Summary

Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

Published: May 27, 2022
doi:

Summary

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Abstract

O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.

Introduction

O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.

Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa1, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas 2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF2 . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.

A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico5. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN2), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se8 e Fe9 à temperatura criogênica.

Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.

Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.

Protocol

1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas. Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celu…

Representative Results

Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton. Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se…

Discussion

Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.

Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é cr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo “grande emprunt” francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01-0008) e o projeto SEDMAC para apoio financeiro (INCA-Plan câncer-ASC16019CS).

Materials

Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

References

  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
  9. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  10. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  11. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  12. SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
  13. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  14. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  15. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
  16. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  17. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  18. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  19. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  20. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
  21. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bissardon, C., Isaure, M., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

View Video