고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

Summary

이 프로토콜은 싱크로트론 기반 X선 흡수 분광법 실험을 위한 생물학적 냉동 샘플을 준비하기 위한 상세한 절차를 제시합니다. 우리는 암 및 식물성 플랑크톤 세포를 사용한 프로토콜의 예를 통해 샘플 준비 및 냉동 보존을 최적화하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 방법은 샘플 냉동 준비의 보편적 인 표준을 제공합니다.

Abstract

X 선 흡수 분광법 (XAS)을 가진 원소에 대한 연구는 생물학적 시스템에서 금속의 역할을 연구 할 때 특히 중요합니다. 샘플 준비는 특히 생물학적 샘플의 경우 중요하고 종종 복잡한 절차입니다. X선 종분화 기술이 널리 사용되고 있지만, 이 기술의 사용자를 위한 상세한 프로토콜은 아직 보급되지 않았다. 또한, 화학적 상태 변형이 우려되며, 냉동 기반 기술은 세포 또는 조직의 화학적 완전성의 최대 보존을 제공하기 위해 그들의 거의 자연적인 수화 상태에서 생물학적 샘플을 분석하는 것이 좋습니다. 여기에서, 우리는 냉동 보존 샘플에 기초한 세포 준비 프로토콜을 제안한다. 그것은 암세포에서 셀레늄에 대한 높은 에너지 분해능 형광 검출 X 선 흡수 분광법 연구와 식물성 플랑크톤의 철분 연구에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 조사에 의해 손상될 수 있는 다른 생물학적 샘플 및 다른 X선 기술과 함께 사용될 수 있다.

Introduction

필수 또는 독성 요소의 세포 생물 변환에 대한 연구는 높은 감도의 종분화 기술을 필요로하며 종종 화학 종의 변형되기 쉬운 샘플 준비 단계를 최소화해야합니다.

셀레늄 및 철과 같은 생리 원소는 복잡한 화학, 셀레늄 또는 철 종의 다양한 안정성, ppm (mg / kg) 또는 심지어 ppm 이하 범위의 낮은 농도로 인해 지정하기가 특히 어려운 것으로 알려져 있습니다. 따라서 XAS에 의한 이러한 요소의 종분화에 대한 연구는 매우 어려울 수 있습니다. 싱크로트론 XAS 및 특히 매우 낮은 신호 대 배경 비율¹을 허용하는 고에너지 분해능 형광 검출 XAS (HERFD-XAS)는 싱크로트론 소스에서 복잡한 생물학적 매트릭스 ^2,3에서 고도로 희석된 원소를 지정하기 위해 사용할 수 있다. 기존의 형광-XAS 측정은 유럽 싱크로트론 방사 시설(ESRF)⁴의 CRG-FAME 빔라인에서 에너지 대역폭이 150–250eV에 달하는 에너지 분해 고체 상태 검출기(SSD)를 사용하여 수행할 수 있으며, HERFD-XAS 측정에는 ESRF²의 CRG-FAME-UHD 빔라인에서 에너지 대역폭이 ~1–3eV인 크리스탈 분석기 분광계(CAS)가 필요합니다. . 형광 광자는 각각 전자 또는 광학 공정으로 에너지에 대해 차별됩니다.

샘플 냉동 준비는 구조를 보존하고 조성 화학적 완전성을 유지하는 데 필수적이며, 따라서 생물학적 자연 상태에 가까운 분석을 허용합니다⁵. 또한 액체 헬륨 극저온 냉각(LN₂)을 사용하여 최저 10K의 극저온에서 수행된 분석을 통해 방사선 손상이 느려지고 XAS의 원소 종분화를 보존할 수 있습니다. 생물학적 샘플에 적용된 XAS 기술에 대한 일부 리뷰가 극저온 조건에서 샘플을 준비하고 분석 할 필요성을보고하지만 (예 : Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), 이들 중 어느 것도 관련 세부 프로토콜을 명확하게 설명하지 않습니다. 이 간행물에서, 암 세포 및 플랑크톤 미생물의 냉동-제조 방법이 극저온에서^Se8 및^Fe9 의 HERFD-XAS 종분화에 대해 기술되어 있다.

최첨단 XAS 분광법 측정 중 샘플 준비 및 환경에 대한 좋은 관행은 1) 설정이 필요합니다. 2) 방사선 손상의 영향을 가능한 한 제한하는 분석 절차; 및 3) X선 광자 빔 크기에 대하여 가능한 한 균질한 샘플(또는 모델 화합물 참조)을 포함한다. 첫 번째 항목은 액체 헬륨 냉동 스탯을 사용하여 저온에서 수집을 수행하여 고려됩니다. 두 번째 항목은 빔에 대해 이동함으로써 샘플의 새로운 영역에서 각 획득을 수행함으로써 처리됩니다. 마지막으로, 세 번째 조건을 고려하여, 샘플(펠릿) 및 참조(분말)는 가능한 한 다공성 및 불균질성을 제한하고, X선 프로브된 샘플 표면 상의 빔 크기에 대하여 거칠기를 피하기 위해 가압된 벌크 펠릿으로 조절된다. 우리는 프로토콜이 이러한 모든 점을 어떻게 처리하는지 설명합니다.

우리는 인간 전립선 세포주 PC-3 (높은 전이성 전위)와 난소 세포주 OVCAR-3 (모든 난소 암 사례의 최대 70 %를 차지함)을 사용하여 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)의 암세포에 대한 항 증식 특성을 조사하고 Phaeodactylum tricornutum diatom을 모델 종으로 사용하여 식물성 플랑크톤의 철 격리를 조사했습니다.

Protocol

1. 셀레늄 종분화를 위한 인간 PC-3 및 OVCAR-3 암세포 펠렛의 제조 참고: 다음 프로토콜은 Weekley et al.10에서 채택되었습니다. 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 레벨 2 조건 및 제한 하에서 세포 배양 후드 하에서 수행되어야합니다. Malassez 셀 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수하십시오. PC-3 세포주를 위해 플라스크 당 150,000-200,000 세포를 시?…

Representative Results

이 제제의 주요 목적은 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)와 암세포 간의 상호 작용, 그리고 식물성 플랑크톤에서의 철 결합 및 격리를 조사하는 것이 었습니다. 초기 상태(BSA Se-NPs) 및 영양 배지에서 배양된 세포(BSA Se-NPs)에서의 셀레늄의 HERFD-XANES 스펙트럼(24시간 배양 후 BSA Se-NPs)은 도 10에 나타내었다. 결과는 초기 Se-NPs의 셀레늄이 Se(0)와 셀레나이트-유사 형태?…

Discussion

이 프로토콜은 X선 흡수 분광법에 의해 생물학적 샘플에서 셀레늄과 철의 화학적 형태를 연구하는데 사용되었다. 생물학적 샘플 및 참조 화합물의 냉동 준비 및 저장뿐만 아니라 HERFD-XAS 측정에 중점을 둡니다.

Cryo-preparation and storage
벌크 생물학적 샘플 펠릿의 동결-준비는 샘플에 존재하는 종의 화학적 완전성의 보존을 허용한다. 이는 제제⁶을…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C