Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

Summary

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Abstract

O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.

Introduction

O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.

Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa¹, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas ^2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF² . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.

A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico⁵. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN₂), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se⁸ e Fe⁹ à temperatura criogênica.

Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.

Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.

Protocol

1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas. Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celu…

Representative Results

Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton. Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se…

Discussion

Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.

Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é cr…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C