Summary
이 프로토콜은 싱크로트론 기반 X선 흡수 분광법 실험을 위한 생물학적 냉동 샘플을 준비하기 위한 상세한 절차를 제시합니다. 우리는 암 및 식물성 플랑크톤 세포를 사용한 프로토콜의 예를 통해 샘플 준비 및 냉동 보존을 최적화하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 방법은 샘플 냉동 준비의 보편적 인 표준을 제공합니다.
Abstract
X 선 흡수 분광법 (XAS)을 가진 원소에 대한 연구는 생물학적 시스템에서 금속의 역할을 연구 할 때 특히 중요합니다. 샘플 준비는 특히 생물학적 샘플의 경우 중요하고 종종 복잡한 절차입니다. X선 종분화 기술이 널리 사용되고 있지만, 이 기술의 사용자를 위한 상세한 프로토콜은 아직 보급되지 않았다. 또한, 화학적 상태 변형이 우려되며, 냉동 기반 기술은 세포 또는 조직의 화학적 완전성의 최대 보존을 제공하기 위해 그들의 거의 자연적인 수화 상태에서 생물학적 샘플을 분석하는 것이 좋습니다. 여기에서, 우리는 냉동 보존 샘플에 기초한 세포 준비 프로토콜을 제안한다. 그것은 암세포에서 셀레늄에 대한 높은 에너지 분해능 형광 검출 X 선 흡수 분광법 연구와 식물성 플랑크톤의 철분 연구에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 조사에 의해 손상될 수 있는 다른 생물학적 샘플 및 다른 X선 기술과 함께 사용될 수 있다.
Introduction
필수 또는 독성 요소의 세포 생물 변환에 대한 연구는 높은 감도의 종분화 기술을 필요로하며 종종 화학 종의 변형되기 쉬운 샘플 준비 단계를 최소화해야합니다.
셀레늄 및 철과 같은 생리 원소는 복잡한 화학, 셀레늄 또는 철 종의 다양한 안정성, ppm (mg / kg) 또는 심지어 ppm 이하 범위의 낮은 농도로 인해 지정하기가 특히 어려운 것으로 알려져 있습니다. 따라서 XAS에 의한 이러한 요소의 종분화에 대한 연구는 매우 어려울 수 있습니다. 싱크로트론 XAS 및 특히 매우 낮은 신호 대 배경 비율1을 허용하는 고에너지 분해능 형광 검출 XAS (HERFD-XAS)는 싱크로트론 소스에서 복잡한 생물학적 매트릭스 2,3에서 고도로 희석된 원소를 지정하기 위해 사용할 수 있다. 기존의 형광-XAS 측정은 유럽 싱크로트론 방사 시설(ESRF)4의 CRG-FAME 빔라인에서 에너지 대역폭이 150–250eV에 달하는 에너지 분해 고체 상태 검출기(SSD)를 사용하여 수행할 수 있으며, HERFD-XAS 측정에는 ESRF2의 CRG-FAME-UHD 빔라인에서 에너지 대역폭이 ~1–3eV인 크리스탈 분석기 분광계(CAS)가 필요합니다. . 형광 광자는 각각 전자 또는 광학 공정으로 에너지에 대해 차별됩니다.
샘플 냉동 준비는 구조를 보존하고 조성 화학적 완전성을 유지하는 데 필수적이며, 따라서 생물학적 자연 상태에 가까운 분석을 허용합니다5. 또한 액체 헬륨 극저온 냉각(LN2)을 사용하여 최저 10K의 극저온에서 수행된 분석을 통해 방사선 손상이 느려지고 XAS의 원소 종분화를 보존할 수 있습니다. 생물학적 샘플에 적용된 XAS 기술에 대한 일부 리뷰가 극저온 조건에서 샘플을 준비하고 분석 할 필요성을보고하지만 (예 : Sarret et al.6, Porcaro et al.7), 이들 중 어느 것도 관련 세부 프로토콜을 명확하게 설명하지 않습니다. 이 간행물에서, 암 세포 및 플랑크톤 미생물의 냉동-제조 방법이 극저온에서Se8 및Fe9 의 HERFD-XAS 종분화에 대해 기술되어 있다.
최첨단 XAS 분광법 측정 중 샘플 준비 및 환경에 대한 좋은 관행은 1) 설정이 필요합니다. 2) 방사선 손상의 영향을 가능한 한 제한하는 분석 절차; 및 3) X선 광자 빔 크기에 대하여 가능한 한 균질한 샘플(또는 모델 화합물 참조)을 포함한다. 첫 번째 항목은 액체 헬륨 냉동 스탯을 사용하여 저온에서 수집을 수행하여 고려됩니다. 두 번째 항목은 빔에 대해 이동함으로써 샘플의 새로운 영역에서 각 획득을 수행함으로써 처리됩니다. 마지막으로, 세 번째 조건을 고려하여, 샘플(펠릿) 및 참조(분말)는 가능한 한 다공성 및 불균질성을 제한하고, X선 프로브된 샘플 표면 상의 빔 크기에 대하여 거칠기를 피하기 위해 가압된 벌크 펠릿으로 조절된다. 우리는 프로토콜이 이러한 모든 점을 어떻게 처리하는지 설명합니다.
우리는 인간 전립선 세포주 PC-3 (높은 전이성 전위)와 난소 세포주 OVCAR-3 (모든 난소 암 사례의 최대 70 %를 차지함)을 사용하여 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)의 암세포에 대한 항 증식 특성을 조사하고 Phaeodactylum tricornutum diatom을 모델 종으로 사용하여 식물성 플랑크톤의 철 격리를 조사했습니다.
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Protocol
1. 셀레늄 종분화를 위한 인간 PC-3 및 OVCAR-3 암세포 펠렛의 제조
참고: 다음 프로토콜은 Weekley et al.10에서 채택되었습니다. 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 레벨 2 조건 및 제한 하에서 세포 배양 후드 하에서 수행되어야합니다.
- Malassez 셀 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수하십시오. PC-3 세포주를 위해 플라스크 당 150,000-200,000 세포를 시드하고 OVCAR-3 세포주에 대해 300,000 세포를 시드한다.
- T-75 플라스크 내의 종자 세포(삼중을 갖기 위해 조건 당 3개의 플라스크)를 층류 후드 하에 적절한 세포 배양 배지(표 1)에 넣는다.
- 세포 배양물을 80% 합류에 도달할 때까지 37°C의 인큐베이터 및 5%CO2 로 가습된 분위기에서 성장시키도록 방치한다. 일반적으로 PC-3 전립선암 세포주는 24시간 후에 두 배, OVCAR-3 난소암 세포주는 72시간이 걸립니다. 플라스크는 인큐베이터에 두어야합니다.
- 한편, 처리에 사용된 Se-NPs를 세포독성 평가를 위한 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법에 의해 미리 결정되어 있는 IC20에 해당하는 최종 농도(세포사멸 달성 억제 농도)로 희석한다. 이들 농도는 각 Se-NPs 유형에 특이적이지만 또한 연구된 세포주에 특이적이다.
- 나노입자 원액(소 혈청 알부민[BSA] 또는 키토산 코팅 Se-NPs 2mg/mL)을 실온(RT)에서 30분 동안 초음파 수조에 넣습니다.
- Se-NPs 용액을 완전한 세포 배양 배지에서 연속 희석하여 작동 농도에 도달하십시오. 각 희석액 사이에, 1분 동안 와류.
- 치료를 위해 희석 된 셀레늄 염으로 셀레늄 양성 대조군을 준비하십시오.
- 15mL 폴리프로필렌 튜브에 나트륨 나트륨 수용액(1mg/mL)을 준비합니다. 셀레나이트 나트륨 분말 1mg을 초순수 1mL와 섞는다.
- 1 분 동안 원액을 소용돌이 치십시오.
- 나트륨 셀레나이트 원액을 완전한 세포 배양 배지에서 연속 희석하여 작동 농도에 도달하도록 희석하십시오.
참고 : 용액을 균질화하기 위해 각 희석 전에 여러 번 피펫팅하는 것을 잊지 마십시오.
- 암세포를 셀레늄 치료에 노출시킵니다.
참고: 프로토콜의 이 부분은 테스트된 각 나노입자(NP)에 대해 반복되어야 합니다. 여기서, NP는 BSA와 키토산 코팅된 Se-NPs와 대조군의 두 가지 유형이다. 나트륨 셀레나이트 용액은 양성 대조군이며 치료는 음성 대조군이 아닙니다.- 층류 후드에서 셀이 들어있는 세 개의 T-75 플라스크를 엽니다.
- 배지를 제거하고 세포를 5 mL의 가온 (37°C) 인산완충식염수(PBS)로 2x 부드럽게 세척하였다.
- 부드럽게, 플라스크의 바닥면에 세포층 상에 직접 있지 않고, 25 mL 멸균 플라스틱 피펫이 장착된 자동 피펫을 사용하여 각 플라스크에 처리된 15 mL를 첨가한다. 플라스크에 뚜껑을 놓습니다. 뚜껑을 단단히 닫지 마십시오.
참고: 단계 1.3 및 1.4에 설명된 바와 같이, 치료 용액은 균질화되기 위해 미리 재현탁되어야 한다. - 세 개의 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 수평으로 두고 24시간 동안 5%CO2 로 가습된 분위기에 방치한다.
- 세포 펠렛의 제조
- 세포를 2x 가온 PBS 5 mL (37°C)로 T75 플라스크에서 직접 부드럽게 세척한다.
- 10 mL 멸균 플라스틱 피펫이 장착된 피펫보이를 사용하여 T-75 플라스크 내의 세포층 상에 가온된 세포 배양 배지 6 mL를 첨가한다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 부드럽게 긁어서 세포를 수집하십시오. 플라스크 당 하나의 셀 스크레이퍼를 사용하십시오.
- 피펫 보이와 10 mL 피펫을 사용하여 액체를 흡인하고 모든 세포를 수집하기 위해 플라스크 표면의 세포 / 배지를 다시 플러시하십시오. 이 단계를 여러 번 반복하여 세포를 해리시키고 개별화하십시오. 세포를 함유하는 배지를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 수집한다.
- RT에서 5 분 동안 250 x g 에서 아래로 회전하십시오. 상층액을 흡인하십시오.
- 세포를 5 mL의 PBS에 재현탁시켜 헹구었다.
- RT에서 5분 동안 250 x g 에서 아래로 회전하십시오. 상층액을 흡인하고 1.6.5 및 1.6.6 2x 단계를 반복하여 치료의 나머지 모든 흔적을 제거하십시오.
- 세포를 1 mL의 PBS에 재현탁시키고 이를 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 내로 옮긴다. 마지막으로, 이들을 RT에서 5분 동안 250 x g 에서 스핀다운시킨다. 도 1 은 상층액을 원심분리 및 폐기한 후에 수득된 세포 펠릿을 나타낸다.
- 200 μL 피펫을 사용하여 모든 PBS 상청액을 부드럽게 제거하였다.
참고: 셀 펠릿을 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오. 이상적으로 펠렛은 높이 2-3mm 또는 두께이어야하며 직경은 3-6mm이어야합니다. PC-3 세포주의 경우, 9 x 10 6-10 x 106 세포가 분석에 필요합니다. OVCAR-3 세포주의 경우 8 x 10 6-9 x 106 세포가 필요합니다 (그림 1). 일부 세포는 후속 버퍼 헹굼 단계 동안 손실 될 가능성이 큽니다. 세포 수가 높을수록 펠릿이 더 좋아집니다.
- 세포 펠릿의 플래시 냉동
- 펠릿을 포함하는 1.5 mL 튜브의 바닥 부분을 액체 질소(LN2)로 플런지하여 셀 펠릿의 수준으로 떨어뜨린다.
- 질소 가스와 같은 불활성 분위기로 완전히 퍼징된 글로브 박스에서 LN 2 냉각 구리 블록의 평평한 표면에 있는 1.5mL 튜브를 부드럽게 탭핑하여 셀 펠릿을 수집합니다(그림 2). 펠릿은 이어서 세포 손실 없이 수집된다.
참고: LN2 취급을 위해 냉동 보호 장비, 실험실 코트, 닫힌 신발, 냉동 장갑 및 안면 보호막 또는 안전 고글을 사용하십시오. - 필요한 경우 LN2 냉각 바늘을 사용하여 펠렛을 꺼내는 데 도움을 줄 수 있습니다.
주: 생성된 동결 세포 펠릿은 단편화될 수 있다. 이 단계는 몇 분 동안 수행되어야하며 연구자의 손재주와 속도에 의존해야합니다. - 냉동 펠릿 치수는 냉동 샘플 홀더에 맞아야 합니다. 설명 된 장비를 사용하여 셀 펠릿의 높이가 2mm보다 크고 XAS에 사용 된 샘플 홀더의 구멍보다 약간 작은 경우 샘플을 직접 사용할 수 있습니다. 그렇지 않거나 분석을 위해 평평한 표면이 필요한 경우 벌크 원통형 펠렛을 제조하여 펠렛을 냉동 상태로 유지해야합니다. 세포 펠릿이 단편화되는 경우, 다음 단계는 불활성 분위기로 완전히 퍼징된 글로브 박스에서 이상적으로 사용될 수 있다.
- 벌크 냉동 원통형 펠렛의 제조
- LN2 의 샘플과 접촉할 수동 유압 프레스의 모든 부품을 담그십시오(그림 3A, 직경 3A 또는 5mm 펠릿 다이, 금형, 피스톤/와이어 풀링).
- 급속히 얼어붙은 펠릿 단편을 적절한 펠릿 다이가 로딩된 몰드 내로 옮긴다(도 3B).
- 유압 프레스로 빠른 펠릿화. 직경 5mm 펠릿의 경우 1.5톤, 직경 3mm 펠릿의 경우 0.5톤을 사용하면 충분합니다(그림 3C).
참고 : 유압 프레스로 각 펠렛을 준비한 후 나머지 서리 및 습도에 대한 문제를 피하기 위해 질소 가스를 사용하여 모든 재료를 해동하고 적절하게 건조시켜야합니다. - 냉동 세포의 벌크 펠렛을 신속하게 수집하여 보관을 위해 적절한 냉동 튜브에 넣으십시오.
- 장기 보관을 위해 LN2 탱크에 다시 보관하십시오.
- 분석을 위해 냉동 펠릿을 이송하고 장착하십시오. LN2 냉각 냉동 튜브에 저장된 펠릿은 액체N2 의 77K 사전 냉각 냉동 샘플 홀더로 이송됩니다 (그림 4, CRG-FAME-UHD 빔라인에 사용 됨). 이 단계는 가능한 한 빨리 수행해야 하지만 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 그런 다음 샘플 홀더를 냉동 상태로 옮기고 전체 XAS 분석 중에 10K로 유지하십시오.
참고: 1.9.3 및 1.9.6 단계는 피스톤과 몰드를 차단하는 서리 형성을 피하기 위해 신속하게 수행해야 하기 때문에 어렵습니다. 대안은 질소 가스로 완전히 정화 된 플라스틱 텐트 아래에서 이러한 단계를 수행하는 것입니다. LN2-쿨 구리 덩어리는 펠릿이 냉동 상태로 유지되도록 합니다.
2. 철 종분화를 위한 플랑크톤 세포의 제조
참고: 이 프로토콜에 사용된 합성 해수는 pH = 7.9에서 초순수 해염, 모르폴리노 프로판술폰산, 질산암모늄, 질산나트륨, 메타규산염 오수화물, 인산나트륨 일염기성, 비타민 스톡, 미량 금속 스톡, 항생제 스톡 및 HEPES 버퍼를 첨가하여 제조하였다. 각 성분의 농도는 물질의 표에 표시되어 있습니다. 문화에 대한 자세한 내용은 Sutak et al.11에서 찾을 수 있습니다.
- P. 트리코누툼 규조류 배양물을 50 mL 폴리프로필렌 튜브에서 6분 동안 1,100 x g으로 원심분리하고, 펠렛을 신선한 배지가 있는 플라스크로 옮긴다.
- 배양물을 24 시간 동안 성장 챔버의 합성 바닷물에서 자라게하십시오.
- 플랑크톤 배양물을 1,100 x g 에서 6분 동안 원심분리하고, 펠렛을 Fe-시트레이트(최종 배양물에서 1 μM)를 함유하는 신선한 배지로 옮긴다. 72 시간 동안 배양하십시오.
- 플랑크톤 세포 준비
- 세포를 1,100 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 철분이 없는 배지로 헹구었다.
- 펠렛을 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 초순수로 세척하고, 1,100 x g에서 3분 동안 2x 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.
- 단계 1.8에 기재된 바와 같이 펠렛을 함유하는 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브의 바닥 부분을LN2 에 플런지시킨다.
- 동결된 세포를LN2 냉동 땜납으로 옮기고 단계 1.9에 설명된 대로 XRF 펠릿 프레스(그림 3 및 도 7)를 사용하여 신속하게 가압한다.
- 펠릿을 제거하고 LN2 탱크에 보관하여 장기간 보관하십시오.
- 단계 1.9.6을 따르십시오(냉동 샘플 홀더 내로의 이송에 대해서는 그림 4 참조).
3. 참조 화합물 제조 및 측정
참고: 생물학적 시스템에서 발견될 것으로 예상되는 종의 대표 참조 화합물(고체 또는 액체)은 실험 생물학적 샘플과의 비교를 위해 XAS에 의해 제조 및 분석되어야 한다. 기준 스펙트럼은 또한 데이터베이스(12,13,14)에서 발견될 수 있고, 측정 조건(예를 들어, 스펙트럼 분해능)이 실험 샘플과 유사하다면 사용될 수 있다.
- 수용액에서의 참고를 위해, 혐기성 조건 또는 불활성 분위기 하에서 분말 또는 액체 형태의 초기 화합물을 칭량한다. 산화환원 민감성 참조를 불활성 분위기(즉, 혐기성 글로브 박스 또는 슐렌크 라인에서, 도 5 및 도 6 참조)에서 제조하여 산화환원 환원 반응을 피하고 주변 공기에서 매우 반응성이고 불안정할 수 있는 화합물의 화학적 완전성을 보존한다. 여기서, 모든 셀레늄 기준은 Schlenk 라인과 탈기된 초순수를 사용하여 제조되었다(도 6). 액체 FeIII-말레이트 및 페리틴을 주변 공기에서 제조하였다.
- 형광 모드에서 수집하기 위해 연구된 원소(즉, 셀레늄 또는 철)의 최종 농도가 1% wt에 도달하기 위해 적절한 용액과 혼합한다.
참고: 초순수는 XAS 참조를 준비하는 데 가장 자주 사용되는 솔루션입니다. 얼음 결정으로 X 선 회절로 인해 발생하는 아티팩트를 방지하고 고체 상태 검출기로 수집 된 XAS 신호의 품질을 보존하기 위해 표준 XAS 형광을 사용하여 측정 한 액체에 글리세롤 (15 % -20 %)의 첨가가 필요합니다. 그러나 HERFD-XAS의 경우 글리세롤은 필수는 아닙니다. 고체 검출기 대신 결정 분석기 분광계를 사용하여 에너지는 매우 높은 해상도로 선택되며 얼음 결정에 의해 유도 된 회절은 연구 된 요소1의 데이터 수집에 영향을 미치지 않습니다. - 제조된 용액을 샘플과 동일한 조건에서 측정될 때까지 밀봉된 Schlenk 풍선(그림 5) 또는 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브에 보존하고 보관하십시오.
- 고체 참조를 위해, 셀레늄 또는 철 모델 화합물 분말을 주변 공기 또는 산화 환원에 민감한 경우 글로브 박스에서 무게를 측정하십시오. 여기서, 고체 Fe II 기준물질(FeII-아세테이트 및 비비아나이트)은 기체N2 글로브 박스에서 제조되었고, Fe III(Fe(OH)3 및 FeIII-포스페이트)는 주변 공기에서 제조되었다.
- 고순도 질화 붕소 분말을 계량하고 연구 된 원소의 최종 농도가 1 % wt에 도달하기 위해 모델 화합물 분말과 혼합하십시오 (그림 7A).
- 모르타르를 사용하여 미세 분말로 분쇄하여 적어도 15 분 동안 분쇄하십시오.
- 분말 혼합물을 땜납에 넣고 유압 프레스로 펠렛을 제조하였다 (도 7B, 샘플 펠릿에 대한 도 3A 와 유사함).
- 몰더를 피스톤으로 닫습니다(그림 7C, 샘플 펠릿에 대한 그림 3B 와 유사).
- 프레스하여 벌크 펠릿을 얻었다(도 7D, 샘플 펠릿에 대한 도 3C 와 유사함).
- 준비된 벌크 펠릿이 샘플과 동일한 조건에서 분석될 때까지 글로브 박스에 보관한다.
참고: 벌크 펠릿은 예를 들어 분말 호환성에 따라 피스톤에 달라붙는 경우가 있습니다. 그것을 깨뜨리지 않고 부드럽게 제거하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 경우, 폴리이미드(예를 들어, Kapton) 디스크를 사용하는 다음의 절차가 사용되어야 한다. - 분말과 접촉할 피스톤의 양쪽에 에탄올 한 방울을 놓는다(그림 8A).
- 피스톤보다 직경이 약간 작은 폴리이미드 디스크 두 개를 준비합니다. 폴리이미드 두께는 10-25 μm가되어야합니다 (얇을수록 조작하기가 어렵고 두꺼울수록 분석 중에 X 선 광자를 너무 많이 흡수합니다).
- 디스크를 피스톤에 놓습니다. 그들은 모세관 작용에 의해 달라 붙을 것입니다 (그림 8B).
- 땜납을 피스톤으로 장착하고 분말을 넣은 다음 두 번째 피스톤에 넣습니다(그림 8C).
- 프레스(단계 3.11 참조)하고 압축된 벌크 펠릿을 피스톤으로부터 제거한다.
참고: 솔리드 레퍼런스는 샘플과 같은 cryostat 특정 샘플 홀더에 장착할 수 있습니다(1.8.6단계 참조). 액체 기준은 cryostat-specific 샘플 홀더 상에 장착될 수 있다. CRG-FAME cryostat 샘플 홀더에 대해서는 도 9A 를 참조한다. 다음 절차를 사용하여 도 4D에 도시된 CRG-FAME-UHD 샘플 홀더를 사용하여 동일한 절차를 적용할 수 있다. - 냉동 시료 홀더에 액체 기준의 장착.
- 샘플 홀더 상의 구멍의 한쪽 면을 RT로 밀봉하기 위해 폴리이미드(예를 들어, Kapton) 테이프(두께 25 μm)를 설정한다(그림 9B).
- 주사기를 사용하여 용액이 상단에 도달 할 때까지 용액으로 캐비티를 천천히 채 웁니다. 거품을 피하십시오. 저장소를 채워야 합니다(그림 9C, 왼쪽).
- 캐비티의 반대쪽을 테이프로 밀봉합니다(그림 9C, 오른쪽).
- 밀봉된 샘플 홀더를 LN2 에 급락시킵니다(그림 9D,T0–T3).
- 열 반응은 LN2 버블링을 유도한다. 버블링이 멈출 때까지 기다렸다가 반응의 끝을 알린다(그림 9D,T3–T5).
- 데이터 수집을 시작하기 전에 77K의 샘플 홀더를 빔라인의 냉동 장치로 옮기거나(그림 9D,T6) LN2 Dewar에 저장합니다.
참고: 동결된 용액은 공동에 잘 퍼지고 균일하고 균일한 펠릿을 형성한다(도 9D,T7).
4. HERFD-XAS : 측정 절차
- 관심있는 형광 라인 에너지에 대하여 브래그 조건에서 CAS로부터의 모든 결정을 최적화한다. 이 절차는 농축 된 참조 화합물로 수행 할 수 있습니다.
- 흡수 에지의 에너지 위치가 공지되어 있는 기준(전형적으로 순수한 금속 호일)을 사용하여 입사 단색 빔 에너지를 교정한다. 이 기준은 샘플 후 두 번째 단계, 이중 전송 모드에서 위치될 수 있으며, 이는 획득된 각 스펙트럼에 대한 캘리브레이션을 검사하고 결국 처리 후 정렬할 수 있도록 하기 위함이다.
- 샘플을 생물학적 샘플용 액체 헬륨 냉동 장치에 위치시키고, 단계 1.9.6에 기술된 적절한 절차에 따라 한다.
- 싱크로트론 안전 규칙에 따라 실험 허치를 닫습니다.
- 선택한 흡수 에지를 커버하는 에너지 범위에서 XAS 획득을 수행합니다.
- 각 스펙트럼 획득 후, 새로운 획득을 시작하기 전에 빔 크기를 움직임의 방향으로 적어도 두 배 이상 샘플을 이동시킨다.
참고: 이 경우 측정은 Ge(440) 결정을 사용하여 FeKa1 라인을 선택하고 Ge(844) 결정을 사용하여Se Ka1 라인을 선택했습니다. 샘플의 빔 크기는 200 x 100 μm² (H x V 전폭 절반 최대)이었다. 각각의 획득 사이의 샘플 모션은 양방향으로 500 μm이었고, 구조적 균질성을 조사하고 매번 이전의 가능한 방사선 손상으로부터 자유로운 새로운 영역을 분석하기 위해서였다. 개별 스펙트럼은 잡음 내에서 중첩 가능한 경우 비교되고 병합됩니다. 병합된 스펙트럼의 품질이 정확할 때 주어진 샘플에 대한 측정이 중지됩니다. 그런 다음 데이터 분석은 XAS 분석 전용 소프트웨어, 특히 정규화 된 스펙트럼의 선형 조합 피팅을 허용하는 소프트웨어, 예를 들어 Athena 및 Artemis (Demeter 소프트웨어 그룹)15, SixPack 16 또는 Viper17을 사용하여 수행 할 수 있습니다. XAS 분석에 대한 완전하고 상세한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어나며, 최근 논문(18,19)에서 찾을 수 있으며, 그 중 일부는 생물학적 샘플(20)에 보다 구체적으로 전념한다. 셀레늄 XANES 기준 스펙트럼은 이미 SSHADE 스펙트럼 데이터베이스(21)에 수집되어 있다.
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Representative Results
이 제제의 주요 목적은 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)와 암세포 간의 상호 작용, 그리고 식물성 플랑크톤에서의 철 결합 및 격리를 조사하는 것이 었습니다.
초기 상태(BSA Se-NPs) 및 영양 배지에서 배양된 세포(BSA Se-NPs)에서의 셀레늄의 HERFD-XANES 스펙트럼(24시간 배양 후 BSA Se-NPs)은 도 10에 나타내었다. 결과는 초기 Se-NPs의 셀레늄이 Se(0)와 셀레나이트-유사 형태로 모두 존재하는 반면, PC-3 세포와의 상호작용 후 세포의 셀레늄은 주로 Se(0)으로 존재하여 세포에서 셀레늄 종의 변화를 입증하였다. 철의 경우, 참조의 HERFD-XANES 스펙트럼은 철 산화 상태에 따라 뚜렷한 엣지 위치를 보였으며, 감소된 철 종은 낮은 에너지 값으로 이동했습니다(그림 11). 규조류 펠릿의 동일한 위치에 수집된 두 개의 연속적인 스펙트럼은 유사했으며, 이는 10K에서 He-cryostat를 사용할 때 두 번의 획득 사이에 빔 손상이 제한되었음을 나타냅니다. 또한, 규조 펠릿의 상이한 위치들로부터의 스펙트럼들(여기서의 세 위치들)은 동일하여, 샘플 펠릿이 균질하고, 스펙트럼들이 더 나은 신호-대-잡음비 스펙트럼(averaged spectrum)을 얻기 위해 평균화될 수 있다는 것을 입증하였다. 규조류에 대한 평균 스펙트럼은 주로 Fe(III)에 해당하는 에지 특징을 보여줍니다. 이어서, 기준 스펙트럼의 선형 조합 피팅을 수행하여 Sarret et al.6에 기재된 바와 같이 철 종의 비율을 정량화하였다.
그림 1: 전형적인 세포 펠릿. 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 (OVCAR-3 세포 왼쪽, PC-3 세포 오른쪽)는 각각 8 x 106 세포 및 1 x 107 세포를 함유한다. 크레디트 : 캐롤라인 비사르돈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 혐기성 글로브 박스에서의 제조. (A) 액체LN2에 완전히 침지된 (B) 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 랙(파란색)을 함유하는 혐기성 글로브 박스. 액체LN2는 명확성을 위해 그림에 제시되지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 세포 펠릿화의 스키마. (A) 로딩하기 전에 프레스에 샘플 펠릿. (B) 적재 중 샘플. (C) 로딩 후 벌크 펠릿 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 냉동 샘플의 장착. ESRF에서 BM16 XAS 빔라인에 특화된 샘플 홀더에 장착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 참조 용액의 무산소 제조. Schlenk 풍선에 저장된 셀레늄 참조 제제의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 참조 솔루션의 무산소 준비를 위한 설정. 오른쪽의 병에 탈기 된 초순수가있는 Schlenk 경사로를 설치했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 고체 기준 펠릿에서의 제조. 주변 공기 또는 글로브 박스 아래에서 분말 화합물에 대한 프레스 된 원통형 펠릿의 제조. (A) 기준 분말의 중량. (B) 프레스 지지체의 원통형 구멍에 있는 분말. (C) 폐쇄 프레스 지원. (D) 압착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 폴리이미드 디스크를 이용한 고체 기준 펠릿의 제조. 끈적임 또는 취성 분말 화합물을 위한 압착된 원통형 펠릿의 제조. (A) 분말과 접촉 할 피스톤의 양쪽에 에탄올 한 방울을 떨어 뜨리면 피스톤의 폴리이미드 디스크가 그 (B)에 달라 붙을 수 있습니다. 땜납은 피스톤과 함께 장착됩니다. 이어서, 분말이 증착될 수 있고, 몰더는 두 번째 피스톤(C)으로 폐쇄될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: 액체 기준 또는 샘플에 대한 냉동 샘플 홀더에 대한 준비 단계. 사진 선명도를 위해 글러브 박스 밖에서 유해 물질없이 사진을 찍었습니다. 여기서는ddH2O물을 사용했습니다. 필요한 경우,이 준비는 글로브 박스 또는 불활성 분위기 (N2) 플라스틱 텐트 하에서 이루어질 수 있습니다. (A) 샘플 홀더. (B) 폴리이미드 테이프를 곡면에 올려 구멍을 밀봉합니다. (c) 공동이 채워질 때까지 주사기를 이용하여 기준 용액을 방울씩 천천히 주입한다. 기포가 남아 있으면 안됩니다. 다른 구멍을 폴리이미드 테이프로 밀봉하십시오. (D) LN 2에 급락. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: Se K-edge 전형적인 HERFD-XANES 분석. BSA 코팅된 Se-NPs의 Se K-edge HERFD-XANES는, 세포 배양 배지에서 24시간 동안 방치하고, PC-3 세포를 BSA 코팅된 Se-NPs에 노출시켰다. 스펙트럼은 명확성을 위해 이동됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: Fe K-edge 전형적인 HERFD-XANES 분석. 플랑크톤에서의 철 종분화에 대한 우리의 실험 동안 수집된 스펙트럼의 예. 여섯 개의 상부 스펙트럼은 기준/표준에 해당합니다. 중첩된 스펙트럼(적색 및 검은색)은 펠릿의 동일한 위치에 수집된 두 개의 스펙트럼에 대응한다. pos#1, pos#2 및 pos#3으로 라벨링된 스펙트럼을 샘플 펠릿의 세 가지 상이한 위치에서 수집하였다. Diatoms Average라고 불리는 스펙트럼은 펠릿의 다양한 위치에서 수집 된 평균 스펙트럼에 해당하며 종분화를 결정해야하는 샘플입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 제품 | PC3 세포주 | OVCAR3 세포주 |
| ATCC 변형 RPMI 1640 배지 | 445 mL | 394.5 mL |
| 태아 소 혈청 | 50 mL | 100 mL |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 5 mL | 5 mL |
| 소 인슐린 | - | 500 μL |
표 1. 세포 배양 배지 제제. 이 세포는 PC-3 전립선암 세포에 대해 10%의 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 보충된 ATCC(American Type Culture Collection) 변형 RPMI 1640 배지에서 배양되며, OVCAR-3 난소암 세포에 대해 FBS 20%와 페니실린-스트렙토마이신 1% 및 소 인슐린 0.01mg/mL로 배양됩니다.
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Discussion
이 프로토콜은 X선 흡수 분광법에 의해 생물학적 샘플에서 셀레늄과 철의 화학적 형태를 연구하는데 사용되었다. 생물학적 샘플 및 참조 화합물의 냉동 준비 및 저장뿐만 아니라 HERFD-XAS 측정에 중점을 둡니다.
Cryo-preparation and storage
벌크 생물학적 샘플 펠릿의 동결-준비는 샘플에 존재하는 종의 화학적 완전성의 보존을 허용한다. 이는 제제6을 위해 동결건조 또는 공기건조를 사용할 때 종분화 변화가 관찰되었기 때문에 매우 중요하다. 이 프로토콜은 측정을 위해 선택된 빔라인에 헬륨 냉동 스탯이 장착되는 즉시 사용해야 합니다.
참조 화합물의 경우, 산화 상태를 보존하기 위해 산화 환원 민감성 요소를 사용할 때 무산소 분위기에서 작업해야합니다. 그런 다음 철 및 철 기준 화합물에 대해 표시된 바와 같이 스펙트럼 에지 위치의 변화로 확인할 수 있습니다 (그림 11).
이러한 샘플 준비는 싱크로트론 또는 실험실 분석 전에 수행될 수 있다. 이 경우, 동결된 펠릿 또는 기준물은 냉동 튜브로 이송되어 LN2 탱크에 저장되어야 한다. 이 LN2 저장소는 보호 불활성 환경을 제공하고 화학 종, 특히 반응성 철 또는 셀레노 화합물의 변화를 피하기 위해 필수적입니다. 바람직하게, 샘플은 측정 직전에 준비되거나 분석 며칠 전에 저장되어야 한다. 샘플을 오랜 기간 (즉, 수개월) 동안 저장하지 않는 것이 가장 좋습니다.
냉동 분석
저온에서의 분석, 이상적으로는 10K에서 강렬한 X선 빔에 의해 유발되는 손상, 특히 단백질 매트릭스를 손상시키고 전이 금속 이온의 광환원 또는 황22와 같은 원소의 광환원을 일으킬 수있는 물의 가수분해로 인한 자유 라디칼의 형성을 늦추기 위해 매우 옹호됩니다. XAS 스펙트럼의 빠른 수집을 통해 화학 종의 이러한 가능한 변화를 고려하는 것이 가장 좋습니다. 또한 샘플을 스캔하여 각 스펙트럼에 대해 조사되지 않은 영역을 노출시켜야 합니다. 식물성 플랑크톤 펠릿의 세 가지 다른 위치에 수집 된 스펙트럼에 의해 입증 된 바와 같이 (그림 11), 이러한 전략은 강력한 스펙트럼을 보여 주며, 이는 더 나은 신호 대 잡음비를 얻기 위해 평균화 될 수 있습니다.
향후 응용 프로그램
우리의 작업에서 우리는 HERFD-XAS 측정 전용 빔 라인 (FAME-UHD, ESRF, France)을 사용했지만 생물학적 샘플 준비를위한이 프로토콜은 다중 요소 Ge 고체 검출기 또는 실리콘 드리프트 검출기와 같은 다른 유형의 검출기를 사용하면서 냉동 장치가 장착 된 모든 표준 XAS 빔 라인에 적용 할 수 있습니다. 제안 된 워크 플로우는 다른 화학 원소 또는 X 선 흡수 분광법에 의해 연구 될 것으로 예상되는 생물학적 물질에도 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 CEMHTI (Orleans, France, ANR-13-BS08-0012-01) 및 Labex OSUG@2020 (Grenoble, France, ANR-10-LABX-0056)의 빔 라인 개발에 재정적 기여에 감사드립니다. FAME-UHD 프로젝트는 프랑스 "그랜드 엠프런트"EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG 컨소시엄 및 INSU CNRS 연구소가 재정적으로 지원합니다. 우리는 실험 중 특히 BM30B 및 BM16에서 일하는 모든 사람들에게 모든 기여에 감사드립니다. 저자들은 싱크로트론 방사선 빔타임의 제공을 위해 유럽 싱크로트론 방사선 시설을 인정한다. 우리는 또한 재정 지원을위한 PHYTOMET ANR 프로젝트 (ANR-16-CE01-0008) 및 재정 지원을위한 SEDMAC 프로젝트 (INCA-Plan cancer-ASC16019CS)를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
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