में रूटिन जैसे माध्यमिक मेटाबोलिट्स की उपज के लिए बड़े पैमाने पर प्रचारित किया जा सकता है।

टीबी में ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों को प्रेरित करने की विधि को एक बाइनरी वेक्टर(pK7GWIWG2D (II)का उपयोग करके प्रमाणित किया गया है, जिसमें जीन जीएफपी और बी 4 (ट्रांसक्रिप्शनल फैक्टर बीएचएलएच परिवार का सदस्य, अभी तक प्रकाशित नहीं हुआ है)। रिपोर्टर जीन जीएफपी का उपयोग नीले/हल्के दोहरे पराबैंगनी ट्रांसलिलाइट ट्रांसलिमिनेटर(चित्रा 2)के तहत संकेत की कल्पना करके या लक्ष्य जीन(चित्रा 3)की पहचान करके ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ों को गैर-ट्रांसजेनिक लोगों से आसानी से अलग करने के लिए किया गया था । बदल बालों वाली जड़ों ने नीले या पराबैंगनी प्रकाश के तहत प्रकाशित होने पर हरे रंग की फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया (चित्रा 2एमें काले तीरका का उपयोग करके प्रतिनिधित्व किया), जबकि अबदल बालों वाली जड़ों ने हरे रंग की फ्लोरेसेंस(चित्रा 2बी)का प्रदर्शन नहीं किया। एक उच्च GFP संकेत के साथ बालों वाली जड़ों को एक पखवाड़े के लिए प्रचारित किया गया था, जैसा कि चित्रा 2सीमें सचित्र है ।

यह और पहचानने के लिए कि क्या बाइनरी वेक्टर को टीबी जीनोम में सफलतापूर्वक रूप ांतरित किया गया है, जीन पहचान आयोजित की गई थी । संक्षेप में, संशोधित सीटैब विधि25के आधार पर पीसीआर विश्लेषण के लिए टीबी बालों वाली जड़ों का पौधे जीनोमिक डीएनए तैयार किया गया था। पीसीआर जीन(कान, जीएफपी,और बी 4)को बढ़ाना, जो क्रमशः चित्रा 3में मौजूद था। प्राइमर तालिका 2में सूचीबद्ध हैं । सभी ट्रांसजेनिक लाइनों(चित्रा 3,लेन 5-11)में 3 जीन की उपस्थिति से संकेत मिला कि बाइनरी वेक्टर को टीबी जीनोम में सफलतापूर्वक रूपांतरित कर दिया गया है। कान और जीएफपी जंगली प्रकार की जड़ों(चित्रा3, लेन 3)और प्रायोगिक नकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 3,लेन 4)में अनुपस्थित थे, जबकि जंगली प्रकार की जड़ों में बी 4 का पता चला था । इन 3 जीनों को निस्संदेह सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 3,लेन 2)में प्रस्तुत किया गया था लेकिन वे नकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 3,लेन 4)में जाहिरा तौर पर अनुपस्थित थे ।

उपरोक्त बालों वाली जड़ प्रणाली का उपयोग करटीबी में प्रकाश-प्रेरित प्रतिलेखन कारक FtMYB116 का मूल्यांकन
FtMYB116 बालों वाले रूट इंडक्शन के उपरोक्त प्रोटोकॉल को नियोजित करके व्यक्त किया गया था। यह जीन FtMYB116 को बाइनरी वेक्टर pK7WG2D में डालने और फिर जीन अतिअभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए ए राइजोजीन के साथ संक्रमित करके पूरा किया गया था। संक्षेप में, 0.1 ग्राम की बालों वाली जड़ों को तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके ठीक पाउडर में त्रिकोणीकृत किया गया था। प्लांट आरएनए आइसोलेशन किट26के निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कुल आरएनए निकाला गया । फिर रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर और रियल टाइम पीसीआर को एफटीआईवाईबी116 को बढ़ाने और रूटिन संश्लेषण मार्ग से संबंधित जीन को बढ़ाने के लिए किया गया था। बाद में रुटिन संश्लेषण से संबंधित जीन अभिव्यक्ति और रुटिन की उपज पर FtMYB116 के नियामक प्रभावों का सत्यापन किया गया ।

चित्रा 4ए टीबी बालों वाली जड़ों की ट्रांसजेनिक लाइनों में FtMYB116 की सापेक्ष अभिव्यक्ति को दर्शाता है। नियंत्रण समूह की तुलना में, FtMYB116 की सापेक्ष अभिव्यक्ति ने सभी 3 स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइनों में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया। चित्र4बी और चित्रा 4सी FtMYB116 अतिअभिव्यक्ति के माध्यम से मेटाबोलिक स्तर पर रूटिन और क्वेरसेटिन के बायोसिंथेसिस के प्रचार को दर्शाते हैं। ट्रांसजेनिक में रूटिन और क्वेर्सेटिन की सामग्री में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई(पी एंड एलटी; ०.०१) जंगली प्रकार के लोगों की तुलना में क्रमशः ४० और ०.५ मिलीग्राम/जी एफडब्ल्यू तक पहुंच गई, जो जंगली प्रकार के 8 गुना थे । सभी 3 ट्रांसजेनिक लाइनों में सीएचएस, एफ 3एच, एफ 3एचऔर एफएलएस के सापेक्ष जीन अभिव्यक्तियां नियंत्रण समूह(चित्र4डी)की तुलना में उल्लेखनीय रूप से अधिक थीं। एक साथ, इन परिणामों ने पुष्टि की कि इस अध्ययन में वर्णित रणनीति का सफलतापूर्वक टीबी में बालों वाले जड़ परिवर्तन उत्पन्न करने और द्वितीयक मेटाबोलाइट्स की जीन अभिव्यक्ति और मेटाबोलिक यील्ड की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: टीबी में ए राइजोजीन-मध्यस्थताट्रांसजेनिक बालों की जड़ों को प्रेरित करने की प्रक्रियाएं। महत्वपूर्ण चरणों की प्रतिनिधि छवियां प्रदर्शित की जाती हैं:(A1)और(A2)बीज कोट को छीलने से पहले और बाद में प्रतिनिधित्व करते हैं; (ख)एमएसएसए माध्यम युक्त ऊतक की बोतल में टीका लगाने वाले प्रत्येक 10 बीजों का प्रतिनिधित्व करता है; (ग)टीका के 7-10 दिनों में टीबी के रोपण को दर्शाता है, और लाल-डैश एरोहेड काटने के बिंदु दिखाते हैं; (डी)और(ई) क्रमशः ए राइज़ोजीन (ओडी600 = 0.5) और एक्सप्लांट्स के संक्रमण की तैयारी का संकेत देते हैं; (एफ)और(जी)क्रमशः एमएसएसएएएस माध्यम पर सक्रिय ए राइजोजीन और एमएससैक माध्यम पर चयनात्मक खेती के साथ coculturing का प्रतीक है; बालों वाली जड़ें(एच)से निकलतीहैं, जैसा कि ब्लैक-डैश एरोहेड्स द्वारा दिखाया गया है; और(I)बालों वाली जड़ गठन के प्रचार को दर्शाता है; काले डैश तीर सिर प्रेरित बालों वाली जड़ों का संकेत देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जीएफपी रिपोर्टर जीन ले जाने वाले बाइनरी वेक्टर का परिवर्तन। (क)नीले/हल्के दोहरे पराबैंगनी ट्रांसलिलाइटर के तहत जांच की गई चयनात्मक संस्कृति के बाद प्रेरित बालों वाली जड़ों को दर्शाता है । (ख)और(सी)क्रमशः जंगली प्रकार की जड़ और रूपांतरित बालों वाली जड़ों के प्रचार का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 7 स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइनों में जंगली प्रकार की जड़ और टीबी की बालों वाली जड़ों से अलग जीनोमिक डीएनए से जीन(कान, जीएफपीऔर बी 4)का पीसीआर प्रवर्धन। (A):कान,(बी):GFP,(C):b4 । लेन 1:आणविक आकार मार्कर (सफेद तीर सिर 750 बीपी इंगित करता है), लेन 2:प्लाज्मिड (बाइनरी वेक्टर pK7GWIWG2D (II) कान, GFP,और b4 जीन ले जाने के रूप में, लेन 3:जंगली प्रकार की जड़, लेन 4:शुद्ध एच2ओ नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, और लेन 5-11:7 स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइनें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: टीबी बालों वाली जड़ों की ट्रांसजेनिक लाइनों में FtMYB116 की सापेक्ष अभिव्यक्ति । (ए)और(बी)रुटिन और(सी)क्वेरसेटिन (इस आंकड़े को दांग एट अल5)के बायोसिंथेसिस पर FtMYB116 की अतिअभिव्यक्ति का बढ़ावा प्रभाव । त्रिपली में प्रयोग किए गए और 3 बार आयोजित किए गए। "**" छात्र के टी-टेस्टका उपयोग करके पी एंड एलटी; 0.01 में एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है। (D)ट्रांसजेनिक लाइनों में फ्लेवोनॉयड संश्लेषण मार्गों से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति । सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को ऐक्टिन नियंत्रण के लिए सामान्य ीकृत किया गया था। डेटा मतलब ± मानक विचलन (एन = 3) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मीडिया मध्यम सामग्री
एमएसएसए मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मध्यम जिसमें 30 ग्राम/एल में सुक्रोज युक्त, और 7 ग्राम/एल, पीएच 5.8 में एगर पाउडर
येबार्स खमीर Mannitol मध्यम (YEB) 15 ग्राम/एल पर आगर पाउडर युक्त, ५० मिलीग्राम/एल पर रिफामिसिन, और ५० मिलीग्राम/एल, पीएच ७.० पर स्पेक्ट्नोमाइसिन
येब्रस YEB ५० मिलीग्राम/एल पर rifampicin युक्त, और ५० मिलीग्राम/एल, पीएच ७.० पर स्पेक्ट्नोमाइसिन
एमएसएसएस एमएस माध्यम 30 ग्राम/एल पर सुक्रोज युक्त, और एसीटोसिरिंगोन (एएस) ३०० माइक्रोन, पीएच ५.८ पर
एमएसएसएए एमएस माध्यम 30 ग्राम/एल पर सुक्रोज युक्त, 7g/L पर आगर पाउडर, और के रूप में 100μM, पीएच ५.२ पर
एमएससैक एमएस मीडियम जिसमें 30 ग्राम/एल, 7 जी/एल पर एगर पाउडर, 500 मिलीग्राम/एल पर सेफोटैक्सीमे, और 50 मिलीग्राम/एल, पीएच 5.8 पर कानामाइसिन (कान) पर सुक्रोज युक्त
एमएसएसके एमएस माध्यम 30 ग्राम/एल पर सुक्रोज युक्त, और कान ५० मिलीग्राम/एल, पीएच ५.८ पर

तालिका 1: मीडिया और उनकी सामग्री।

प्राइमर अनुक्रम (5'-3')
जीएफपी-एफ CCACAAGTTCAGCGTGTCCCCG
जीएफपी-आर AAGTTCACCTTGATGCTCTCTCTCTC
बी4-एफ AAATCTTTTCCCTGTGG
बी4-आर ATGCCATCATTGCCAAG
कान-एफ ATTCGGCTATGACTGCAC
कान-आर TGAATCCAGAAAAaGCCCA

तालिका 2: प्राइमर अनुक्रम।

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Discussion

टीबी का उपयोग जेनेटिक और मेटाबोलिक स्तर1,2,5,,27,,28पर माध्यमिक मेटाबोलिट्स से संबंधित कई अध्ययनों में किया गया है . बालों वाली जड़ संस्कृति, मेटाबोलाइट उत्पादन के लिए एक अद्वितीय स्रोत के रूप में, मेटाबोलिक इंजीनियरिंग29 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और संबंधित जीन डालने के द्वारा मेटाबोलिक रास्तों को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । किम एट अल2 शुरू में फेनोलिक यौगिकों के उत्पादन को प्राप्त करने के लिए ए राइजोजीन-मध्यस्थतापरिवर्तन द्वारा टीबी बालों वाली जड़ संस्कृतियों की स्थापना शुरू की । टीबी बालों वाली जड़ों में उन्होंने जो रूटिन हासिल की, उसकी सामग्री जंगली प्रकार की जड़ों की तुलना में 10 गुना अधिक थी । वर्तमान अध्ययन में, FtMYB116 की शुरूआत के कारण रुटिन से संबंधित जीन की अधिक अभिव्यक्ति हुई और टीबी बालों वाली जड़ों में रुटिन के उत्पादन में उछाल आया । इस तकनीक को टीबी बालों वाली जड़ों5, 30,,31में एफटीएफ3एच और एफटीएफएएलएस जैसे फिनाइलप्रोपेनॉयड से संबंधित जीन ों के फेनोटाइप लक्षण वर्णन और अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त होने की पुष्टि कीगईहै । झांग एट अल३२ ने FtMYB प्रतिलेखन कारकों की एक श्रृंखला को ओवरव्यक्त करके रूटिन के उत्पादन की जांच करने के लिए टीबी बालों वाली जड़ों का इस्तेमाल किया । झोउ एट अल३३ टीबी बालों वाली जड़ों में FtMYB11 की अतिअभिव्यक्ति के कारण रूटिन की सामग्री में कमी देखी गई । ये परिणाम हमारे निष्कर्षों के साथ मिलकर FtMYB प्रतिलेखन कारकों और रूटिन बायोसिंथेसिस से संबंधित जीन के बीच बातचीत पर बालों वाले जड़ परिवर्तन के व्यवहार्य प्रभावों का संकेत देते हैं ।

यद्यपि टीबी बालों वाली जड़ों को शामिल करने के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल के बारे में सीमित डेटा हैं, हम यहां पहली बार ट्रांसजेनिक टीबी बालों वाली जड़ों को एक कुशल और स्थिर तरीके से प्राप्त करने के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बाइनरी वेक्टर ले जाने वाले ए राइजोजीन का उपयोग करके एक कुशल और स्थिर तरीके से ट्रांसजेनिक टीबी बालों वाली जड़ों को प्राप्त करते हैं। इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान, इष्टतम प्रेरित बालों वाली जड़ों को प्राप्त करने के लिए कई कारकों को सावधानीपूर्वक विचार करना होगा। सबसे पहले, एक्सप्लांट्स का चयन एक निर्धारक कारक है। टीबी की खेती बालों वाली जड़ों की आकृति विज्ञान और फेनोलिक यौगिकों के उत्पादन को प्रभावित करने के लिए जानी जाती है। थावे एट अल30 ने फिनाइलप्रोपेनॉयड बायोसिंथेटिक पाथवे में जीन अभिव्यक्ति और टीबी की खेती के बीच फिनॉलिक यौगिकों की सामग्री को दर्शाया । उन्हें एक खेती में बालों वाली जड़ें भी मिलीं, जो अपनी एंथोसाइनिन सामग्री13के कारण गहरे लाल-बैंगनी थीं । हमारे अध्ययन में, 2 बस सामने आया cotyledons और हाइपोकोटाइल्स explants के रूप में चुना गया । इसका कारण यह है कि युवा और निविदा पत्ते एक उच्च बालों वाली जड़ प्रेरण दर2,,30के पक्ष में हैं, जबकि अत्यधिक विभेदित और पुराने पौधे की कोशिकाएं बालों वाली जड़ प्रेरण को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करती हैं। दूसरा, ए राइजोजीन के तनाव बालों वाले रूट इंडक्शन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । विभिन्न जीवाणु उपभेदों में आकृतियों और बालों वाली जड़ों की प्रेरण दक्षता के संदर्भ में विभिन्न परिवर्तन क्षमताओं का प्रदर्शन होता है, जिन्हें उपभेदों34द्वारा बंदरगाह किए गए विभिन्न प्लाज्मिडद्वारा प्रकाशित किया जा सकता है। Aye एट अल.35 कई ए राइजोजीन उपभेदों (R1000, R1200, 15834, LBA9402, और A4) टीबी बालों वाले जड़ प्रेरण और फेनिलप्रोपेनॉइड बायोसिंथेसिस पर प्रभाव की तुलना में और पाया कि टीबी में बालों जड़ उत्पादन के लिए सबसे आशाजनक तनाव R1000 था। इस खोज किम एट अल2 द्वारा समर्थित किया गया है फिर भी, तनाव ACCC10060 कि Aye एट अल के अध्ययन में बाहर रखा गया था, लेकिन हमारे अध्ययन में इस्तेमाल संतोषजनक संक्रमण दक्षता का प्रदर्शन किया । हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त बालों वाली जड़ों की शराबी सफेद उपस्थिति साल्विया मिल्तिओर्राइज़ा36में उत्पन्न बालों वाली जड़ों के साथ समझौते में है, जिसमें बाइनरी वेक्टर pK7GWIWG2D (II) को लक्षित जीन को शांत करने के लिए एक ही तनाव ACCC10060 ले जाने का उपयोग किया गया था। तीसरा, सामग्री के पूर्वउपचार और चयनात्मक संस्कृति में सेफोटैक्सीम की एकाग्रता सहित डीजर्मिनिंग भी बालों की जड़ प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। किसी भी कदम में अधूरा संक्रमण बालों वाले जड़ परिवर्तन की विफलता का कारण बन सकता है। इसके अलावा, बैक्टीरियल एकाग्रता का परिवर्तित जड़ों के उत्पादन पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। उच्च सांद्रता प्रतिस्पर्धी अवरोध से पौधों की कोशिकाओं को कम कर सकती है, जबकि कम सांद्रता कम उपलब्धता का कारण बन सकती है4।

इसके अलावा, विकास माध्यम, उपयुक्त प्रीक्यूल्चरिंग और सहरूपता समय, और अन्य बायोटिक या अजैविक कारक जैसी संस्कृति की स्थिति बालों वाली जड़ प्रेरक में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हुआंग एट अल३७ की सिफारिश की 1/2 एमएस मध्यम सहखेती के लिए 30 ग्राम /एल की एकाग्रता पर सुक्रोज युक्त अधिकतम टीबी बालों वाली जड़ों को प्राप्त करने के लिए । यह उच्च नमक माध्यम द्वारा समझाया जा सकता है जो बालों वाली जड़ गठन के लिए उपयुक्त है, जबकि एक कम नमक माध्यम अत्यधिक बैक्टीरियल गुणा34का पक्ष लेता है। जैसा कि एक प्रकार का फेनोलिक यौगिक है जो एग्रोबैक्टीरियम34,,38के वीर क्षेत्र के ट्रांसक्रिप्शन द्वारा कई पौधों की प्रजातियों में ए राइज़ोजीन-मध्यस्थता परिवर्तन की सुविधा प्रदान कर सकता है, और वीर को प्रभावी रूप से एक माध्यम में प्रेरित किया जा सकता है जिसमें 5.739,,40का पीएच है। इसलिए, हम पीएच 5.2 के साथ एक सहसंस्कृति माध्यम की सलाह देते हैं, जो 100 माइक्रोन के साथ पूरक है। हुआंग एट अल३७ ने बताया कि टीबी बालों वाली जड़ें सफेद और पीले पीले रंग से 24 दिन के बाद भूरे रंग की ओर मुड़ गईं । इसलिए, वे हर 24 दिनों में बालों वाली जड़ों को उपसंस्कार करते हैं; हालांकि, हम बालों वाली जड़ों के ब्राउनिंग से बचने के लिए हर पखवाड़े को सबकुल्चर करने की सलाह देते हैं । इसके अलावा, प्रकाश, हार्मोन, तापमान और यूवी विकिरण जैसी पर्यावरणीय स्थितियां अत्यधिक उत्तेजक या निराशाजनक संकेत ट्रांसड्यूक्शन41,,42द्वारा फ्लेवोनॉइड बायोसिंथेसिस से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती दिखाई देती हैं। पिछले अध्ययन में टीबी बालों वाली जड़ों5में रूटिन से संबंधित जीन अभिव्यक्ति की निगरानी में दूर लाल बत्ती के महत्व का प्रदर्शन किया गया है ।

ए राइजोजीन-मध्यस्थतापरिवर्तन का लाभ यह है कि बाइनरी वेक्टर में डाले गए ब्याज के किसी भी बहिर्जात जीन को अतिअभिव्यक्ति, आरएनए के माध्यम से हानि-समारोह को प्राप्त करने के लिए परिवर्तित बालों वाले रूट क्लोन34 में स्थानांतरित किया जा सकताहै,या ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण द्वारा नए मेटाबोलिक जीन की खोज5। बालों वाली जड़ों में माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन और evenantibodies44का उत्पादन करने की अपार क्षमता होती है। यह मुख्य रूप से हार्मोन मुक्त माध्यम में उनके आसान और तेजी से विकास के कारण है, कम खर्चीला होने के नाते, पूर्ण पौधों में उत्थान के लिए कोई आवश्यकता नहींहै 21,और प्रारंभिक संयंत्र सामग्री31की तुलना में माध्यमिक चयापचय की अपेक्षाकृत उच्च उपज । इन जड़ों को दीर्घकालिक, स्थिर और विशेषता रूट क्लोन स्थापित करने के लिए मूल एक्सप्लांट से अलग किया जा सकता है जो उनकी बायोसिंथेटिक क्षमता और फेनोटाइप को बनाए रखते हैं। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों के आधार पर, यह प्रोटोकॉल माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के उत्पादन की जांच करने के लिए रूपांतरित बालों वाली जड़ों का उत्पादन करने के लिए एक त्वरित, अलग और कुशल विधि प्रदान करता है और अन्य पौधों में बालों वाली जड़ प्रेरण के लिए एक संदर्भ प्रस्तुत करता है। हालांकि, बायोएक्टिव यौगिकों की भारी पैदावार उत्पन्न करने के लिए बालों वाली जड़ संस्कृतियों का पता लगाने की क्षमता उपयुक्त बायोरिएक्टर प्रणाली पर निर्भर करती है जिसमें ऑक्सीजन की आपूर्ति जैसे कुछ मापदंडों का संबंध4,,8होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल बालों वाली जड़ों में प्राप्त माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के उत्पादन और रंग के विचरण और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की सामग्री जैसे कार्यात्मक जीन के दृश्यफेक्टिव फेनोटाइप की जांच करने तक सीमित है; हालांकि, बालों वाली जड़ों से पुनर्जीवित पौधों की प्राप्ति की परवाह किए बिना पूरे पौधे में फेनोटाइपिक परिवर्तन ों का मूल्यांकन इस अध्ययन में नहीं किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को केंद्रीय लोक कल्याण अनुसंधान संस्थानों ZXKT17002 के लिए मौलिक अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021

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<em>एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन</em>द्वारा बालों की जड़ों को प्रेरित करना - ताररी अनाज में मध्यस्थता परिवर्तन (<em>फेगोपिरम तार्टीकम)</em>
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